CN107973754A - 一种小分子抑制剂及其制备方法与其在多发性骨髓瘤治疗中的应用 - Google Patents

一种小分子抑制剂及其制备方法与其在多发性骨髓瘤治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小分子抑制剂及其制备方法与其在多发性骨髓瘤治疗中的应用。本发明小分子抑制剂的结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示，本发明也提供了所述小分子抑制剂的制备方法。本发明小分子抑制剂能够抑制布鲁顿酪氨酸蛋白激酶的活性，因此能够应用于多发性骨髓瘤的治疗中，如IgE型多发性骨髓瘤。

Description

一种小分子抑制剂及其制备方法与其在多发性骨髓瘤治疗中 的应用
技术领域
本发明涉及一种小分子抑制剂及其制备方法与其在多发性骨髓瘤治疗中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)，是比较常见的一种血液***癌症，占肿瘤发病人数的1％。目前认为多发性骨髓瘤是不能被治愈的，如果不进行治疗生存期为7个月；如果积极地进行治疗，5年生存率为49％。对于多发性骨髓瘤的药物治疗方案主要集中于蛋白酶抑制剂、***、免疫调节剂等联合用药。硼替佐米是首个可口服的蛋白酶抑制剂，2003年被美国FDA批准治疗多发性骨髓瘤。
BTK(Bruton’s Tyrosine Kinase)即布鲁顿酪氨酸蛋白激酶，是非受体酪氨酸激酶 Tec家族的成员。在前B淋巴细胞过渡为后期B细胞过程中，BTK为细胞分化和增值所必需基因，且在B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)和浆细胞瘤中均有表达。但是仍没有关于靶向小分子抑制剂和相关药理研究。直到2006年之后，研究者发现磷酸化激活BTK为B细胞受体(BCR)信号通路的关键组成部分，是靶向治疗B 细胞淋巴瘤等疾病的很好位点。
Ibrutinib(依鲁替尼，PCI 32765，商品名：Imbruvica)，由美国Pharmacyclicsinc 研发，于2013年11月被FDA批准用于治疗既往接受至少1次治疗的套细胞淋巴瘤(MCL)，2014年2月又批准用于既往至少接受过一种药物治疗的CLL。其作用机理是通过丙烯酰胺的双键与BTK蛋白481位半胱氨酸残基的巯基进行共价交联，进而不可逆地抑制BTK的生物活性。
Spebrutinib(cc-292)是一个通过共价结合的，可以口服，并且具有高度选择性的BTK抑制剂，它的作用位点与ibrutinib相同，其IC50小于0.5nM，展示了比其他被测激酶至少1400倍的选择性。它对于慢性淋巴细胞白血病的治疗正处在临床I期的阶段，而对于类风湿性关节炎的治疗已经进入了临床II期阶段。
BTK共价抑制剂联合硼替佐米以及***联合用药治疗多发性骨髓瘤已经进入临床二期。依鲁替尼联合泊马度胺以及***治疗多发性骨髓瘤也已经进入临床二期阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种小分子抑制剂及其在制备抗多发性骨髓瘤中的应用，本发明提供的小分子抑制剂的结构异于现有的抑制剂分子，其在分子和细胞水平都展现出不错的活性。
本发明提供的一种小分子抑制剂的结构式如式Ⅰ所示，
式Ⅰ中，R1为甲基或甲氧基。
式Ⅰ所示抑制剂具体可为式Ⅰ-1或式Ⅰ-2所示化合物，
本发明提供了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式1所示化合物与式2所示化合物经缩合反应即得式Ⅰ所示化合物；
式1、式2和式Ⅰ中，R1为甲基或甲氧基。
上述的制备方法中，式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比可为1：1～2，具体可为1：1.1；
所述缩合反应的温度可为20℃～25℃，具体可为25℃，所述缩合反应的时间可为1～5小时，具体可为1小时。
上述的制备方法中，所述缩合反应在2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或N,N-二异丙基乙胺(DIEA) 的催化下进行。
本发明提供的另一种小分子抑制剂的结构式如式Ⅱ所示，
式Ⅱ，R1为甲基或甲氧基；R2为H或碳原子数为1～3的烷基。
式Ⅱ所示抑制剂具体可为式Ⅱ-1、式Ⅱ-2、式Ⅱ-3或式Ⅱ-4所示化合物，
本发明提供的式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式Ⅰ所示化合物与式3所示化合物经缩合反应即得式Ⅱ所示化合物；
式Ⅰ和式Ⅱ中，R1为甲基或甲氧基；
式3和式Ⅱ中，R2为H或碳原子数为1～3的烷基。
上述的制备方法中，式Ⅰ所示化合物与式3所示化合物的摩尔比可为1：1～5，具体可为1：3.5；
