CN107957456A

CN107957456A - 一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法

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Publication number: CN107957456A
Application number: CN201711227809.8A
Authority: CN
Inventors: 王安波; 孙思; 杨梅; 汪俭
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2018-04-24

Abstract

本发明属于检测技术领域，公开了一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法，选用磷酸‑乙腈作为提取溶液；水饱和正己烷的除脂方法；选择Waters Oasis HLB柱为固相萃取柱；选择1/4提取液过柱；选择89％(0.05mol/L磷酸/三乙胺):11％(乙腈)的流动相比例时；保留时间：恩诺沙星：8.41±0.5min，环丙沙星：5.41±0.5min，达氟沙星：7.33±0.5min，沙拉沙星：12.53±0.5min。本发明极大地节省了前处理时间和耗材成本，灵敏度与回收率均符合我国现行兽药残留检测标准，适用于大规模的样品分析。

Description

一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法。

背景技术

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones,FQNs)是一类人工合成抗菌药，抗菌效果极强，其中，恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、达氟沙星(Danofloxacin,DAO)和沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)在畜禽生产中被广泛应用。FQNs使用不当导致的药物残留及潜在的致癌性，严重威胁着人体健康，***粮农组织、欧盟和我国等均规定了动物源性食品中FQNs残留量，FQNs残留引起的问题也越来越受到关注。我国检测鸡蛋中FQNs残留最常采用的方法是农业部781号公告-6-2006-《鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定-高效液相色谱法》，结合荧光检测器使用。荧光检测器的抗干扰能力相对较弱，对样品前处理和色谱分离条件要求高，分析时间较长，能同时检测氟喹诺酮类药物种类较少；氟喹诺酮类药物性质不稳定，容易降解，此法提取量较低(反复两次提取液共4mL)，提取效果不佳，全液过柱损失较大，回收率偏低；此法中流动相的比例适用性较差，对于不同品牌、类型的仪器可参考性低，尤其针对超高效液相色谱仪，等度洗脱时色谱分离条件不佳，无法满足一些药物残留限量检测要求。因鸡蛋脂肪及蛋白质含量较高，而此法中每次加入的提取溶液和除脂溶液量少，需反复提取、除脂，前处理过程繁琐，不适于大批量样品的检测。此法虽然纯化效果好，但因步骤复杂，耗材消耗大、成本较高，亦不适合基层使用。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有的检测鸡蛋中FQNs残留方法存在过程繁琐，检测时间长，色谱分离效果不佳，回收率低，耗材消耗大，成本高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法。

本发明是这样实现的，一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法包括以下步骤：选用磷酸-乙腈作为提取溶液；水饱和正己烷的除脂方法；选择Waters Oasis HLB柱为固相萃取柱；选择1/4提取液过柱；选择89％(0.05mol/L磷酸/三乙胺):11％的流动相比例时；保留时间：恩诺沙星：8.41±0.5min，环丙沙星：5.41±0.5min，达氟沙星：7.33±0.5min，沙拉沙星：12.53±0.5min。

进一步，所述检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法包括以下步骤：

步骤一，称取2±0.05g均匀鸡蛋试样，置于离心管中，精确加入磷酸-乙腈提取液20.0mL，搅匀、涡旋混合10min，9000r/min冷冻离心10min；上清液转入另一离心管；

步骤二，上清液中加入10mL水饱和正己烷，涡旋混匀5min，9000r/min冷冻离心10min，去除上层正己烷及固体，再加入10mL水饱和正己烷，重复除脂一次；弃去上层正己烷，下层为备用液；

步骤三，HLB柱依次用5mL乙腈，5mL乙腈-缓冲液和5mL磷酸盐提取液淋洗活化；备用液取5.0mL(过柱，3mL水淋洗，真空抽干；加入2mL乙腈-缓冲液洗脱，真空抽干，过0.22μm微孔滤膜后上机分析；

步骤四，采用ACQUITY UPLC BEH C18选定色谱分析。

进一步，所述步骤四中色谱柱：流动相：0.05mol/L磷酸/三乙胺：乙腈＝89:11；流速：0.25mL/min；检测波长：λex为280nm，λem为450nm；进样量：2μL。

