CN1079509A - 人体免疫缺陷病毒抗原 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基本纯的含Gag-Env融合
蛋白的HIV抗原,所说融合蛋白是由以羧基末端融
合在Env肽上的Gag组成的。本发明HIV抗原可
以很好地用作AIDS病诊断剂、疫苗、抗体制剂和治
疗剂的活性组分。本发明还公开一种基本纯的含由
完整gag基因编码而得Gag蛋白的HIV抗原。
Description
本发明是关于人体免疫缺陷病毒(HIV)抗原的。更具体地说,本发明是关于一种基本纯的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原的,其中所说的融合蛋白是由以羧基末端融合在特异的Env肽上的特异的Gag肽组成的,所说的抗原不仅具有优良的抗原性,而且还达到了迄今未曾达到的水平;本发明还涉及生产该抗原的方法。本发明的HIV抗原可用作艾滋病(AIDS)(后天免疫缺陷综合症)诊断剂、疫苗、抗体制剂和治疗剂的活性组分。
正如本领域众所周知的那样,自1981年报导了第一例AIDS病患者后,该病患者人数正以几何级数增长。到1992年4月止,AIDS病患者的总人数高达500,000。尽管对该疾病的预防和药物治疗研究工作已在全世界广泛而深入地展开,但在实际应用中尚无任何行之有效的防治措施。由于缺少确实可靠的防治办法,AIDS病已在全球扩散,成为目前世界性的严重问题。另一方面,1983年首次分离和鉴定了AIDS病毒,从此之后,在病毒学领域,对AIDS病的基础和临床研究变得非常活跃(参见Nature,326,P435-436,1987)。其结果是,对AIDS病的诊断有了显著的进步,诊断用的免疫性诊断剂及其生产方法迅速得以改进。AIDS病毒已从人体、猴和猫中分离出来,其中从人体中分离出来的病毒称为“人体免疫缺陷病毒(HIV)”。HIV主要分为HIV-1和HIV-2两类。HIV-1正在世界范围内,即美国、欧洲、中非和世界上其它许多国家传播,而HIV-2还只在西非慢延。HIV是一种直径为100-140nm的球形病毒,有被膜(Env)。该Env是由横膜蛋白(gp41)和70-80个呈圆棒鼓出状的被膜突起(gp120)组成的,每一突起直径15nm,高9nm,存在于病毒颗粒的表面。在病毒颗粒芯部,两条单链病毒基因组RNA分子与逆转录酶和作为病毒粒芯的结构蛋白形成了一复合物,并存在有引物tRNA。病毒基因组长度大于9Kb,由约10个不同的基因组成。病毒基因组实质上包括下述三个主要基因,正是这三个基因负责编码基本病毒成分,使病毒增殖:
(1)编码p55的gag(基团特异的抗原)基因,p55是病毒粒芯三种结构蛋白p17、p24和p15的前体蛋白;
(2)pol(聚合酶)基因,该基因负责编码三种不同酶即蛋白酶、逆转录酶和整合酶的前体;
(3)编码gp160的env(被膜)基因,gp160是形成病毒被膜的两种糖蛋白gp120和gp41的前体。
病毒基因组中的这些基因以5′末端→3′末端方向按gag·pol…env顺序排列。
其余七个基因,即所谓的辅助基因,据信参与控制HIV感染、增殖和成熟,以及病情的发展。
通过培养HIV可以生产出用于AIDS病基础研究及研制治疗剂、诊断和疫苗用的各种HIV抗原和基本酶类。然而,培养HIV会伴随出现致死生物的危险。因此,业已进行了各种研究和尝试以期开发出不用培养HIV就能生产出大量所说抗原和酶的技术。例如,就gag和pol基因而言,采用能够在大肠杆菌(E.coli)中表达基因并加工所产生的蛋白质的技术,已经成功地高产率地生产出了各种HIV抗原和酶,如Gag蛋白p17、p24和p15(参见日本特许公开4-117289号说明书),以及pol基因产物,如蛋白酶、逆转录酶和整合酶(参见日本特许公开2-265481号说明书),一些抗原和酶已用于实践。
另一方面,关于HIV的env基因表达,与gag和pol基因表达相比,专一高效表达env基因是极为困难的,且其原因尚不清楚。因此,在许多情况下,HIV的env基因是以与一外源基因嵌合的形式表达的,由此生成表达为蛋白质的Env肽,在蛋白质中,Env肽融合在一外源肽上,例如,已知以与脊髓灰质炎病毒嵌合的形式表达env基因,由此产生一融合蛋白,在该融合蛋白中,Env肽融合在了脊髓灰质炎病毒抗原肽上(见Journal of Virology,65,P2875-2883,1991)。又如已知env基因借助大肠杆菌表达质粒pEV-vrf以与gag基因嵌合的形式表达,由此而产生了Env肽融合在Gag肽上的Gag-Env融合蛋白(Analytical Biochemistry,161,P370-379,1987)。在上述这些情况中,凭藉外源基因或结构基因编码的肽以其羧基末端融合在Env肽上,其中所说的编码的肽在表达质粒中位于启动子的下游。当Env肽融合到一外源肽上时,Env肽在与血清的反应中很可能表现出非特异性。因此,融合到外源肽上的Env肽与纯HIV抗原相比无论质量和作为HIV抗原使用的可靠性方面都要差。另外,融合到外源肽上的Env肽其产率也不高。
为了去掉外源肽,可以设想在Env肽和外源肽的接合部位切割融合蛋白。但是用此方法不可能获得高产率低成本的无外源肽的纯的目的Env肽。
另外,将Env肽表达为由融合在Env肽上的Gag肽所组成的Gag-Env融合蛋白(参见日本特许公开1-179687号说明书;Virology,180,P811-813,1991;欧洲专利申请公开No 307149)是已知的。但是,传统的Gag-Env融合蛋白收率往往较低,因而成本提高。再则,所说的Gag-Env融合蛋白抗原性差,因此作为HIV抗原的可靠性也就低。
因此,传统的HIV抗原存在着质量差、可靠性低和收率少的缺点。由此,从实用和商业的角度讲迫切要求一种新的全无上述缺点的HIV抗原,该新HIV抗原的研制已成为本领域的紧迫任务。
如上所述,表达为融合蛋白形式的Env肽已经按照传统方法大量地生产出来了,其中在所说的融合蛋白中,Env肽融合在外源肽上,但是常规获得的表达为融合蛋白的Env肽在抗原-抗体反应中很可能表现为非特异性,从而使融合蛋白作为HIV抗原使用在质量和可靠性上都不能令人满意。这种融合蛋白不适用于AIDS病的实际诊断。应当进一步认识到,通过克服现有技术的一系列问题而实现了本发明,上述现有技术即是甚至当gag基因和env基因互相融合,并通过常规遗传工程技术表达时,作为HIV抗原是非常可靠的Gag-Env融合蛋白其收率也不可能高。
本发明人进行了广泛而深入细致的研究,通过开发一种新的HIV抗原来解决上述问题。结果,本发明人成功地研制出了一种新的HIV抗原,该抗原在质量、可靠性和产率方面都很好,因此从实际使用和商业观点看是极为有益的。更具体地说,本发明人意外地发现了一种基本纯的含Gag-Env融合蛋白的特异性HIV抗原,所说的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合到Env肽上的Gag肽组成的,其中Gag肽包括本发明所限定的由Gag(308-437)代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列,Env肽包括本发明限定的由Env(512-699)代表的氨基酸序列中的至少一部分,所说的部分包含至少一个对HIV抗体有反应活性的表位。上述抗原不仅具有良好的抗原性,而且其产率能达到常规所不能达到的高度。
