CN107964506A - 一种发酵补料优化控制***和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵补料优化控制***和方法，所述***包括发酵罐、补料瓶、用于实时监测所述发酵罐中糖浓度的葡萄糖电极和用于实时监测所述发酵罐中菌体OD的光密度电极，以及用于泵入补料培养基的外接补料泵和外接电脑控制***，其连接所述葡萄糖电极、光密度电极和补料泵，根据所述糖浓度、菌体OD和设定的比生长速率控制所述补料泵的运行速度，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式从所述补料瓶向所述发酵罐补充补料培养基。本发明的***和方法，能够提高发酵补料自动化过程并且有利于提高菌体发酵密度，提高目的蛋白表达。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，尤其涉及一种发酵补料优化控制***和方法。
背景技术
补料分批发酵(Fed-batch fermentation)，也称半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质的方法。目前应用范围非常广泛，几乎遍及整个发酵行业。补料分批发酵的理论研究在20世纪70年代以前几乎是个空白，在早期的工业生产中，补料的方式非常简单，采用的方式就仅仅局限于间歇流加和恒速流加，控制发酵也是以经验为主。直到1973年日本学者Yoshida等人提出了“补料分批发酵”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，补料分批发酵的研究才进入理论研究阶段。其后，随着研究的不断深入，补料分批发酵在三个方面取得了重大的进展。近年来更随着理论研究和应用的不断深入，流加发酵的内容大大丰富了。
目前补料分批发酵是通过控制发酵过程中残糖含量或者比生长速率，在发酵过程，在发酵一段时间就需要对发酵罐中菌体进行取样检测。补料过程使用仪器自带的蠕动泵，间歇式流加补料。
现有技术的缺陷表现在：(1)需要通过不停测量发酵过程中的OD，残糖来进行反馈调节补料速度；(2)发酵过程中人工操作要求高，时间长；(3)发酵过程中染菌几率增加；(4)传统的发酵液生产过程中，补料***为“半饥饿”补料工艺，要么在发酵初期一次性加入所有培养基营养成分，任其逐渐消耗；要么在发酵中后期手动、间歇性的补料，加大了培养基整体的生态环境波动，发酵产量的损失大。
发明内容
本发明提供一种发酵补料优化控制***和方法，能够提高发酵补料自动化过程并且有利于提高菌体发酵密度，提高目的蛋白表达。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种发酵补料优化控制***，该***包括发酵罐、补料瓶、用于实时监测上述发酵罐中糖浓度的葡萄糖电极和用于实时监测上述发酵罐中菌体OD的光密度电极，以及用于泵入补料培养基的外接补料泵和外接电脑控制***，其连接上述葡萄糖电极、光密度电极和补料泵，根据上述糖浓度、菌体OD和设定的比生长速率控制上述补料泵的运行速度，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式从上述补料瓶向上述发酵罐补充补料培养基。
进一步地，上述补料泵的补料速度按照如下公式得出：
ωv＝(eμ·OD-OD)·V/c/V0；
其中，ωv表示补料泵的运行速度相对于其全速的百分比；μ表示设定的比生长速率，即每小时单位质量的菌体所增加的菌体量；V表示发酵体积；c表示补料培养基中葡萄糖的浓度；V0表示单位时间内补料泵全速运行的补料体积。
进一步地，上述***还包括在上述发酵罐尾气端添加的尾气分析质谱仪，用于测量摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)和呼吸商(RQ)。