所述缩合反应的温度为60～70℃，所述缩合反应的时间为2～4小时。
上述的制备方法中，所述缩合反应在过量的醋酸钾或醋酸钠的条件下进行。
本发明提供的再一种小分子抑制剂的结构式如式Ⅲ所示，
式Ⅲ中，R3为苯环、取代苯环、杂环或式4所述基团，所述杂环的结构式如式5 所示，所述取代苯环为二取代苯环、三取代苯环或五取代苯环，所述取代苯环中的取代基为氟。
式Ⅲ所示抑制剂具体可为式Ⅲ-1、式Ⅲ-2、式Ⅲ-3、式Ⅲ-4或式Ⅲ-5所示化合物，
本发明提供的式Ⅲ所示化合物的制备方法，包括如下(1)或(2)或(3)的步骤：
(1)当R3为苯环或取代苯环时，包括如下步骤：
式1所示化合物与式6所示化合物经缩合反应即得式Ⅲ所示化合物；
式1所示化合物与式6所示化合物的摩尔比为1：1～2，具体可为1：1.1；
所述缩合反应的温度为20℃～25℃，具体可为25℃，所述缩合反应的时间可为1～5 小时，具体可为1小时。
式6和式Ⅲ中，R3为苯环或取代苯环，所述取代苯环为二取代苯环、三取代苯环或五取代苯环，所述取代苯环中的取代基为氟；
(2)当R3为式4所述基团时，包括如下步骤：
式1所示化合物与式7所示化合物经缩合反应即得式Ⅲ所示化合物；
式1所示化合物与式7所示化合物的摩尔比可为1：1～2，具体可为1：1.2；
所述缩合反应的温度可为0℃～5℃，具体可为0℃，所述缩合反应的时间为1～5小时，具体可为1小时。
式Ⅲ中，R3为式4所示基团；
(3)当R3为式5所示杂环时，包括如下步骤：
式8所述化合物与式9所示化合物经环加成反应即得式Ⅲ所示化合物；
式Ⅲ中，R3为式5所示基团。
式8所示化合物与式9所示化合物的摩尔比可为1：1～2，具体可为1：1；
所述反应的温度为0～25℃，所述反应的时间为1～5小时。
本发明提供的第4种小分子抑制剂的结构式如式Ⅳ所示，
本发明提供的式Ⅳ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式1所示化合物与顺丁烯二酸酐经缩合反应即得式Ⅳ所示化合物；
上述的制备方法中，式1所示化合物与顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：1～2，具体可为1：1；
所述缩合反应的温度为20℃～25℃，具体可为25℃，所述缩合反应的时间为10～18 小时，具体可为18小时。
本发明提供的式Ⅰ所示化合物、式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物或式Ⅳ所示化合物能够抑制布鲁顿酪氨酸蛋白激酶的活性，因此能够应用于多发性骨髓瘤的治疗中，如IgE型多发性骨髓瘤。
附图说明:
图1为本发明化合物在RPMI8226、IgE MM多发性骨髓瘤细胞系和293F细胞系的细胞毒性实验结果示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、式Ⅱ-1所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取26mg乙酰丙烯酸、84mg HATU、30mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入 1.6mlDCM、0.4ml DMF和66微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入74mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM： MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到53mg中间体A2，产率为57％。
称取47mg中间体A2、30mg盐酸甲氧胺、45mg醋酸钾于25ml圆底烧瓶中，加入1ml乙醇和1ml水作为溶剂，70℃回流3小时，冷却至室温，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到20mg式Ⅱ-1所示化合物，产率为40％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.36(s,1H),10.26(s,2H),9.39-9.38(m,3H),8.97(s,3H),8.07-8.06(m,3H),7.96-7.94(m,3H),7.67(d,J＝15.6Hz,1H),7.54-7.50(m,9H),7.44-7.40(m,3H),7.31-7.26(m,3H),7.08(d,J＝15.6Hz,2H),6.75(d,J＝8.4Hz,6H),6.67-6.62(m,3H),3.97(t,J＝4.4Hz,6H),3.92(s,6H),3.86(s,3H),3.60(t,J＝4.4Hz,6H),3.29(s,9H),2.03(s,3H),1.98(s,6H)。