进一步，所述步骤四中各药物保留时间：恩诺沙星：8.41±0.5min，环丙沙星：5.41±0.5min，达氟沙星：7.33±0.5min，沙拉沙星：12.53±0.5min。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法检测的氟喹诺酮类药物。

本发明采用超高效液相色谱仪(UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC)，建立了一种快速、高效、重现性好能同时检测鸡蛋中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星残留的方法。样品经磷酸-乙腈提取，水饱和正己烷的除脂，冷冻离心，HLB固相萃取柱净化，ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)分离，荧光检测器检测，外标法定量。表1结果表明，4种氟喹诺酮类药物在0.2～50μg/kg线性范围良好(R2>0.9997)，分别添加低中高三种不同浓度，4种氟喹诺酮类药物在0.2～50μg/kg线性范围良好(R2>0.9997)，表2中分别添加低中高三种不同浓度，回收率在85.7％～94.3％之间，变异系数为1.50％～3.77％，最低检测限为0.17～0.59μg/kg，定量限为0.81～2.01μg/kg。本方法易于操作，准确度和精密度高，灵敏度与回收率均符合我国现行兽药残留检测标准，能满足大批量鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留检测需要。

FQNs属于两性有机化合物，同时含有氨基和羧基，溶于酸性和碱性溶剂，当pH≥4或pH≤9时，FQNs易溶于含水相。因碱性提取溶液易使FQNs乳化，所以本发明主要考察以无机试剂(磷酸盐缓冲液)与酸性条件下有机试剂(磷酸-乙腈、1％乙酸-乙腈)的提取效率，结果表明，采用磷酸-乙腈的回收率明显高于磷酸盐缓冲溶液以及1％乙酸-乙腈溶液，见图2。可知，在酸性条件下采用有机溶剂，沉淀蛋白充分。相较于原方法分两次一共4.0mL提取目标物，本发明一次性加入20.0mL磷酸-乙腈溶液提取，采用过量提取的方式确保了高回收率，只需提取一次且样品不需要在进行酸化和稀释可以直接进行固相萃取净化，缩短了提取时间。

脂肪为非极性化合物，脂质除杂遵循相似相容原理，若除脂不完全，会直接影响固相萃取过柱效率，回收率偏低。但若采用极性较大的除脂溶剂过度除脂亦会增加将目标物除去的可能，回收率亦会下降。本发明为了达到良好的除脂效果，考察了不同极性的水饱和正己烷、乙腈饱和正己烷、水饱和乙酸乙酯这三种溶剂对4种FQNs回收率的影响，发现水饱和正己烷的除脂方法除脂效果最好，见图3。相较而言，正己烷极性更适于对FQNs进行除脂，而采用水饱和正己烷，可以使目标物更少的进入另一项中且脂肪更易于以无水固体形式存在，除脂充分。

固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)是目前残留分析方法的主要净化手段之一。Waters Oasis HLB柱的填料是由两种基本单体：亲水性的N－乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯按特定比例聚合构成的。可满足所有固相萃取需要的亲水亲脂平衡的水可浸润性反相吸附剂。它以特别的“极性钩”为增强极性物的保留提供了优异的反相保留容量。耐受极端pH条件和不同的溶剂，对极性化合物具有优异的保留能力，相对保留容量较传统硅胶基质SPE吸附剂(如C₁₈)高3倍。本发明考察了Waters Sep-pak C₁₈柱、Waters OasisHLB柱、HyperSep PEP柱对于鸡蛋中4种FQNs的提取效率的影响。发现Waters Oasis HLB柱的回收率：大大高于Waters Sep-pak C₁₈柱和HyperSep PEP柱，见图4。证明，水可浸润的Oasis HLB吸附剂对更广泛的极性分析物表现出优异的保留能力，即使在活化或上样时吸附剂柱床出现干涸的情况下也如此。这意味着本发明的SPE方法会更加稳定和耐用，无需重复预处理，并且可保留更多的分析物并较少发生穿透，改善SPE方法的回收率和总体重现性。

为进一步提高本发明方法的回收率，选择1/4提取液过柱。从20mL总的提取液中精确量取5.0mL过柱。结果表明，分取过柱回收率明显高于全液过柱回收率，见图5。从提取液中分取溶液过柱，可以确保过柱体积的准确性，提高过柱效率，确保高回收率，节省过柱时间。