进一步地，上述***还包括通过网络实时在线监控发酵罐内菌体生长状况的移动终端。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种发酵补料优化控制方法，该方法包括：使用连接于发酵罐的葡萄糖电极实时监测发酵罐中糖浓度，使用光密度电极实时监测发酵罐中菌体OD；使用连接于上述葡萄糖电极、光密度电极和补料泵的外接电脑控制***，根据上述糖浓度、菌体OD和设定的比生长速率控制上述补料泵的运行速度，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式从补料瓶向上述发酵罐补充补料培养基。
进一步地，上述补料泵的补料速度按照如下公式得出：
ωv＝(eμ·OD-OD)·V/c/V0；
其中，ωv表示补料泵的运行速度相对于其全速的百分比；μ表示设定的比生长速率；V表示发酵体积；c表示补料培养基中葡萄糖的浓度；V0表示单位时间内补料泵全速运行的补料体积。
进一步地，上述方法还包括在上述发酵罐尾气端添加尾气分析质谱仪，用于测量摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)和呼吸商(RQ)。
进一步地，上述方法还包括：使用移动终端通过网络实时在线监控发酵罐内菌体生长状况。
进一步地，上述方法还包括：控制初始培养基的营养量，在等到营养消耗殆尽之后正好是细胞需要补料，并且OD达到诱导阶段。
进一步地，上述方法按照每1克糖使1升菌液增长1个OD的标准预计比生长速率以推测出下一步补料速度，并通过电脑自动调节。
本发明通过添加碳源、氮源、无机盐和微量元素实现补料培养基的连续添加。
本发明的发酵补料优化控制***和方法，采用外接补料泵，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式进行补料，能够控制菌体在诱导时期以一定的速度生长表达蛋白，保证蛋白正常折叠，能够有效提高蛋白表达量，蛋白表达量提高30％，细胞量提高35％。使用本发明的***和方法进行发酵补料，操作过程简便，取样次数少，污染几率减少。
附图说明
图1为本发明一种实施方案的发酵补料优化控制***的结构示意图；
图2为本发明一个实施例和一个对比例的发酵方法得到的发酵液上清和全菌的蛋白产量结果图，其中上清1和全菌1代表对比例的结果，使用发酵罐自带补料泵，采用半连续流加的方式，补料策略是通过取样测量残糖，待残糖消耗完后半连续流加葡萄糖；上清2和全菌2代表实施例的结果，相比对比例所得上清1和全菌1的产量提高了30％。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，本发明的一个实施方案的发酵补料优化控制***包括：发酵罐1、补料瓶2、葡萄糖电极3、光密度电极4、外接的补料泵5和外接的电脑控制***6，其中葡萄糖电极3用于实时监测发酵罐1中糖浓度，光密度电极4用于实时监测发酵罐1中菌体OD，外接的补料泵5用于泵入补料培养基，外接的电脑控制***6连接葡萄糖电极3、光密度电极4和补料泵5，用于根据糖浓度、菌体OD和设定的比生长速率控制补料泵5的运行速度，从而使得发酵补料优化控制***以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式从补料瓶2向发酵罐1补充补料培养基。
在本发明的一个实施例中，补料泵5是蠕动泵(例如兰格牌蠕动泵)。蠕动泵的初始运行速度为蠕动泵全速的1％。
在本发明的一个实施例中，补料泵的补料速度按照如下公式得出：
ωv＝(eμ·OD-OD)·V/c/V0；
其中，ωv表示补料泵的运行速度相对于其全速的百分比；μ表示设定的比生长速率；V表示发酵体积；c表示补料培养基中葡萄糖的浓度；V0表示单位时间内补料泵全速运行的补料体积。
本发明的技术方案建立了一种发酵模型匹配相应的补料模式，并结合计算机，达到自动反馈控制补料发酵；使用发酵罐外接补料泵(如蠕动泵)，采用葡萄糖电极、光密度电极及外接电脑控制***；补料模式是控制比生长速率(每小时单位质量的菌体所增加的菌体量)，控制菌体在诱导期以一定的速度生长表达蛋白，保证蛋白能正常折叠；采用外接补料泵，连续流加，保证发酵过程菌体生长平稳；通过添加碳源、氮源、无机盐和微量元素实现补料培养基的连续添加。