LC-MS:calcd for C25H27FN6O4[M+H]+:495.21,found 495.09。
实施例2、式Ⅱ-2所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取26mg乙酰丙烯酸、84mg HATU、30mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入 1.6mlDCM、0.4ml DMF和66微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入74mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM： MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到53mg中间体A2，产率为57％。
称取47mg中间体A2、25mg盐酸羟胺、45mg醋酸钾于25ml圆底烧瓶中，加入1ml乙醇和1ml水作为溶剂，70℃回流3小时，冷却至室温，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到20mg式Ⅱ-2所示化合物，产率为42％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):11.76(s,1H),10.22(s,1H),9.37(s,1H),8.97(s,1H),8.07-8.06(m,1H),7.95(s,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.43(d,J＝7.6Hz,1H),7.29(t,J＝8.0Hz,1H),7.15(d,J＝15.6Hz,1H),6.75(d,J＝9.2Hz,2H),6.57(d,J＝15.6Hz,1H),3.97(t,J＝4.4Hz,2H),3.60(t,J＝4.4Hz,2H),3.29(s, 3H),1.97(s,3H)。
LC-MS:calcd for C24H25FN6O4[M+H]+:481.19,found 481.10。
实施例3、式Ⅱ-3所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取26mg乙酰丙烯酸、84mg HATU、30mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入 1.6mlDCM、0.4ml DMF和66微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入74mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM： MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到53mg中间体A2，产率为57％。
称取47mg中间体A2、34mg盐酸乙氧胺、45mg醋酸钾于25ml圆底烧瓶中，加入1ml乙醇和1ml水作为溶剂，70℃回流3小时，冷却至室温，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到37mg式Ⅱ-3所示化合物，产率为73％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.36(s,0.2H),10.25(s,1H),9.38(s,1.2H),8.97(s,1.2H),8.07-8.06(m,1.2H),7.96-7.93(m,1.2H),7.69(d,J＝16.0Hz,0.2H),7.54-7.40(m,4.8H),7.30-7.26(m,1.2H),7.10(d,J＝16.0Hz,1H),6.75(d,J＝8.4Hz,2.4H),6.66-6.60(m,1.2H),4.21-4.11(m,2.4H),3.97(t,J＝4.4Hz,2.4H),3.59(t,J＝4.4Hz,2.4H),3.29(s,3.6H),2.03-1.99(m,3.6H),1.26-1.23(m,3.6H)。
LC-MS:calcd for C26H29FN6O4[M+H]+:509.22,found 509.13。
实施例4、式Ⅱ-4所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取26mg乙酰丙烯酸、84mg HATU、30mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入 1.6mlDCM、0.4ml DMF和66微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入74mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM： MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到53mg中间体A2，产率为57％。