进一步说,在设计本发明的含特异Gag-Env融合蛋白的上述HIV抗原过程中,本发明人意外地发现,作为HIV抗原,通过将编码Gag蛋白完整氨基酸序列的gag基因表达为一不成熟蛋白而获得的Gag蛋白,与Gag蛋白p17、p24和p15,即成熟蛋白且已知为传统诊断AIDS病用的抗原相比,具有如下优点:对HIV抗体有广谱反应性,在抗原-抗体反应中反应性强。
本发明是基于这些新的发现而完成的。
因此,本发明的目的是提供一种基本上纯的HIV抗原,其质量优良,不会表现出免疫学非特异性反应性,可很好地用于制备HIV试验试剂,HIV抗体,诊断AIDS病用的试剂和AIDS病疫苗等等。
本发明的第二个目的是提供高产高效生产HIV抗原的方法。
本发明的第三个目的是提供一种用于高产高效生产HIV抗原的重组DNA分子。
本发明的第四个目的是提供一种AIDS病诊断剂。
本发明的第五个目的是提供一种AIDS病疫苗。
本发明的上述和其它目的,特征以及优点可从下面的详细说明、所附权利要求及有关附图中清楚地看到。
附图说明:
图1-(1)至1-(2)示出了Gag蛋白的完整氨基酸序列,该蛋白是由含完整HIV-1基因组的质粒中所含的完整gag基因区编码而成的。
图2-(1)至2-(3)示出了Env蛋白的完整氨基酸序列,该蛋白是由含完整HIV-1基因组的质粒中所含的完整env基因区编码而成的。
按照本发明的一个方面,提供了一种含Gag-Env融合蛋白基本纯的HIV抗原,其中Gag-Env融合蛋白由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽组成。
在本发明的HIV抗原中,Gag肽包含Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列,其中括号内数值范围中的每个数系图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号。Env肽包含至少一部分由Env(512-699)代表的氨基酸序列,所说的部分包括至少一个对HIV抗体有反应活性的表位,其中括号内数值范围中的每个数即是图2-(1)至2-(3)所示HIV的Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号。
在本发明中,每一不同Gag肽中的氨基酸序列区和每一不同Env肽中的氨基酸序列区均如上所示加括号表示。就Gag肽而言,括号中的每一数值系图1-(1)至1-(2)中所示的HIV的Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号,同样,对Env肽来说,括号内给出的每一数值为图2-(1)至2-(3)中所示HIV的Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号。
在本发明中,除非另有说明,肽或蛋白质的氨基酸序列中的左右端分别为氨基末端和羧基末端。在氨基酸序列中,Asp代表天冬氨酸残基,Glu为谷氨酸残基,Lys为赖氨酸残基,Arg为精氨酸残基,His为组氨酸残基,Asn为天冬酰胺残基,Gln为谷氨酰胺残基,Ser为丝氨酸残基,Thr为苏氨酸残基,Tyr为酪氨酸残基,Cys为半胱氨酸残基,Trp为色氨酸残基,phe为苯丙氨酸残基,Gly为甘氨酸残基,Ala为丙氨酸残基,Val为缬氨酸残基,Leu为亮氨酸残基,Ile为异亮氨酸残基,pro为脯氨酸残基,Met为蛋氨酸残基。
在本发明的含上述限定的Gag-Env融合蛋白的HIV抗原中,优选在部分Env肽中所包含的至少一个表位是由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
在本发明中,Gag-Env融合蛋白中的Gag肽包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列。Gag肽优选包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少30个,最好至少50个,更优选至少70个相邻排列的氨基酸序列。最佳的是,Gag肽包含由Gag(308-406)或Gag(308-437)所代表的氨基酸序列。关于此,应该注意到,当Gag-Env融合蛋白中的Gag肽包含Gag蛋白完整氨基酸序列中的第307个氨基酸的N末端位之前的氨基酸序列和/或Gag蛋白完整氨基酸序列中的第438个氨基酸的C末端位之后的氨基酸序列时,Gag-Env融合蛋白的产率明显降低。
从改善Gag-Env融合蛋白的抗原性和产率的角度考虑,要求Env肽包含至少一部分由Env(512-699)所代表的氨基酸序列,所说的部分含至少一个对HIV抗体有反应活性的表位。Env肽上的表位优选包含由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个,最好至少10个,更好是至少15个相邻排列的氨基酸序列。
利用遗传工程技术可以生产出本发明的HIV抗原中的Gag-Env融合蛋白,其方法包括将负责编码包含至少一个HIV抗原表位的上述特异Env肽的env基因连接到负责编码上述特异Gag肽的gag基因的下游,由此得到包含gag-Env融合基因的重组DNA分子,表达该gag-env融合基因。按照本发明,通过表达上述特异gag-env融合基因,首次生产出了一种新的抗原性好的能极其精确地检测HIV抗体的HIV抗原。本发明的HIV抗原还有一个优点,即其产率之高是传统所不能达到的。
本发明HIV抗原中的Gag-Env融合蛋白可以与所有受试HIV携带者的血清反应,因此,本发明HIV抗原中的Gag-Env融合蛋白不仅极为适合作为生产诊断剂用的抗原,而且可以用作HIV疫苗的活性组分。
如上所述,对Gag蛋白上各局部肽的用途已有报导(如见日本特许公开4-117289号说明书),但就完整的Gag蛋白(p55),即其完整的氨基酸序列的用途尚未有过报导。事实上,Gag蛋白p55的用途未见报导的原因在于p55是一种极为不稳定的未成熟蛋白质,这种没有成熟的蛋白质是在HIV颗粒形成的过程中产生的,并且通常很快就分化成成熟蛋白质p17,p24和p15。按传统说来,用这种未成熟的蛋白质作为HIV抗原是难以想象的。如在后面所描述的实例2的步骤2表明的,本发明人通过重组DNA技术获得了p55、p17、p24和p15,并就它们与HIV携带者血清中的抗体的反应活性进行了比较。结果令人惊奇地发现,在这些蛋白质中,p55与HIV抗体的反应活性最强,检测抗体所必须的最低用量亦比上述那些成熟Gag蛋白都要少。这就是说,既使单独使用Gag蛋白p55也可以作为诊断AIDS病的有效抗原。另外,当Gag蛋白p55与上述Gag-Env融合蛋白一起以混合物的形式使用时,与HIV抗体反应的可靠性得到加强。