本发明，通过采用磷酸-乙腈过量提取、水饱和正己烷除脂、分取提取液过柱(Waters Oasis HLB)，确保回收率的同时极大地简化了前处理步骤，通过改变流动相比例，降低流速与进样量优化了检测条件，建立了一种快速、高效准确性高、重现性好、操作简单、成本低的UPLC检测4种FQNs药物残留的方法。

附图说明

图1是本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法的流程图。

图2是本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法的提取液对四种氟喹诺酮类药物回收率的影响图。

图3是本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法的除脂溶液对四种氟喹诺酮类药物回收率的影响图。

图4是本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法的固相萃取柱对四种氟喹诺酮类药物回收率的影响图。

图5是本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法的分取条件对四种氟喹诺酮类药物回收率的影响图。

图6是本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法的氟喹诺酮类药物液相色谱图；

图中：A.标准品图谱(恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星1.0μg/kg，达氟沙星0.2μg/kg)；B.空白基质色谱图；C.空白基质阳性添加色谱图(恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星10.0μg/kg，达氟沙星2.0μg/kg)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法包括以下步骤：

S101：称取2±0.05g均匀鸡蛋试样，置于离心管中，精确加入磷酸-乙腈提取液20.0mL，搅匀、涡旋混合10min，9000r/min冷冻离心10min；上清液转入另一离心管；

S102：上清液中加入10mL水饱和正己烷，涡旋混匀5min，9000r/min冷冻离心10min，去除上层正己烷及固体，再加入10mL水饱和正己烷，重复除脂一次；弃去上层正己烷，下层为备用液；

S103：HLB柱依次用5mL乙腈，5mL乙腈-缓冲液和5mL磷酸盐提取液淋洗活化；备用液取5.0mL(过柱，3mL水淋洗，真空抽干；加入2mL乙腈-缓冲液洗脱，真空抽干，过0.22μm微孔滤膜后上机分析；

S104：采用ACQUITY UPLC BEH C18选定色谱分析。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1药品与试剂

恩诺沙星标准品、环丙沙星标准品、沙拉沙星标准品、达氟沙星标准品，含量为100μg/mL，农业部环境保护科研监测所；正己烷、三乙胺、氢氧化钠、磷酸二氢钾、85％磷酸为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯；水质符合GB/T 6682规定的二级水。

1.2仪器与设备

UPLC H-Class超高效液相色谱仪配荧光检测器，美国Waters公司；万分之一天平，感量0.1mg，瑞士梅特勒-托利多公司；涡旋振荡混合器、组织匀浆分散机，德国IKA；固相萃取仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；高速冷冻离心机，湖南相依实验室仪器开发有限公司；HLB固相萃取柱，60mg/3cc，美国Waters公司；滤膜，0.22μm,天津津腾实验设备有限公司。

1.3试液配制

1.3.1标准品储备溶液的配制

精密量取恩诺沙星(100μg/mL)1mL、环丙沙星(100μg/mL)1mL、沙拉沙星(100μg/mL)1mL、达氟沙星(100μg/mL)1mL于10ml容量瓶，0.03mol/L氢氧化钠溶解并稀释至刻度，摇匀。作为标准品储备溶液(10μg/mL)，置4℃冰箱中保存。有效期3个月。

1.3.2标准品工作溶液的配制

精密量取恩诺沙星(10μg/mL)、环丙沙星(10μg/mL)、沙拉沙星(10μg/mL)储备液1mL置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准品工作溶液(1μg/mL)。精密量取达氟沙星(10μg/mL)储备液200μL置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准品工作溶液(200ng/mL)。

1.3.3氢氧化钠溶液5.0mol/L：量取氢氧化钠饱和液28mL，加水稀释至100mL。现用现配。

1.3.4氢氧化钠溶液0.03mol/L：量取5.0mol/L氢氧化钠溶液0.6mL，加水稀释至100mL。现用现配。

1.3.5磷酸/三乙胺0.05mol/L：量取85％磷酸1.7mL，加水稀释至500mL，滴加三乙胺，调pH至2.4。现用现配。

1.3.6乙腈(30％)-缓冲液：量取乙腈30mL和0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液(pH2.4)70mL，混合振荡保存，现用现配。

