CN107955814B - 一种提高蛋白表达效率的启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高蛋白表达效率的启动子，属于启动子工程领域。本发明所述方法中涉及的启动子P_BH4是在启动子P_srfA的基础上对其核心区进行突变改造而形成的。在新启动子P_BH4控制转录下，表达绿色荧光蛋白(GFP)时，使用P_BH4的表达量是使用P_srfA的3.5倍，表达葡糖醛酸酶A(GusA)时，使用P_BH4使酶活从0.6U/ml提高至8.9±0.1U/ml。

Description

一种提高蛋白表达效率的启动子

技术领域

本发明涉及一种提高蛋白表达效率的启动子，属于启动子工程领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌表达***被认为是GRAS级的有机体，可将功能性蛋白分泌到培养基中，分离纯化工艺简单，目前被广泛用作异源蛋白表达的宿主菌。枯草芽孢杆菌应用的最为广泛的宿主菌是枯草168菌株以及枯草168系列的突变株(如WB600，WB700，WB800等)，本发明中选择使用的宿主菌是Bacillus subtilis 168。

基因表达体系是一个复杂的过程，目前枯草表达***还不是很成熟。近年来，科研工作者在枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白方面取得很大的进展，已建立一个有效的外源蛋白枯草表达***。而在载体***的改造过程中，启动子调控元件起着重中之重的作用，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。因此，从启动子出发，设计强启动子元件，构建成熟高效的枯草表达***，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变型枯草芽孢杆菌启动子以及利用该启动子在枯草芽孢杆菌168中高效表达外源蛋白的方法。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明以强启动子基因序列为基础，采用对启动子基因的核心元件进行定向进化的方式得到一个提高活力的突变启动子。该方法构建的新的启动子有效的提高了异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量。

本发明的第一个目的是提供一种提高蛋白分泌表达效率的启动子，含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供含有所述提高蛋白分泌表达效率的启动子的载体。

本发明的第三个目的是提供一种蛋白表达效率提高的基因工程菌，是以含有所述提高蛋白分泌表达效率的启动子的载体表达蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白包括但不限于酶。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或合成酶。

本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：(1)以权利要求1所述的启动子与载体连接或替换载体本身具有的启动子，得到含有新启动子的质粒_新启动子；(2)将质粒_新启动子与外源基因连接，得到含有新启动子的质粒_{新启动子-外源基因}；(3)将质粒_{新启动子-外源基因}转化到细菌或真菌细胞中。

本发明的第五个目的是提供一种提高启动子分泌表达效率的方法，是对启动子-10区上游的核苷酸序列进行3～7bp突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变是-10区上游3bp碱基进行简并突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变是-10区上游3bp碱基进行简并突变，并在已突变3bp碱基的基础上对3bp碱基上游的4bp碱基再进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以SEQ ID NO.2所示的启动子为亲本序列，对-10区上游3bp碱基进行简并突变，并在已突变3bp碱基的基础上对3bp碱基上游相邻的4bp碱基再进行突变，获得SEQ ID NO.1所示的突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述突变为简并突变。

本发明的第六个目的是提供所述提高蛋白分泌表达效率的启动子在生产含蛋白的产品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备葡糖醛酸酶A。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将编码葡糖醛酸酶A的基因与含有所述提高蛋白分泌表达效率的启动子的载体连接，转化至宿主细胞中进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述编码葡糖醛酸酶A的基因含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌168。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在35～37℃下发酵8～52h。

所述新型启动子，是P_BH4。是以PsrfA为初始启动子构建得到的。所述质粒载体，在本发明中，是pBBH4-GFP和pBBH4-gusA。

本发明的有益效果：本发明采用定向进化方式，获得了可提高外源蛋白产量突变体启动子P_BH4，该启动子可以在枯草芽孢杆菌中高效表达外源基因。突变启动子P_BH4转录活性较原始启动子P_srfA提高6倍以上，表达绿色荧光蛋白(GFP)时，使用PBH4的表达量是使用P_srfA的3.5倍，表达葡糖醛酸酶A(GusA)时，使用P_BH4使最大酶活从0.6U/ml提高至8.9±0.1U/ml。

附图说明

图1：P_srfA启动子突变体库构建策略；

图2：不同启动子在摇瓶水平上的表达能力验证a：生长曲线，b：GFP表达曲线，c：24h荧光强度比较，d：SDS-PAGE检测GFP表达量；其中WT为野生型启动子P_srfA表达GFP；BH4为突变体启动子P_BH4表达GFP；

图3：GusA在重组枯草芽孢杆菌中的表达；a：生长曲线与酶活测定，b：SDS-PAGE检测；其中，BSGus为野生型启动子P_srfA表达GusA；BSBHGuS为突变体启动子P_BH4表达GusA。

具体实施方式

1、GFP荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测荧光。激发光495nm，吸收光525nm，检测荧光。

2、GusA酶活检测方法：

在96孔酶标板中，向50μL细胞裂解液中加入终浓度为0.5mg·mL^-1的4-nitrophenylβ-d-glucuronide(PNPG)底物溶液(pH为7.0)，37℃反应5min。加入100μL终浓度为1M的Na₂CO₃终止反应。放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测405nm下的吸光值。依据标准曲线计算酶活。