据此,本发明的另一方面是提供一种包括有HIV抗原混合物的HIV抗原,所说的混合物含有上述Gag-Env融合蛋白和以基本分离形式存在的Gag蛋白,Gag蛋白含Gag(1-500)所代表的氨基酸序列,即图1-(1)至1-(2)所示的Gag蛋白完整的氨基酸序列,其中括号内的每一数值系图1-(1)至1-(2)中氨基酸的位置编号。
另外,本发明还提供了一种基本纯的HIV抗原,该抗原含有以基本分离形式存在的含Gag(1-500)代表的氨基酸序列的,即图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整的氨基酸序列的Gag蛋白,其中括号内的每一数值系为图1-(1)至1-(2)中的氨基酸位置编号。
下面是对本发明更详细的说明。
本发明的HIV抗原基本上可按照下述程序Ⅰ-Ⅲ来制备。
程序Ⅰ.确定Env蛋白上能与HIV抗体反应的区域:
将各种env基因片段分别地融合到一高表达基因如LacZ基因的下游,致使各种env基因区分别以与如LacZ基因嵌合的形式表达,由于产生了表达为融合蛋白的Env肽,其中每种融合蛋白均是由各自的Env肽和LacZ蛋白(β-半乳糖苷酶)组成的。然后,使这些表达产物与大量的取自AIDS病患者、无症状HIV携带者(AC)和AIDS病相关复征(ARC)患者的血清进行免疫学反应,由此确定Env蛋白的表位区,表位区即对血清表现出强的特异反应性的区域。
程序Ⅱ.大量生产Gag-Env融合蛋白,确定与HIV抗体的反应性
对编码含上述程序Ⅰ所确定的表位区的部分Env肽的各种env基因片段以及编码Gag肽的各种gag基因片段来说,进行下述方法,以确定就改善产率和抗原性而言是理想的Gag-Env融合蛋白。更详细地说,关于env基因片段与gag基因片段的各种组合而言,将env基因片段融合到gag基因片段的下游,在启动子的调控下,env基因以与gag基因嵌合的形式表达,由此得到表达为Gag-Env融合蛋白的Env肽。
对于大量生产得到的Gag-Env融合蛋白,测定其与HIV抗体的反应性。
程序Ⅲ.验证具有Gag蛋白完整氨基酸序列的Gag蛋白p55的反应性与上述程序Ⅱ的方法相同,生产出Gag蛋白p55和Gag肽p17、p24和p15,使它们分别与HIV携带者的血清进行免疫学反应,并就与血清的反应性相互进行比较,从而证明p55在反应性和HIV检测比两方面活性最高。
下面对实施上述程序Ⅰ-Ⅲ的技术进行说明。
(1)制备包含gag基因和/或HIV的env基因的cDNA片段:
可利用gag基因和env基因的各自完整区域或片段。把完整区域或片段***进一高表达媒介中,使得***的读码与媒介读码相匹配。由于HIV基因组是由RNA组成的,因此当用重组体DNA技术进行基因表达时,有必要将上述HIV基因转变为互补DNA(cDNA)片段。cDNA可由整合到宿主细胞染色体的前病毒基因组制成或由克隆的外染色体环形DNA制成。另外,cDNA片段可由cDNA库筛选而得,所说的cDNA库是按常规方法,利用从HIV病毒颗粒中提取的RNA基因组为模板,在逆转录酶的作用下建立的。但是在上述制备cDNA片段的方法中,必须直接处理高度危险的HIV。从防止危害生物的观点看,直接处理HIV是不可取的。因此,为了避免在制备cDNA片段时由HIV引起的生物危害问题,同时还能节省人力,推荐利用已知已鉴定的HIV基因的cDNA克隆。关于HIV基因研究的情况,如基因克隆、制作限制图谱以及核苷顺序的测定,世界各地的研究者已发表了许多报告。为了保证安全和效率,希望能利用这些已公开的研究成果。例如,可以利用质粒如pNL3-1、pNL3-2和pNL4-3,它们均是HIV-1前病毒基因组克隆,并可由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)购得(关于pNL3-1和pNL3-2,可参见Journal of Virology,59,p284-291,1986,关于pNL4-3,请看Genbank data file HIVNL 43)。另外,如使用pNL4-3,已有培养并保藏的含各种载有HIV-1基因组部分区域的质粒的微生物。更详细地说,这些保藏的微生物有大肠杆菌(E.coli)JM109/pCV91,其质粒pCV91含gag-pol融合基因中心区域(保藏在日本发酵研究院,保藏号FERM BP3195),E.coli JM109/pNLH122,所含质粒pNLH122具有5′1/2gag基因(保藏于日本发酵研究院,保藏号FERM BP-3196),E.coli JM109/pTG581,其质粒pTG581含完整gag基因区(保藏在日本发酵研究院,保藏号FERN BP-3927),E.coli JM109/pNS210,其质粒pNS210含完整gag基因(保藏在日本发酵研究院,保藏号FERN BP-3920),E.coli JM109/pTE192,其质粒pTE192含有编码Env蛋白Env(512-611)区域的cDNA(保藏在日本发酵研究院,保藏号FERM BP-3925),E.coli JM109/pGE33,其质粒含负责编码由Gag(308-406)和Env(512-611)构成的Gag-Env融合蛋白的cDNA(保藏在日本发酵研究院,保藏号FERM BP-3923)。可以按照传统方法用上述克隆制备cDNA片段。例如,用限制酶切割上述克隆,再通过酚提取、氯仿处理、醇沉淀等技术提纯,从而制得所要求的DNA片段。用于切割DNA的限制酶可以根据每种克隆的限制图谱适当加以选择。
(2)gag基因、env基因和gag-env融合基因表达质粒的构成,***有这些质料的转化体的制备:
将前述方法制备而成的HIV基因cDNA片段按照传统方法,如利用T4DNA连接酶融合到一质粒或一媒介物的高表达基因上,以便直接表达克隆基因,由此构成了HIV基因表达质粒。在本发明中,使用术语“质粒”是为了说明上的方便,实质上,广义的指表达HIV基因的复制子。
因此,为构成这些表达质粒,可使用传统和商购的表达媒介物。适用的媒介物的实例包括肠细菌族的质粒媒介物pSN508系列(见US4,703,005),来源于酵母的质粒媒介物pJM105(见日本特许公开62-286930说明书),来源于酵母的质粒媒介物pBH103系列(见日本特许公开63-22098说明书),稀释了的水痘病毒媒介物(见日本特许公开53-41202),稀释了的Marek′s病病毒媒介物(见EP公开号334530),来源于大肠埃希杆菌(Escherichia coli)的质粒媒介物,如pUR290系列,包括pUR290、291和292(见EMBO Journal,2,P1791-1794,1983),pSN5182(见Journal of Bacteriology,157,P909-917,1984),以及pT7系列(见Proceedings of the National Academy of Sciences USA,82,P1074-1078,1985)。