称取47mg中间体A2、39mg盐酸异丙氧胺、45mg醋酸钾于25ml圆底烧瓶中，加入1ml乙醇和1ml水作为溶剂，70℃回流3小时，冷却至室温，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到21mg式Ⅱ-4所示化合物，产率为40％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.36(s,0.4H),10.24(s,0.6H),9.38(s,1H),8.97(s,1H),8.06(s,1H),7.96-7.93(m,1H),7.68(d,J＝16.0Hz,0.4H),7.54-7.40(m,4H),7.31-7.26(m,1H),7.10(d,J＝16.0Hz,0.6H),6.74(d,J＝8.8Hz,2H),6.65-6.59(m,1H),4.41-4.29(m,1H),3.96(t,2H),3.59(t,2H),3.29(s,3H),2.03-1.97(m,3H),1.25-1.22(m,6H)。
LC-MS:calcd for C27H31FN6O4[M+H]+:523.24,found 523.12。
实施例5、式Ⅰ-1和式Ⅰ-2所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取26mg乙酰丙烯酸、84mg HATU、30mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入 1.6mlDCM、0.4ml DMF和66微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入74mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM： MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到53mg式Ⅰ-1所示化合物，产率为57％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.54(s,1H),9.43(s,1H),9.00(s,1H),8.07(d,J＝3.6Hz,1H),7.96(s,1H),7.57-7.51(m,3H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.31(t,J＝8.4 Hz,1H),7.08(d,J＝16.0Hz,1H),6.91(d,J＝16.0Hz,1H),6.75(d,J＝8.8Hz,2H),3.97 (t,J＝4.4Hz,2H),3.60(t,J＝4.4Hz,2H),3.29(s,3H),2.36(s,3H)。
LC-MS:calcd for C24H24FN5O4[M+H]+:466.18,found 466.08。
称取29mg富马酸单甲酯、84mg HATU、30mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入1.6mlDCM、0.4ml DMF和66微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入74mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到60mg式Ⅰ-2所示化合物，产率为62％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.55(s,1H),9.41(s,1H),8.98(s,1H),8.07(d,J＝3.6Hz,1H),7.96(s,1H),7.56-7.51(m,3H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.32-7.24(m, 2H),6.76-6.70(m,3H),3.97(t,J＝4.4Hz,2H),3.76(s,3H),3.60(t,J＝4.5Hz,2H),3.29 (s,3H)。
LC-MS:calcd for C24H25FN5O5[M+H]+:482.18,found 482.07。