酶活定义：在37℃，pH为7.0的条件下，每分钟转化生成1mmol产物对硝基苯酚所需酶量为一个酶活单位1U。

3、培养基：LB培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。

4、培养条件：重组菌种从-80℃冰箱中取出，在含有相应抗性的LB平板上划线，挑取单菌落在含有5mL LB培养基的试管中200r·min^-1，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有50mL LB培养基的250mL摇瓶中培养。

5、枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落BS168接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养过夜；从过夜培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD₆₀₀。当OD₆₀₀约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min^-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL l00×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min^-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min^-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。

实施例1：P_srfA启动子突变体库构建策略

以P_srfA-3bp-1和P_srfA-3bp-2(表1)为引物，以pBSG03(公开于C.Guan,W.Cui,J.Cheng,L.Zhou,J.Guo,X.Hu,G.Xiao,Z.Zhou,Construction and development ofan auto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis,Microb.Cell Fact.14(2015))为模板，对P_srfA启动子(SEQID NO.1)σ^A识别核心区“-10区”上游3bp碱基进行简并突变(图1)。并在3bp突变的基础上以P_srfA-4bp-1和P_srfA-4bp-2(表1)为引物，以3bp突变后的质粒为模板，对P_srfA启动子σ^A识别核心区“-10区”上游4bp碱基进行简并突变，获得P_srfA突变体，命名为P_BH4。

表1引物

实施例2：启动子P_BH4摇瓶实验验证

将筛选得到的P_BH4启动子用于摇瓶实验验证。将P_BH4启动子与载体pBSG03和编码绿色荧光蛋白的GFP基因连接，获得pBBH4-GFP。将pBBH4-GFP质粒转化至枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，在250ml摇瓶体系中验证这些转化子表达GFP活性，以在相同条件下培养的野生型菌株(以未突变的P_srfA启动子表达相同基因，载体和宿主保持一致)作为对照。

结果显示，以含有突变体启动子P_BH4质粒表达GFP的生长曲线与野生型菌株基本一致(图2-a)，并且野生型与突变体启动子都在细胞对数生长的中后期活性迅速提高(图2-b)，这符合P_srfA启动子受群体感应信号激活这一特点。筛选得到的突变体启动子P_BH4的活性较野生型启动子大幅提升，在24小时后，表达荧光强度是野生型启动子P_srfA的3.5倍。SDS-PAGE检测结果与GFP荧光检测结果一致(图2-d)，以含有突变体启动子P_BH4质粒表达GFP的表达量显著高于野生型启动子P_srfA的表达量。

实施例3：葡糖醛酸酶A在重组枯草芽孢杆菌中的表达

将实施例2中突变启动子P_BH4分别用于葡糖醛酸酶A(GusA)(序列如SEQ ID NO.3所示)的表达，实施过程主要是将原始载体中的基因GFP替换成GusA，引物P_gusA-i1，P_gusA-i2用于从大肠杆菌JM109并基因组中扩增葡糖醛酸酶A基因，P_gusA-v1，P_gusA-v2用于从pBSG03和pBBH4-GFP质粒上扩增含有野生型启动子PsrfA和突变体启动子P_BH4的载体骨架，最终构建质粒pBS-gusA和pBBH4-gusA。将两种质粒转化至枯草芽孢杆菌细胞中，培养、测定表达效果。如图3所示，培养8h后，GusA表达量从0.17±0.03U/ml提高至3.31±0.04U/ml；培养12h后，GusA表达量从0.30±0.04U/ml提高至7.75±0.04U/ml；培养28h后，GusA表达量从0.43±0.03U/ml提高至8.9±0.1U/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高蛋白表达效率的启动子

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 607

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcgacaaaa atgtcatgaa agaatcgttg taagacgctc ttcgcaaggg tgtctttttt 60

tgcctttttt tcggtttttg cgcggtacac atagtcatgt aaagattgta aattgcattc 120

agcaataaaa aaagattgaa cgcagcagtt tggtttaaaa atttttattt ttctgtaaat 180

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 240

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg gtgataaaaa catttttttg 300

tggtaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 360

tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 420

ctgactgacg gcagcctgct ttaatagcgg ccatctgttt tttgattgga agcactgctt 480

tttaagtgta gtactttggg ctatttcggc tgttagttca taagaattaa aagctgatat 540

ggataagaaa gagaaaatgc gttgcacatg ttcactgctt ataaagatta ggggaggtat 600

gacaatg 607

<210> 2

<211> 607

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 1806

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc 1800

aaacaa 1806

Claims (9)

1.一种启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述启动子的载体。

3.一种基因工程菌，其特征在于，含有权利要求2所述的载体，所述载体表达蛋白。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述蛋白包括酶。

5.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以权利要求1所述的启动子与载体连接或替换载体本身具有的启动子，得到含有新启动子的质粒_新启动子；(2)将质粒_新启动子与外源基因连接，得到含有新启动子的质粒_{新启动子-外源基因}；(3)将质粒_{新启动子-外源基因}转化到细菌或真菌细胞中。

6.一种提高启动子分泌表达效率的方法，其特征在于，以SEQ ID NO.2所示的启动子为亲本出发序列，是对启动子-10区上游的核苷酸序列进行3～7bp突变，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述突变是对-10区上游3bp碱基进行简并突变；或先对-10区上游3bp碱基进行简并突变，并在已突变3bp碱基的基础上对3bp碱基上游的4bp碱基再进行突变。

8.权利要求1所述的启动子在生产含蛋白的产品方面的应用。

9.权利要求1所述的启动子在发酵生产葡糖醛酸酶A方面的应用。

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