在构成表达媒介物时,重要的是在一强启动子的调控下***和连接上述基因,并使该基因大量地与一确能表达的基因融合。例如,当采用上述pUR290系列媒介物时,最好将上述基因融合到lacZ基因的下游。当用pSN5182时,所说的基因最好融合到pstS基因的下游。当用上述pT7系列中的pT7-7时,所说的基因最好克隆进T7启动子下游的多克隆位点。
pT7-7特别适用于表达HIV gag基因、env基因和gag-env融合基因,它的T7启动子是一种很强的启动子,因此,本发明特别优选使用pT7-7。
在基因***和连接过程中,必需用BAP(细菌碱性磷酸酶)预处理经限制酶切割的质粒以脱去磷酸基,从而防止其自身连接,同时还必须使质粒中基因的读码与所***的基因读码彼此匹配以保证有效的翻译。这就是说,按照使HIV基因读码与高表达基因读码相匹配的方式把HIV基因***进一高表达基因,从而保证大量表达HIV基因。通过常规方法,利用酶如限制酶、核酸酶Bal 31和mung been核酸酶可以实现上述读码匹配。
为了得到转化体,将上述构成的表达媒介物引入一适宜的宿主细胞,所说的宿主细胞应从能将基因复制和表达在表达媒介物上的敏感宿主细胞中选择,特别是从容易引入且易于检测构成的表达媒介物的细胞中选择。例如,当利用上述pSN系列媒介物作表达媒介物时,大肠埃希杆菌菌株C75(保藏在日本发酵研究院,保藏号10191)是优选的宿主细菌,因为通过***上述媒介物获得的转化体可以以其抗药性为标识物而加以筛选。当用pUR290系列和PT7系列媒介物时,可采用大肠埃希杆菌菌株UT481(见Journal of Bacteriology,163(1),P376-384,1985)、大肠埃希杆菌菌株BL21(DE3)(见Journal of Molecular Biology,189(1),P113-130,1986)、大肠埃希杆菌菌株JM109(DE3)(见Journal of Molecular Biology,189(1),P113-130,1986;Gene,33(1),P103-119,1985),以及大肠埃希杆菌菌株JM103(见Nucleic Acids Research,9,P309-321,1981)。优选采用上述菌株的宿主细胞,因为由媒介体引入而得到的转化体可以以抗氨苄青霉素为标识物加以筛选。
可以用常规方法如氯化钾法把表达媒介物引入上述宿主细胞(见Journal of Molecular Biology,53,P154-162,1970)。从对上述标识物呈阳性的菌落中筛选出含引入gag基因、env基因或gag-env融合基因表达质粒的转化体,然后,从筛选出的转化体菌落中提取出表达媒介物DNA,用限制酶消化,再做琼脂糖凝胶电泳试验测定***的DNA片段尺寸。把经证明存在有基因DNA片段的菌落作为转化体克隆来表达HIV基因。(3)大量生产LacZ(β-半乳糖苷酶)-Env融合蛋白:
按照(2)给出的方法可以大量表达出LacZ-Env融合蛋白。例如,可以通过把负责编码下(5)所示各种Env肽的env基因片段(见表1)克隆进pUR290、pUR291或pUR292来大量表达融合蛋白。关于LacZ-Env融合蛋白,β-半乳糖苷酶有可能与一些无症状HIV携带者和末感染人体的血清发生反应,并显示出假阳性。但是,例如如果对试验血清进行预处理使抗LacZ抗体预吸附在带有LacZ蛋白的血清中,或者用抗LacZ抗体掩蔽融合蛋白上的LacZ部分,那么上述假阳性反应就可能消除,因此,可以用LacZ-Env融合蛋白作为诊断AIDS病的抗原。
(4)验证转化抗体克隆上gag基因,env基因和gag-env融合基因的表达:
通过按常规方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹法分析转化体克隆粗提物可以对上(2)获得的转化体克隆基因表达进行验证。可以按下述方法制备粗提物:用常规培养基培养转化体后,通过低速离心分离收集细菌细胞,用十二烷基硫酸钠(SDS)和2-巯基乙醇处理,接着高速离心分离,收集上清液。把上清液进行SDS-PAGE,使之分成多个蛋白质带。分开的蛋白质带用CBB(考马斯亮兰)着色以验证是否已经大量表达。当采用Western印迹法时,可以利用选出的各种不同商购材料,按下述常规方法步骤来验证是否已大量表达:上述粗提物进行DSD-PAGE,将分离开的蛋白质带借助转印迹细胞转移到硝基纤维膜或聚偏二氟乙烯膜上。将所说的膜浸渍在明胶溶液或脱脂乳溶液中,阻滞该膜。然后,例如,当膜上待检验的样品是HIV基因表达产物时,首先让它们与无症状HIV携带者的血清进行反应,然后洗涤试样,再让它们与过氧化物酶共轭的抗人体IgG抗体进行第二次反应。之后,再次洗涤试样,然后用过氧化氢和着色剂将它们着色,检测与HIV携带者血清有特异反应的蛋白质带,由此验证上述克隆上HIV gag基因、env基因和gag-env融合基因的表达。
(5)确定包含HIV抗体反应表位的局部Env肽区域:
例如,可以利用上述(3)所说的LacZ-Env融合蛋白反应性,通过上述(4)所说的Western印迹法进行测定。按照该方法,现已发现在图2-(1)至2-(3)所示的Env蛋白完整氨基酸序列上对HIV抗体反应的局部区域包括下述氨基酸序列区:
Env(14-244),Env(14-437),
Env(14-611),Env(175-363),
Env(224-510),Env(244-611),
Env(244-434),Env(244-437),
Env(244-772),Env(244-826),
Env(437-510),Env(437-611),
Env(437-722),Env(437-826),
Env(512-611),Env(512-699),
Env(610-722),Env(610-826)和
Env(721-826)。
在上述氨基酸序列中,下述序列对HIV抗体表现出特别强的反应性,并被确认为是含表位的Env蛋白:
Env(14-244),Env(244-434),
Env(244-510),Env(512-611),
Env(512-699),Env(610-722)和Env(721-826)。
在本发明中,从作为本发明HIV抗原要求Gag-Env融合蛋白具有良好的抗原性和产率的角度看,在上述7个氨基酸序列的表位区中,由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少一部分,即包含至少一个对HIV抗体有反应的表位的部分是可利用的。Env肽局部中所含的表位最好是由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
(6)确定用于构成Gag-Env融合蛋白的优选Gag肽:
在Gag-Env融合蛋白中,用Gag肽而非LacZ作为有效生产高产率Env肽的载体。因此,对于Gag肽来说,产率比抗原更重要。为此,在按照如上(2)所述方法构成gag基因表达媒介物后,按与上(4)相同的SDS-PAGE方法来测定Gag肽的产率。