1.3.7磷酸-乙腈溶液：量取85％磷酸5mL，加乙腈稀释至500mL，现用现配。

1.4样品制备

取新鲜鸡蛋与空白样鸡蛋各400g，将蛋清和蛋黄用高速匀浆机搅拌，得到供试样品与空白样品，装入样品瓶中-20℃保存。

1.5检测方法

1.5.1供试材料的制备：

取匀浆后的供试样品，作为供试材料；取匀浆后的空白样品，作为空白材料；取匀浆后的鸡蛋空白样品，添加标准品储备液20μL，涡旋均匀，配制成恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星：10ng/mL，达氟沙星：2ng/mL的阳性添加试样。

1.5.2提取与净化

称取2±0.05g鸡蛋试样，置于离心管中，精确加入磷酸-乙腈提取液20.0mL，搅匀振荡混合10min，9000r/min冷冻离心10min。上清液转入另一离心管。加入10mL水饱和正己烷，振荡5min，9000r/min冷冻离心10min，去除上层正己烷及固体，再加入10mL水饱和正己烷，重复一次。弃去上层正己烷，下层为备用液。HLB柱(60mg/3cc)依次用5mL乙腈，5mL乙腈(30％)-缓冲液和5mL磷酸盐提取液润洗。备用液取5.0mL过柱，用3mL水洗，真空抽干。加2mL乙腈(30％)-缓冲液洗脱，真空抽干，过0.22μm微孔滤膜后上机分析。

1.5.3色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：V(0.05mol/L磷酸/三乙胺)：V(乙腈)＝89:11；流速：0.25mL/min；检测波长：λex为280nm，λem为450nm；进样量：2μL。

1.6线性范围与检出限

空白样品中加入混合标准液配制成的恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星系列标准溶液。经UPLC检测后，以峰面积为纵坐标，药物质量浓度为横坐标，进行线性回归分析。在空白样品中添加不同质量浓度混合标准溶液，按1.5的方法进行处理，检测后取以性噪比S/N＝3对应的样品浓度为方法检出限(LOD)，性噪比S/N＝10对应的样品浓度为方法定量限(LOQ)。

1.7回收率与精密度

向空白待测样品中分别添加3个浓度水平的混合标准溶液。每个浓度重复测定3次，按1.5的方法进行处理，按农业部781号公告-6-2006方法^[4]中4.5公式计算回收率和变异系数。

2.结果与讨论

2.1前处理条件的优化

2.1.1提取液的选择

FQNs属于两性有机化合物，易溶于酸碱溶液，已有研究表明，用碱性溶液提取FQNs容易乳化。本发明比较了三种常见的FQNs提取溶剂：磷酸-乙腈、磷酸盐缓冲液、1％乙酸-乙腈对鸡蛋中4种FQNs回收率的影响，结果发现，采用磷酸-乙腈提取回收率最高，在87％～93.1％之间；磷酸盐缓冲液次之：38.7％～55.6％；1％乙酸-乙腈较差：25.9％～41.6％，见图2。可知，有机溶剂相较于无机溶剂提取效率高，尤其在酸性条件下，蛋白质容易变性沉淀，除杂充分，进一步提高了回收效率。因此，本发明选用磷酸-乙腈作为提取溶液。

2.1.2除脂溶液的选择

鸡蛋中含有丰富的脂肪和蛋白质，能否将其除净直接影响方法的准确性和稳定性。样品脱脂常用水饱和正己烷、乙腈饱和正己烷、水饱和乙酸乙酯这三种溶剂，本发明对比了这三种脱脂溶剂对4种FQNs回收率的影响，发现选择水饱和正己烷的除脂方法回收率最高：88.5％～92.7％；乙腈饱和正己烷次之：69.5％～75.6％；水饱和乙酸乙酯较差：20.0％～32.1％，见图3。水饱和乙酸乙酯可能因为极性较大，将大部分目标物与脂肪一并除去，导致回收率偏低。相较之下，水饱和正己烷极性偏低，更适于作为本发明除脂溶液。

2.1.3固相萃取柱的选择

动物源性食品中基质干扰较多，前处理需固相萃取净化才可上机检测，否则不但影响检测的准确性，还会污染色谱柱，因此选择合适的净化柱尤为重要。本发明比较了Waters Sep-pak C₁₈柱、Waters Oasis HLB柱、HyperSep PEP柱对于鸡蛋中4种FQNs的提取效率的影响。发现Waters Oasis HLB柱的回收率：89.1％～93.2％明显优于Waters Sep-pak C₁₈柱：31.2％～42.3％以及HyperSep PEP柱：58.7％～67.0％，见图4。HLB柱与传统的C₁₈柱相比，具有更高保留效率，少量的填料就可以净化大量的样品，流速快而均匀，不易出现柱堵塞，因而选择Waters Oasis HLB柱为本发明的固相萃取柱。