此外，本发明的技术方案还可以包括如下一些技术手段：在发酵罐尾气端添加尾气分析质谱仪用于测量OUR、CER和RQ，反馈菌体生长状况；控制初始培养基的营养量，在等到营养消耗殆尽之后正好是细胞需要补料，并且OD达到诱导阶段；按照每1克糖使1升菌液增长1个OD的标准预计比生长速率以推测出下一步补料速度，并通过电脑自动调节；以及使用移动终端通过网络实时在线监控发酵罐内菌体生长状况。
实施例1
以发酵30L rosseta菌株为例。
(1)一级培养基：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L。
(2)二级培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，三水磷酸氢二钾16.45g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油5g/L。
(3)发酵培养基包括：48mmol/L磷酸氢二钠、20mmol/L磷酸二氢钠、16mmol/L柠檬酸铵，9mmol/L七水硫酸镁以及24g/L的葡萄糖和1.9g/L的酵母浸粉，3.8g/L胰蛋白胨，微量元素0.1％，0.09％的消泡剂，pH为7.2。其中七水硫酸镁、葡萄糖和微量元素单独灭菌。
(4)补料培养基包括：80mmol/L七水硫酸镁、640g/L的葡萄糖以及38.8g/L的酵母浸粉和19.4g/L胰蛋白胨，微量元素0.15％和0.09％的消泡剂。其中酵母浸粉、胰蛋白胨和消泡剂单独灭菌。
(5)将平板上的单菌落挑到一级培养基中，一级种子培养到OD为4.0，以1％接种到二级培养基中，待OD达到2.5以3％的比率体积比接种到发酵罐。
(6)发酵温度设置为37℃，pH不控制，关联溶氧和转速，将溶氧控制在50％以上培养，待溶氧开始反弹，约7h，此时OD约为20，进行补料，并且开始降温至30℃。
(7)补料使用兰格牌蠕动泵，初始补料速度为兰格牌蠕动泵全速的1％，此时控制pH6.5。
(8)通过光密度电极和葡萄糖电极实时监测，通过糖浓度、菌体OD，设定的比生长速率0.11、发酵体积、补料泵的全速补料速度(L/h)、补料的糖浓度(640g/L)等几个参数，按照公式ωv＝(e0.11*OD-OD)*30/0.64/3240，计算出泵的补料速度，控制残糖含量不低于0.5g/L，如果残糖浓度大于0.5g/L时，补料将以上一个小时的速度进行。pH控制以每小时手动将pH控制的值提高0.03，起始位6.5，最终到7.0后维持不变。关联溶氧和转速，将溶氧控制在50％。过程中观察菌体摄氧率和呼吸商。据此方法诱导15个小时，OD可达80。
注：公式ωv＝(e0.11*OD-OD)*30/0.64/3240中，ω表示补料泵的运行速度相对于全速的百分比；0.11表示控制的比生长速率；30表示发酵体积30L；0.64表示1mL补料培养基中葡萄糖含量0.64g；3240表示一小时补料泵全速的补料体积为3240mL。
对比例1
(1)一级培养基：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L。
(2)二级培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，三水磷酸氢二钾16.45g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油5g/L。
(3)发酵培养基包括：48mmol/L磷酸氢二钠、20mmol/L磷酸二氢钠、16mmol/L柠檬酸铵，9mmol/L七水硫酸镁以及24g/L的葡萄糖和1.9g/L的酵母浸粉，3.8g/L胰蛋白胨，微量元素0.1％，0.09％的消泡剂，pH为7.2。其中七水硫酸镁、葡萄糖和微量元素单独灭菌。
(4)补料培养基包括：80mmol/L七水硫酸镁、640g/L的葡萄糖以及38.8g/L的酵母浸粉和19.4g/L胰蛋白胨，微量元素0.15％和0.09％的消泡剂。其中酵母浸粉、胰蛋白胨和消泡剂单独灭菌。