现已发现下列氨基酸序列所代表的Gag肽能够成功地用来生产高产率Gag-Env融合蛋白:
Gag(1-119),Gag(1-132),Gag(1-154),
Gag(1-210),Gag(1-309),Gag(1-405),
Gag(1-406),Gag(1-437),Gag(1-500),
Gag(121-405),Gag(121-406),
Gag(121-437),Gag(308-405),
Gag(308-406),Gag(308-435),
Gag(308-436),Gag(308-437)和Gag(308-500)。
其中,Gag(308-437)是富集在大肠杆菌细胞中最多的氨基酸序列之一。因而其可用来确保本发明的Gag-Env融合蛋白高产。如上所述,在本发明中,Gag-Env融合蛋白上的Gag肽包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10个,优选至少30个,更优选至少50个,最优选至少70个相邻排列的氨基酸序列。作为Gag-Env融合蛋白上的Gag肽,最优选的肽是由Gag(308-406)或Gag(308-437)所代表的氨基酸序列。
(7)Gag-Env融合蛋白的生产:
优选的Gag-Env融合蛋白是由上述(6)中选出的一种Gag肽和上述(5)中选出的一种Env肽组成的。表达该融合蛋白的质粒如可按下述方法构成:根据上述(1)和(2)的方法,将负责编码上(5)所述一种Env肽的基因***一仅表达Gag肽,即上(6)中所述Gag肽的质粒中,或者***如用gag-pol融合基因制成的含gag基因的质粒中。gag基因与env基因的融合是以***的env基因读码与表达质粒中gag基因读码相匹配的方式进行的。可按传统方法,利用酶,如限制酶、核酸酶Bal 31和mung been核酸酶实现上述融合。在操作中,Gag肽和Env肽可以通过由几个氨基酸残基组成的接合链融合在一起。由于这样操作的结果,所说的接合链通常会连接在融合蛋白中,这是本领域所公知的。但是这并不会有害于本发明Gag-Env融合蛋白的抗原性。因此,表达“由Gag肽和Env肽组成的Gag-Env融合蛋白”和与之类似的表达应解释为包括由Gag肽、Env肽和一接合链(如果需要存在的话)组成的Gag-Env融合蛋白。可以按上(4)所述同样的方法来验证是否大量表达。
(8)通过培养已证明能进行gag基因或gag-env融合基因表达的转化体来生产Gag蛋白或Gag-Env融合蛋白:
例如,可以采用下述步骤:为了大量生产蛋白质,应制备待培养的转化体种菌,当转化体如为大肠杆菌时,先在LB培养基中于30°-40℃培养12-35小时直到大肠杆菌的细胞密度达到2×109-8×109细胞/毫升。然后,取1-10升该种菌接种在1000升新鲜的LB培养基中,分两步培养,即前期培养和后期培养。前期培养的目的是使种菌细胞增殖和复制表达媒介物,该培养在10°-40℃下进行1-24小时,最好在15°-37℃下进行2-12小时。例如,如果是大肠杆菌,当其细胞密度达到OD600nm为0.1-2.0时,中断前期培养。前期培养中止后,将得到的培养物进行后期培养。后期培养是在严格控制的条件下进行的。所说的条件是能够保证克隆在表达媒介中的基因的转录和翻译,同时还可以避免翻译所得基因产物受宿主细胞中蛋白分解酶的作用而无规分解和失活。后期培养的温度最好比前期的低,可在10°-40℃下培养1-40小时,最好是15°-37℃ 3-35℃。另外,考虑到所用表达媒介的特性,为了促进和诱导表达,如培养基中磷酸盐不足时,可以在后期培养一开始就向培养物中添加诱导剂[如IPTG(异丙基β-硫代半乳糖吡喃糖苷)]等。通过上述两步培养,Gag蛋白或Gag-Env融合蛋白一般可以以1-50毫克/升培养物的产率生成。在上述Gag肽和Env肽的各种组合中,能以高产率生产并表现出极高抗原性的融合蛋白是分别有下述氨基酸序列的Gag-Env融合蛋白:Gag(308-406)-Env(512-611),Gag(308-437)-Env(512-611)和Gag(308-406)-Env(512-699)。
(9)以高产率生产的Gag蛋白和Gag-Env融合蛋白的提纯:
可以综合使用常规方法实现提纯。例如,通过适当组合下述方法可以提纯蛋白质:(a)利用沉淀剂、离心和过滤等收集转化细胞;(b)通过超声处理,压力/真空处理和均质器等破碎转化细胞,制备粗提物,(c)用硅酸或活性碳吸附和解吸,盐析,用有机溶剂沉淀等进行提纯,并且通过超离心、柱色谱、电泳等分提达到高纯度;和(d)通过用硅酸或活性碳吸附和解吸及密度梯度离心(见日本特许公开63-297说明书)分提进行提纯。
因此,按照本发明的另一个方面,提供了一种生产基本纯的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原的方法,其中Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽构成的,该方法包括:
(a)将第一个脱氧核糖核苷酸序列连接到一可复制的表达媒介上,得到能够在宿主细胞中复制的第一个重组DNA分子,该分子包括所说的表达媒介物和所说的***在媒介上的第一个脱氧核糖核苷酸序列,
第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列的Gag肽,其中括号内的每一数值系图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号;
(b)将第二个脱氧核糖核苷酸序列连接到第一个重组DNA分子上的第一个脱氧核糖核苷酸的下游,使第二个序列融合在第一个序列上,
第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码包含至少一部分由Env(512-699)所代表的氨基酸序列的Env肽,该部分包括至少一个对HIV抗体有反应的表位,其中括号内的每一数值均为图2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号;
由此获得了第二个能在宿主细胞中复制的重组DNA分子,该分子包括表达媒介,第一个脱氧核糖核苷酸序列和融合在第一个序列下游的第二个脱氧核糖核苷酸序列;
(c)用第二个重组DNA分子将原核细胞或真核细胞转化成转化体;
(d)从未转化的原核细胞或真核细胞中选择出转化体;
(e)培养转化体使之产生含有Gag-Env融合蛋白的HIV抗原,其中Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽组成的;
(f)从培养的转化体中分离出含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原。
第二个脱氧核糖核苷酸序列最好负责编码由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