实施例6、式Ⅲ-1所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取18mg 2,6-二氟苯甲酸、42mg HATU、15mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入0.8mlDCM、0.2ml DMF和33微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入37mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到26mg式Ⅲ-1所示化合物，产率为51％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.80(s,1H),9.43(s,1H),8.97(s,1H),8.07(d,J＝3.6Hz,1H),7.94(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.63-7.52(m,3H),7.39(d,J＝8.2 Hz,1H),7.33(t,J＝8.0Hz,1H),7.25(t,J＝7.9Hz,2H),6.79(d,J＝8.9Hz,2H), 4.02-4.00(m,2H),3.64-3.61(m,2H),3.30(s,3H)。
LC-MS:calcd for C26H22F3N5O3[M+H]+:510.17,found 510.06。
实施例7、式Ⅲ-2所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取20mg 2,4,6-三氟苯甲酸、42mg HATU、15mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入0.8ml DCM、0.2ml DMF和33微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入37mg A1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15mlDCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用 DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到26mg式Ⅲ-2所示化合物，产率为49％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.83(s,1H),9.45(s,1H),9.00(s,1H),8.08(d,J＝3.5Hz,1H),7.96(s,1H),7.71(d,J＝7.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.9Hz,2H),7.41-7.32 (m,4H),6.80(d,J＝8.9Hz,2H),4.01(t,J＝4.2Hz,2H),3.62(t,J＝4.2Hz,2H),3.30(s, 3H)。
LC-MS:calcd for C26H21F4N5O3[M+H]+:528.16,found 528.05。
实施例8、式Ⅲ-3所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取24mg五氟苯甲酸、42mg HATU、15mg HOAT于25ml圆底烧瓶中，加入 0.8mlDCM、0.2ml DMF和33微升DIEA作为溶剂，室温搅拌反应约10分钟后，在反应体系中加入37mgA1中间体，室温搅拌反应约1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM： MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到29mg式Ⅲ-3所示化合物，产率为52％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):11.00(s,1H),9.47(s,1H),9.01(s,1H),8.08(d,J＝3.4Hz,1H),7.96(s,1H),7.75(m,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H),7.38-7.36(m,2H), 6.79(d,J＝8.8Hz,2H),4.01-3.99(m,2H),3.63-3.61(m,2H),3.30(s,3H)。
LC-MS:calcd for C26H19F6N5O3[M+H]+:564.14,found 564.03。
实施例9、式Ⅲ-5所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取58mg KHCO3于10ml圆底烧瓶中，加入2.5ml水溶解，称取98mg A3中间体、46mgA4中间体于25ml圆底烧瓶中，加入2ml DMF作为溶剂，0℃搅拌约 10分钟后，在反应体系中缓慢滴加入上述KHCO3溶液，将反应移至室温搅拌反应约 1小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到39mg外消旋的化合物，产率为31％。