(5)将平板上的单菌落挑到一级培养基中，一级种子培养到OD为4.0，以1％接种到二级培养基中，待OD达到2.5以3％的比率体积比接种到发酵罐。
(6)发酵温度设置为37℃，pH控制为7.0，关联溶氧和转速，将溶氧控制在50％以上培养，待溶氧开始反弹，约7h，此时取样测OD。进行补料，补料使用发酵罐的补料泵，并且开始降温至30℃。
(7)补料，离线取样测量OD，测量残糖，当残糖的量低于1g/L时，以恒速补料。使用的是发酵罐自带补料泵。以补3秒，停107秒的方式进行补料。
最终发酵补料方法的结果对比如表1所示。
表1
现有的发酵补料方法是使用发酵罐自带补料泵，采用半连续流加的方式。补料策略是通过取样测量残糖，待残糖消耗完后半连续流加葡萄糖。蛋白产量电泳结果如图2中上清1和全菌1所示；本发明补料方法，采用外接补料泵(蠕动泵)，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式进行补料，得到的蛋白产量电泳结果如图2中上清2和全菌2所示，比现有的发酵补料方法所得的上清1和全菌1的产量提高30％。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种发酵补料优化控制***，其特征在于，所述***包括发酵罐、补料瓶、用于实时监测所述发酵罐中糖浓度的葡萄糖电极和用于实时监测所述发酵罐中菌体OD的光密度电极，以及用于泵入补料培养基的外接补料泵和外接电脑控制***，其连接所述葡萄糖电极、光密度电极和补料泵，根据所述糖浓度、菌体OD和设定的比生长速率控制所述补料泵的运行速度，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式从所述补料瓶向所述发酵罐补充补料培养基。
2.根据权利要求1所述的发酵补料优化控制***，其特征在于，所述补料泵的补料速度按照如下公式得出：
ωv=(eμ·OD-OD)·V/c/V0；
其中，ωv表示补料泵的运行速度相对于其全速的百分比；μ表示设定的比生长速率，即每小时单位质量的菌体所增加的菌体量；V表示发酵体积；c表示补料培养基中葡萄糖的浓度；V0表示单位时间内补料泵全速运行的补料体积。
3.根据权利要求1所述的发酵补料优化控制***，其特征在于，所述***还包括在所述发酵罐尾气端添加的尾气分析质谱仪，用于测量摄氧率、二氧化碳释放率和呼吸商。
4.根据权利要求1所述的发酵补料优化控制***，其特征在于，所述***还包括通过网络实时在线监控发酵罐内菌体生长状况的移动终端。
5.一种发酵补料优化控制方法，其特征在于，所述方法包括：使用连接于发酵罐的葡萄糖电极实时监测发酵罐中糖浓度，使用光密度电极实时监测发酵罐中菌体OD；使用连接于所述葡萄糖电极、光密度电极和补料泵的外接电脑控制***，根据所述糖浓度、菌体OD和设定的比生长速率控制所述补料泵的运行速度，以控制比生长速率的补料模式和连续流加的形式从补料瓶向所述发酵罐补充补料培养基。
6.根据权利要求5所述的发酵补料优化控制方法，其特征在于，所述补料泵的补料速度按照如下公式得出：
ωv=(eμ·OD-OD)·V/c/V0；
其中，ωv表示补料泵的运行速度相对于其全速的百分比；μ表示设定的比生长速率；V表示发酵体积；c表示补料培养基中葡萄糖的浓度；V0表示单位时间内补料泵全速运行的补料体积。
7.根据权利要求5所述的发酵补料优化控制方法，其特征在于，所述方法还包括在所述发酵罐尾气端添加尾气分析质谱仪，用于测量摄氧率、二氧化碳释放率和呼吸商。
8.根据权利要求5所述的发酵补料优化控制方法，其特征在于，所述方法还包括：使用移动终端通过网络实时在线监控发酵罐内菌体生长状况。
9.根据权利要求5所述的发酵补料优化控制方法，其特征在于，所述方法还包括：控制初始培养基的营养量，在等到营养消耗殆尽之后正好是细胞需要补料，并且OD达到诱导阶段。
10.根据权利要求5所述的发酵补料优化控制方法，其特征在于，所述方法按照每1克糖使1升菌液增长1个OD的标准预计比生长速率以推测出下一步补料速度，并通过电脑自动调节。
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