上述第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码包含有由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列的Gag肽。第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码下述Gag肽,即优选包含Gag(308-437)所代表氨基酸序列中的至少30个,更优选至少50个,最优选至少70个相邻排列的氨基酸序列的Gag肽。最好是,第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含Gag(308-406)或Gag(308-437)代表的氨基酸序列的Gag肽。
从提高Gag-Env融合蛋白抗原性和产率的角度考虑,要求第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含至少一部分Env(512-699)所代表的氨基酸序列的Env肽,所说的部分至少包括一个对HIV抗体有反应的表位。第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个,更好是至少10,最好是至少15个相邻排列的氨基酸序列。
表达媒介优选pT7系列或pUR290系列媒介,最好是pT7-7。
本发明方法中所得到的表达媒介可以以装在密封小容器如安瓿或小瓶中的形式,或以结合进宿主细胞的形式提供。
按照本发明的又一方面,提供了一种能在宿主细胞中复制的重组DNA分子,该分子包含***了第一个脱氧核糖核苷酸序列的表达媒介及融合在第一个序列下游的第二个脱氧核糖核苷酸序列,
第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含有由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10相邻排列的氨基酸序列的Gag肽,其中括号内的每一数值均系图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号,
第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含有至少一部分由Env(512-699)所代表的氨基酸序列的Env肽,所说的部分包括至少一个对HIV抗体有反应活性的表位,其中括号内的每一数值系图2-(1)至2-(3)所示HIV的Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号。
第二个脱氧核糖核苷酸序列最好负责编码由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
上述那些与生产本发明HIV抗原中Gag-Env融合蛋白方法有关的形式可以作为本发明重组DNA分子上第一和第二个脱氧核糖核苷酸序列的最佳形式。
表达媒介优选由pT7系列或pUR290系列媒介衍生而来的那些媒介。最好的表达媒介是pT7-7。
可以将用本发明重组DNA分子大量生产而得的Gag蛋白和Gag-Env融合蛋白以液体或干粉形式,或以吸附在滤纸或膜上的形式装入并密封在一小容器如安瓿或小瓶中。当本发明的抗原为液体时,可按预定的体积取出合理使用;当抗原为干物时,先将抗原溶解于蒸馏水中复水,使体积达到干燥前的原体积,然后取出预定的体积数使用;当抗原吸附在滤纸或膜上时,用适当的溶液水合抗原后再使用。
本发明还提供了一种通过免疫反应诊断后天免疫缺陷综合症的试剂,该试剂含有免疫学反应有效量的本发明的含Gag-Env融合蛋白和/或Gag蛋白的HIV抗原。
本发明还提供了一种后天免疫缺陷综合症疫苗,该疫苗包括有效免疫量的本发明的含Gag-Env融合蛋白和/或Gag蛋白的HIV抗原及至少一种药学可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂。
对成人一次给药的疫苗剂量一般为0.001-1000微克。
结合下述实例来更详细地说明本发明,这些实例不是对本发明范围的限制。
实例1
步骤1(能够表达LacZ-Env融合蛋白的质粒的构成)
首先用EcoRⅠ和Xhol消化HIV-1前病毒DNA克隆pNL4-3(见Journal of Virology,59,P284-291,1986;GenBank data file HIVNL 43;克隆pNL4-3购于美国国家卫生院),然后做琼脂糖凝胶电泳,由此得到3.1kb DNA片段[根据GenBank data file HIVNL 43,核苷酸编号5743-8887]。将得到的DNA片段克隆进已经过EcoRⅠ和SolⅠ消化及BAP处理的质粒pHSG398中,得到质粒pNS210。将获得的质粒pNS210用KpnⅠ消化,再做琼脂糖凝胶电泳,由此得到2.55kb DNA片段。将收集的DNA片段用HaeⅢ消化,然后再做琼脂糖凝胶电泳,由此得到大约570b HeaⅢ DNA片段[根据GenBank data file HIVNL 43,核苷酸编号7834-8400]。将所得DNA片段克隆进行已经用HincⅡ消化和BAP处理过的质粒pUR9中,得到质粒pEH22。将所得质粒pEH22用BamHⅠ和PstⅠ消化,得到大约580b DNA片段,再将所得DNA片段克隆进已用BamHⅠ和PstⅠ切割过的质粒pUR292中(见EMBO Journal,2,P1791-1794,1983),由此得到质粒pAS182(见表1)。用HindⅢ消化所得质粒pAS182,然后使之自身连接在一起,由此得到质粒pAS192(见表1)。用所得质粒pAS182和pAS192分别表达LacZ-Env(512-699)和LacZ-Env(512-611)融合蛋白。除了上述质粒外,还制成了表达各种LacZ-Env融合蛋白的其它15种质粒(见表1)。
步骤2(大量生产LacZ-Env融合蛋白)
将表1给出的包括质粒pAS182和pAS192在内的17种表达媒介引入大肠杆菌菌株JM103(见Nucleic Acids Research,9,P309-321,1981)。把所得大肠杆菌转化体分别接种在2毫升含20微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中,于37℃振荡培养过夜,得到培养物。取每种培养物0.05-0.1毫升接种到5毫升含20微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中,于37℃摇振培养。当细胞密度达到OD600nm0.5时,把IPTG加到培养物中至最终浓度为1mM,从而诱导表达融合蛋白。该培养物在37℃下摇振培养5小时,然后,通过离心从1.5毫升培养物中收获大肠杆菌细胞,将收获的细胞悬浮在120微升20mM Tris-HCl(PH7.5)中,得到一悬浊液。把60微升SDS-PAGE试样缓冲剂加到悬浊液中,混合均匀,将混合物在100℃下加热3分钟,并以12,000rpm转速离心5分钟,由此得到上清液。取7.5微升所得上清液加到SDS-PAGE凝胶中进行分离。用CBB将凝胶着色以验证融合蛋白的形成。如此,可以证明大量产生了17种LacZ-Env融合蛋白。