将上述产物溶于甲醇，用Agilent 1260HPLC分离(大赛璐OD-H手性柱：5μm， 10mmΦ×250mmL)，流动相为正己烷/乙醇/二乙胺＝85/15/0.1(v/v/v)。保留时间较短的化合物为一种对映体，保留时间较长的化合物为另一种对映体，分别标记为式Ⅲ-5-1 和式Ⅲ-5-2。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3:CD3OD＝1:1(v/v),ppm):7.95(s,1H),7.79-7.78(m,1H),7.42-7.32(m,4H),7.22(t,J＝8.0Hz,1H),6.79(d,J＝8.1Hz,2H),5.18(t,J＝8.8Hz,1H),4.05(m,2H),3.70(m,2H),3.58(d,J＝9.1Hz,2H),3.40(s,3H)。
LC-MS:calcd for C23H22BrFN6O4[M+H]+:545.09,found 545.02。
实施例10、式Ⅲ-4所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取5.4g 3-吡啶甲醛、12g丙二酸于100ml圆底烧瓶中，加入27g N-甲基吡咯烷酮、0.43g哌啶作为溶剂，78℃搅拌反应约3小时后，加入140ml水，降温至10℃过滤得到白色固体，用10℃135ml水洗涤，得到A4中间体粗品。
称取350mg A3中间体于100ml圆底烧瓶中，加入15ml DCM、15滴DMF作为溶剂，室温搅拌约5分钟后，加入260ul草酰氯，室温搅拌反应约8小时后，旋干溶剂，得到A5中间体粗品。
称取185mg A1中间体于50ml圆底烧瓶中，加入5ml DCM、140微升三乙胺作为溶剂，0℃搅拌约5分钟后，在反应体系中加入101mg A5中间体，0℃搅拌反应约 0.5小时后，加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，然后用15ml DCM萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用DCM：MeOH＝70:1(体积比)过硅胶柱，得到75mg 式Ⅲ-4所示化合物，产率为30％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.29(s,1H),9.41(s,1H),9.00(s,1H),8.83(d,J＝1.2Hz,1H),8.59-8.58(m,1H),8.08(d,J＝3.6Hz,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),8.00 (s,1H),7.64(d,J＝15.6Hz,1H),7.56-7.46(m,5H),7.31(t,J＝8.0Hz,1H),6.98(d,J＝16.0Hz,1H),6.76(d,J＝8.8Hz,2H),3.94(t,J＝4.4Hz,2H),3.52(t,J＝4.4Hz,2H), 3.23(s,3H)。
LC-MS:calcd for C27H25FN6O3[M+H]+:501.20,found 501.09。
实施例11、式Ⅳ所示化合物的制备
反应方程式如下：
称取37mg A1中间体、10mg顺丁烯二酸酐于10ml圆底烧瓶中，加入1ml DCM、作为溶剂，室温搅拌反应约18小时后，过滤得到31mg式Ⅳ所示化合物，产率为66％。
表征数据如下：
1H-NMR(400MHz,(CD3)2SO,ppm):10.71(s,1H),9.41(s,1H),8.96(s,1H),8.06(d,J＝3.6Hz,1H),7.94(s,1H),7.60(d,J＝7.8Hz,1H),7.53(d,J＝8.9Hz,2H),7.35-7.26 (m,2H),6.78(d,J＝8.9Hz,2H),6.44(d,J＝12.2Hz,1H),6.33(d,J＝12.1Hz,1H),4.00 (t,J＝4.3Hz,2H),3.63(t,J＝4.3Hz,2H),3.30(m,4H)。
LC-MS:calcd for C23H22FN5O5[M+H]+:468.16,found 468.08。
实施例12、本发明化合物对细胞增殖的抑制
MTT实验试剂：
试剂：RPIM 1640medium；DMEM medium；100×非必需氨基酸(NEAA)；100×青链霉素混合液；50mMβ巯基乙醇；小牛血清(FBS，事先经过失活处理)。
A培养基(500ml)：RPIM 1640medium(450ml)+100×NEAA(5ml)+100×青链霉素混合液(5ml)+小牛血清(50ml)+50mMβ巯基乙醇(0.5ml)。