2.1.4分取条件对回收率的影响

提取液中含有大量的有机溶剂，直接进行全液固相萃取净化，过柱时间较长而且目标物很可能会被有机溶剂带出而无法保留在SPE柱上。一般可通过分取提取液过柱或者用相对弱极性溶剂稀释后降低有机溶剂的浓度提高回收率。本发明采用分取过柱，从20mL总的提取液中精确量取5.0mL过柱。结果表明，分取过柱回收率：92.0％～93.7％明显高于全液过柱回收率：68.9％～72.2％，见图5。因此，本发明选择1/4提取液过柱。

2.2色谱条件的优化

由于4种FQNs性质相近，等度洗脱时出峰位置大致相同，完全分离难度较大。本发明选择了等度洗脱时几种不同的流动相比例，结果发现，当选择89％(0.05mol/L磷酸/三乙胺):11％(乙腈)的流动相比例时，能实现完全分离，定量测定准确，重现性好。在试验选定条件下，测得保留时间：恩诺沙星：8.41±0.5min，环丙沙星：5.41±0.5min，达氟沙星：7.33±0.5min，沙拉沙星：12.53±0.5min，峰型尖锐，分离完全，空白组织在样品上述保留时间未出现干扰峰，见图6。

2.3方法学验证

2.3.1方法的检出限及标准曲线

空白及样品中添加不同浓度的标准工作液，对浓度不同的混合标准工作液进行色谱分析，工作曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表1。由表1可知，恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星的线性范围为1μg/kg～50μg/kg，达氟沙星为0.2μg/kg～10μg/kg，相关系数R²均大于0.9997，四种氟喹诺酮药物的检出限为0.17～0.59μg/kg，定量限为0.81～2.01μg/kg。可见，本发明线性范围较宽、灵敏度高，有一定的实用价值。

表1方法的线性范围、回归方程与相关系数

2.3.2方法的回收率与精密度

按1.5中样品处理方法对空白样品进行添加回收试验，检测结果见表2。恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星添加浓度为：10、25、50μg/kg，达氟沙星添加浓度为：2、5、10μg/kg。方法所测平均回收率在85.7％～94.3％之间，RSD在1.50％～3.77％之间。可见，本发明精密度与准确度均较高，能够满足鸡蛋中4种FQNs残留的日常检测要求。

表2样品加标回收数据

2.4样品测定

对所抽的50批鸡蛋样进行4种FQNs残留检测，检测结果均为未检出。

本试验在优化了原农业部标准的基础上，选择最佳条件，建立了鸡蛋中检测恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星残留量的UPLC方法，快速高效、灵敏度高、重现性好，提高回收率的同时也降低了检测成本，适用于鸡蛋食品品质的日常监控并大大提高了检测效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于，所述检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法选用磷酸-乙腈作为提取溶液；水饱和正己烷的除脂方法；选择Waters Oasis HLB柱为固相萃取柱；选择1/4提取液过柱；选择89％:11％的流动相比例时；保留时间：恩诺沙星：8.41±0.5min，环丙沙星：5.41±0.5min，达氟沙星：7.33±0.5min，沙拉沙星：12.53±0.5min。

2.如权利要求1所述的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于，所述检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法包括以下步骤：

步骤四，采用ACQUITY UPLC BEH C18选定色谱分析。

3.如权利要求2所述的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于，所述步骤四中色谱柱：流动相：0.05mol/L磷酸/三乙胺：乙腈＝89:11；流速：0.25mL/min；检测波长：λex为280nm，λem为450nm；进样量：2μL。

4.如权利要求2所述的检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于，所述步骤四中各药物保留时间：恩诺沙星：8.41±0.5min，环丙沙星：5.41±0.5min，达氟沙星：7.33±0.5min，沙拉沙星：12.53±0.5min。

5.一种利用权利要求1～4任意一项所述检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留的方法检测的氟喹诺酮类药物。