步骤3(通过HIV携带者血清中的Env抗体识别表位区,由此鉴定表位区)
采用与步骤2基本相同的方法,通过SDS-PAGE把已经大量生成了17种LacZ-Env融合蛋白(见表1)和LacZ蛋白的大肠杆菌中的所有蛋白质分离开,并电印迹(electroblotted)至一聚偏二氟乙烯膜上,印迹用脱脂乳(由美国Difco Laboratories得到)阻滞,并分别与血清A、B和C反应,这三个血清取自三例HIV携带者(无症状HIV携带者)并用含20mM Tris-HCl(PH7.5)、150mM NaCl和0.05%吐温20的缓冲剂稀释至100倍。在与血清反应前,已确认这些血清均不与LacZ反应。以过氧化物酶共轭的山羊抗人体IgG(Bio-Rad Laboratories,美国)为第二抗体。通过分析Western印迹结果(见表2),分别确定了由血清A、B和C中所含Env抗体认别的2、3和5个表位区(见表3)。能与血清A、B和C都发生反应的融合蛋白是含Env(512-611)氨基酸序列和/或Env(721-826)氨基酸序列的LacZ-Env融合蛋白。
步骤4(对LacZ-Env(512-611)和LacZ-Env(721-826)融合蛋白作为诊断用抗原的评价)
为了证明LacZ-Env(512-611)和LacZ-Env(721-826)融合蛋白可作为诊断用抗原,采用与步骤3基本相同的方法,用41例HIV携带者(具体地,36个无症状HIV携带者,1个ARC和4个AIDS病患者)的血清作了Western印迹试验。该试验结果与步骤3的3个无症状HIV携带者的试验结果一起列在表4中。LacZ-Env(512-611)与44例HIV携带者的血清均发生反应(100%),而LacZ-Env(721-826)仅与其中35个有反应(79%)。据此,认为Env(512-611)可作为诊断用抗原。Env(721-826)区不能单独用于诊断,可以与其它抗原结合使用,如与Env(512-611)区结合使用。由于39例无症状HIV携带者中仅有2例血清与LacZ(β-半乳糖苷酶)发生微弱反应,因此,把LacZ-Env融合蛋白用于诊断目的是不理想的。但是,如果按如上所述的传统方法将受试血清预处理,把抗LacZ抗体预吸附在含LacZ蛋白的血清中,LacZ-Env融合蛋白则可用于诊断目的。
步骤5(在T7启动子控制下构成能表达Env蛋白的质粒)
将合成的低聚核苷酸5′TATGGCTAAG3′和5′AATTCTTAGCCA3′退火并***质粒pT7-7中,该质粒是pT7系列(见Proceedings of the National Academy of Sciences USA,82,P1074-1078,1985)中的一种并已用NdeⅠ位点和EcoRⅠ消化过,由此得到质粒pT7-7-1。质粒pT7-7-1为这样一种质粒:即由于pT7-7上有多克隆位点,在NdeⅠ位点和EcoRⅠ位点之间***了一腺嘌呤残基(A)的核苷酸。用BamHⅠ和PstⅠ消化质粒pT7-7-1,并将由BamHⅠ和PstⅠ消化质粒pEH22(见步骤1)而得到的约580b片段克隆进质粒pT7-7-1中,由此得到质粒pTE182(见表5)。之后,用HindⅢ消化如此得到的质粒pTE182,并使之自身连接成为质粒pTE192(见表5)。质粒pNS210(见步骤1)用NdeⅠ消化,再进一步用BglⅡ部分消化,由此得到NdeⅠ-BglⅡ片段(根据GenBank data file HVNL 43,核苷酸编号6399-7611)。将如此所得NdeⅠ-BglⅡ片段克隆进已用NdeⅠ和BamHⅠ消化过的质粒pUR292(见步骤1)中,得到质粒pNB21。将所得质粒pNB21用BglⅡ和ClaⅠ消化得到约0.6kb片段。把该片段克隆进已用BamHⅠ和ClaⅠ消化过的质粒pT7-7中,得到质粒pTE311(见表5)。用所得质粒pTE182、pTE192和pTE311分别表达Env(512-699)、Env(512-611)和Env(244-437)。在T7启动子控制下能表达Env蛋白的质粒列在表5中。大肠杆菌BL21(DE3)用作表达宿主。该菌细胞的培养和蛋白质分析方法基本上与步骤2和3所述方法相同。由质粒pTE182、pTE192和pTE311所表达的Env蛋白与总的细胞蛋白之比值仅为1-2%。这说明既使从中选择一种质粒,以可接受的产率表达Env蛋白也是很困难的。
步骤6(在T7启动子控制下能表达Gag蛋白的质粒的构成)
用NdeⅠ和BclⅠ消化质粒pTG591(见日本特许公开4-117289说明书)得到大约1.6kb片段。将该片段克隆在均已用NdeⅠ和BamHⅠ消化过的质粒pT7-7和pTE-3a(见Methode in Enzymology,185,P60-89,1990)上,由此获得质粒pTG581和pEG581(见表6)。用这些质粒表达gag基因(p55)。
用ApaⅠ和ClaⅠ分别消化质粒pTG210、pTG110和pTG 591(见日本特许公开4-117289说明书),再用T4DNA聚合酶处理,使之自身连接起来,由此分别获得质粒pTG210-2、pTG110-2和pTG561(见表6)。这些质粒能分别表达Gag(308-405)、Gag(121-405)和Gag(1-405)。在T7启动子控制下能表达Gag蛋白的质粒列在了表6中。大肠杆菌BL21(DE3)用作表达宿主,其细胞培养和所得蛋白质分析基本按步骤2和3的方法进行。
步骤7(在T7启动子控制下能表达Gag-Env融合蛋白的质粒的构成)
质粒pAS192(见步骤1)用BamHⅠ消化,用T4DNA聚合酶处理,再用ClaⅠ消化,随后做琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶上回收312b片段。将该片段克隆在质粒pTG210(见日本特许公开4-117289)上得到质粒pGE33(见表7),其中质粒pTG210是已用ApaⅠ消化,T4DNA聚合酶处理及ClaⅠ消化过的。把所得质粒pGE33用HindⅢ消化,再做琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶中回收约600b片段。该片段克隆在质粒pTG110和pTG591(见日本特许公开4-117289说明书)上,其中所说的质粒均已用HindⅢ消化和BAP处理过,由此得到质粒pGE1133和pGE5633(见表7)。用所得质粒pGE33、pGE1133和pGE5633分别表达融合蛋白Gag(308-406)-Env(512-611)和Gag(121-406)-Env(512-611)和Gag(1-406)-Env(512-611)。