B培养基(500ml)：DMEM medium(450ml)+100×NEAA(5ml)+100×青链霉素混合液(5ml)+小牛血清(50ml)。
CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)
MTT实验流程：
1.Ramos cell与HBL-1cell：
1)收集对数期细胞，用A培养基调节细胞悬液浓度2.5×105/ml。
2)用A培养基2倍梯度稀释小分子浓度为40μM至0.3125μM。配置成小分子溶液。
3)将50μL的细胞悬液加入到96孔板(边缘孔用灭菌PBS填充，12500个细胞/孔)。每板设阴性对照(50μL细胞悬液和50μL的A培养基)和空白对照组(100μL 的A培养基)，每组设定3复孔。
4)置37℃，5％CO2孵育6小时后，在96孔板的每个孔中加入50μL对应的小分子溶液。然后再在37℃，5％CO2孵育48小时。体系中，小分子浓度呈2倍梯度稀释，浓度从20uM至0.15625μM。
5)每孔加入10ul cck-8溶液，继续培养3h。直接酶联免疫检测仪OD450nm 测量各孔的吸光值。
2.HeLa cell：
1)收集对数期细胞，用B培养基调节细胞悬液浓度1×105/ml。
2)用B培养基2倍梯度稀释小分子浓度为40μM至0.3125μM。配置成小分子溶液。
3)将50μL的细胞悬液加入到96孔板(边缘孔用灭菌PBS填充，5000个细胞/ 孔)。每板设阴性对照(50μL细胞悬液和50μL的B培养基)和空白对照组(100μL 的B培养基)，每组设定3复孔。
4)置37℃，5％CO2孵育10小时后，在96孔板的每个孔中加入50μL对应的小分子溶液。然后再在37℃，5％CO2孵育60小时。体系中，小分子浓度呈2倍梯度稀释，浓度从20uM至0.15625μM。
5)每孔加入10ul cck-8溶液，继续培养3h。直接酶联免疫检测仪OD450nm测量各孔的吸光值。
通过上述方法测得本发明化合物对细胞增殖抑制结果如表1中所示。
表1本发明化合物对细胞增殖抑制的EC50检测结果
Ramos(nM) HBL1(nM) Hela(nM)
式Ⅱ-1 7590 5690 8310
式Ⅱ-3 8260 2380 9830
式Ⅱ-4 11570 4320 40000
式Ⅲ-5-1 2340 5670 14300
式Ⅲ-5-2 2030 5200 24000
AVL-292 2500 2500 22000
Ibrutinib 11950 10000 38000
HM-71224 10030 9920 38000
由表1中的数据可以看出，在Ramos细胞中，式Ⅲ-5-1和式Ⅲ-5-2化合物活性高于任何一个已知阳性对照化合物；在HBL1细胞中，式Ⅱ-3化合物活性高于任何一个已知阳性对照化合物；在Hela细胞中，式Ⅱ-1和式Ⅱ-3化合物活性高于任何一个已知阳性对照化合物。
3.RPMI8226cell与IgE MM cell：
1)收集对数期细胞，用A培养基调节细胞悬液浓度6.7×104/ml。
2)用A培养基梯度稀释小分子浓度为20μM至100nM。配置成小分子溶液。
3)将45μL的细胞悬液加入到96孔板(边缘孔用灭菌PBS填充，3000个细胞/ 孔)。每板设阴性对照(45μL细胞悬液和45μL的A培养基)每组设定3复孔。
4)在96孔板的每个孔中加入45μL对应的小分子溶液。然后再在37℃，5％CO2孵育72小时。
5)每孔加入10uL cck-8溶液，继续培养4h。直接酶联免疫检测仪OD450nm测量各孔的吸光值。
4.293F cell：
1)收集对数期细胞，用B培养基调节细胞悬液浓度1.3×105/ml。
2)用B培养基梯度稀释小分子浓度为40μM至10μM。配置成小分子溶液。
3)将45μL的细胞悬液加入到96孔板(边缘孔用灭菌PBS填充，6000个细胞/ 孔)。每板设阴性对照(45μL细胞悬液和45μL的B培养基)每组设定3复孔。
4)在96孔板的每个孔中加入45μL对应的小分子溶液。然后再在37℃，5％CO2孵育60小时。
5)每孔加入10uL cck-8溶液，继续培养4h。直接酶联免疫检测仪OD450nm测量各孔的吸光值。
图1为相应化合物在RPMI8226、IgE MM多发性骨髓瘤细胞系和293F细胞系的细胞毒性实验结果示意图，其中，图1(a)和图1(b)的药物分子浓度均为10μM。
由图1可以看出，在RPMI8226和IgE MM细胞中，式I-1和式III-4的杀伤活性最高，高于已知阳性对照化合物，式I-1杀伤IgE MM细胞活性(EC50)在200nm左右；在293F细胞中，式I-1和阳性对照的杀伤能力几乎相当，杀伤活性(EC50)在20 um左右。
实施例13、本发明化合物对BTK激酶的抑制作用
测试本发明化合物对BTK激酶的抑制作用实验，使用了HTRF KinEASE-TK assay。本发明化合物对BTK激酶的IC50值，通过11个浓度梯度的滴定曲线来确定了。所有的测试都在384孔板上进行。在6ul体积里面BTK酶和化合物在室温孵育了 30分钟，之后加了4ul的ATP和底物混合物(在10ul体积的各成分总浓度为0.15ug/ul BTK,50mM HEPES,0.02％NaN,0.01％BSA,0.1mM Orthovanadate,5mM MgCl2,1mM DTT,10.5nM SEB,1uM TK substrate-biotin，28uM ATP)开始反应，在室温孵育了1个小时。反应加包含EDTA的detectionreagensts之后会终止，把5ul Streptavidin-XL665 和5ul TK Antibody-Cryptate加在一起，混合成10ul溶液(在20ul体积里SaXL665的浓度为0.125uM)，加在反应体系中，孵育1个小时。孵育1个小时候通过PerkinElmer EnVision来测了荧光值，在665nm测XL665,在620nm测Cryptate的荧光值。计算化合物抑制率的公式如下
比值＝(665nM/620nM)*10^4
活性＝比值(样品)-比值(阴性对照)
抑制率＝(1-(样品活性/阳性对照活性))*100
所有的IC50都是通过Origin pro进行分析。
经测定，本发明化合物对BTK激酶的抑制作用如表3中所示。
表3本发明化合物对BTK激酶抑制活性IC50检测结果
BTKWT(nM)
式Ⅱ-1 492
式Ⅱ-3 1000
式Ⅱ-4 215
式Ⅲ-5 295
Ibrutinib 0.5
由表3中的数据可以看出，本发明化合物具有良好的IC50值，式Ⅱ-1、式Ⅱ-4和式Ⅲ-5化合物具有nM级的IC50。其中式Ⅱ-4式Ⅲ-5化合物的IC50相对来说低一点。
实施例14、本发明化合物对肝微粒体代谢稳定性的影响
本发明化合物对人肝微粒体代谢稳定性的影响如表4中所示：
表4本发明化合物对人肝微粒体代谢稳定性的影响
由表4中的数据可以看出，式Ⅱ-1和式Ⅱ-3的人肝微粒体代谢稳定性明显优于Ibrutinib。
本发明化合物对大鼠肝微粒体代谢稳定性的影响如表5中所示：
表5本发明化合物对大鼠肝微粒体代谢稳定性的影响
由表5中的数据可以看出，式Ⅱ-1和式Ⅱ-3的大鼠肝微粒体代谢稳定性明显优于Ibrutinib。

Claims (10)

1.式Ⅰ所示化合物，
式Ⅰ中，R1为甲基或甲氧基。
2.式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式1所示化合物与式2所示化合物经缩合反应即得式Ⅰ所示化合物；
式1、式2和式Ⅰ中，R1为甲基或甲氧基。
3.式Ⅱ所示化合物，
式Ⅱ，R1为甲基或甲氧基；R2为H或碳原子数为1～3的烷基。
4.式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式Ⅰ所示化合物与式3所示化合物经缩合反应即得式Ⅱ所示化合物；
式Ⅰ和式Ⅱ中，R1为甲基或甲氧基；
式3和式Ⅱ中，R2为H或碳原子数为1～3的烷基。
5.式Ⅲ所示化合物，
式Ⅲ中，R3为苯环、取代苯环、杂环或式4所述基团，所述杂环的结构式如式5所示，所述取代苯环为二取代苯环、三取代苯环或五取代苯环，所述取代苯环中的取代基为氟。
6.式Ⅲ所示化合物的制备方法，包括如下(1)或(2)或(3)的步骤：
(1)当R3为苯环或取代苯环时，包括如下步骤：
式1所示化合物与式6所示化合物经缩合反应即得式Ⅲ所示化合物；
式6和式Ⅲ中，R3为苯环或取代苯环，所述取代苯环为二取代苯环、三取代苯环或五取代苯环，所述取代苯环中的取代基为氟；
(2)当R3为式4所述基团时，包括如下步骤：
式1所示化合物与式7所示化合物经缩合反应即得式Ⅲ所示化合物；
式Ⅲ中，R3为式4所示基团；
(3)当R3为式5所示杂环时，包括如下步骤：
式8所述化合物与式9所示化合物经环加成反应即得式Ⅲ所示化合物；
式Ⅲ中，R3为式5所示基团。
7.式Ⅳ所示化合物，
8.式Ⅳ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式1所示化合物与顺丁烯二酸酐经缩合反应即得式Ⅳ所示化合物；
9.式Ⅰ所示化合物、式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物或式Ⅳ所示化合物在制备抗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
10.式Ⅰ所示化合物、式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物或式Ⅳ所示化合物在制备布鲁顿酪氨酸蛋白激酶抑制剂中的应用。
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