质粒pT7-7-1(见步骤5)多克隆位点中的BamHⅠ位和HindⅢ位之间的核苷酸序列用质粒pUR292(见步骤1)的序列代替,得到质粒pT7-29-1。将所得pT7-29-1用BamHⅠ消化,T4DNA聚合酶处理,并使之自身连接在一起,由此获得质粒pT7-29-14。上述质粒pGE33用HindⅢ消化得到0.6kb片段,将此片段克隆在已用HindⅢ消化和BAP处理过的质粒pT7-29-14上,由此得到质粒pGE2133。
质粒pAS182(见步骤1)用BamHⅠ和ClaⅠ消化,得到大约590b片段。将此片段克隆在均已用BamHⅠ和ClaⅠ消化过的质粒pGE2133和pGE1133上,得到质粒pGE218和pGE118(见表7)。质粒pGE218和pGE118分别表达融合蛋白Gag(308-406)-Env(512-699)和Gag(121-406)-Env(512-699)。
质粒pT7-7(见步骤5)用BglⅡ消化,T4DNA聚合酶处理,并自身连接,得到质粒pT7-7(BglⅡx)。质粒pTG210(见日本特许公开4-117289说明书)用NdeⅠ和ClaⅠ消化得到大约1kb片段。将此片段克隆在已用NdelⅠ和ClaⅠ消化过的质粒pT7-7(BglⅡx)上,由此得到pTG210X。
质粒pAS192(见步骤1)用BamHⅠ和ClaⅠ消化,得到310b片段。将此片段克隆在已用BglⅡ和ClaⅠ消化过的质粒pTG210X上,由此得到质粒pGE31(见表7)。质粒pGE31表达融合蛋白Gag(308-437)-Env(512-611)。
在T7启动子控制下能表达Gag-Env融合蛋白的质粒列在了表6中。大肠杆菌菌株BL21(DE3)用作表达宿主。为了大量生产融合蛋白而进行的大肠杆菌细胞培养及蛋白质分析方法与步骤2和3基本相同。
将已产生了表7所列融合蛋白的大肠杆菌细胞中的总细胞蛋白通过SDS-PAGE分开,凝胶用CBB着色。通过光密度计扫描凝胶测出所得融合蛋白与总细胞蛋白之比值。用质粒pGE33、pGE218和pGE31表达融合蛋白具有最高的比值,约为20%。步骤8(Gag-Env融合蛋白对HIV抗体反应性的构成)
步骤7所构成的质粒pGE33、pGE31和pGE218在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达大量的Gag-Env融合蛋白。在这些融合蛋白中,产量特别高的蛋白是由pGE33表达的Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白。为了证明该融合蛋白作为诊断用抗原的用途,就该融合蛋白与41例HIV携带者(36例无症状HIV携带者,1例ARC和4例AIDS病患者)血清的反应一一作了研究,方法为常规的Western印迹法,与步骤2和3基本相同(见表8)。结果发现在41例携带者的血清中均能检测到Env抗体,因此保证了该融合蛋白作为诊断用抗原的用途。
步骤9(Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白的提纯)
把250毫升已大量产生Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21(DE3)的培养物在5,000rpm下离心10分钟,收获该菌细胞。将收获的细胞悬浮在10毫升含50mM Tris-HCl(pH7.5)和10mM 2-巯基乙醇的缓冲液中,对所得悬浊液作超声处理以使细胞破碎。当该破碎物以19,000rpm离心30分钟时,Gag-Env融合蛋白沉积在沉淀物中。去掉上清液,再将沉淀物悬浮在10毫升含50mM Tris-HCl(PH7.5)和10mM 2-巯基乙醇的缓冲液中。向该悬浊液中添加5毫升SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)试样缓冲剂,混合均匀,在100℃下加热5分钟。该加热后的混合物在12,000rpm下离心5分钟,取2毫升(每批)上清液加到491型PrepCell(由Bio-Red Laboratories得到,美国)的SDS-PAGE凝胶上,在40mA下做电泳。以速度为1毫升/分钟,分提量为2.5毫升/分提的条件进行色谱分离,由此收集含Gag-Env融合蛋白的峰溜分。
将峰溜分浓缩大约20倍,此浓缩物进行SDS-PAGE,然后用CBB着色。
结果发现融合蛋白的纯度很高,观察不到其它蛋白质带。
从1升大肠杆菌培养物中能得到大约5毫克纯的Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白。
步骤10(纯Gag-Env融合蛋白作为诊断用抗原)
将步骤9所得纯的Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白制品稀释,把此稀释物点在聚偏二氟乙烯膜上,使融合蛋白每个点的量分别为10、20、40、80、160和320ng。用脱脂乳阻滞各点,并与55例HIV携带者(具体地,50例无症状HIV携带者,1例ARC和4例AIDS病患者)及84例未感染个体(健康个体)的每例血清反应,血清已先用含20mM Tris-HCl(PH7.5)、150mM NaCl和0.05%吐温20的缓冲液稀释了100倍。以过氧化物酶共轭的山羊抗人体IgG(由Bio-Red Laboratories获得,美国)为第二抗体,用传统方法进行着色反应。上述点印迹试验结果列在表9中。
20ng这样少量的融合蛋白与全部55例HIV携带者的血清发生了特异性反应,甚至5ng融合蛋白与除2例无症状HIV携带者外的全部HIV携带者的血清发生了反应。而高达320ng的融合蛋白与84例健康者的血清之间即未发现特异性反应也未观察到非特异性反应。由此结果可以判断,纯的融合蛋白表现出极高的特异性及与血清的广谱反应性,由此确保了该蛋白质作为诊断用抗原的用途。
实例2
步骤1(生产高纯度Gag蛋白p55)
把已经大量生成了Gag蛋白p55的大肠杆菌转化体BL21(DE3)/pTG581培养物在5,000rpm下离心10分钟,收获细胞。将收获的细胞悬浮在含20mM磷酸钠(PH6.9)和10mM 2-巯基乙醇的磷酸盐缓冲液中,该缓冲液的体积是上述培养物体积的1/50,所得悬浊物进行超声处理以破碎细胞。所得细胞破碎物在19,000rpm下离心60分钟,以获得含p55的上清液。此上清液用20%饱和硫酸铵处理形成沉淀物。将此沉淀物溶解在如上限定的但含8M尿素的磷酸盐缓冲液中。让此溶液流经S-Sepharose柱(Pharmacia Fine Chemicals AB制造和销售,瑞典),该柱用上述同样的磷酸盐缓冲液平衡过。向该柱加含氯化钠且其浓度梯度为0-1M的缓冲液进行洗脱,得到p55洗脱液部分,将这些p55洗脱液部分汇集起来,汇集部分用如上限定的磷酸盐缓冲液且含300mM氯化钠进行渗析,随后在19,000rpm下离心20分钟。让所得上清液通过Heparing-Sepharose CL-6B柱(Pharmacia Fine Chemicals AB制造和销售,瑞典),该柱已用上述磷酸盐缓冲液平衡。向该柱加含氯化钠且其浓度梯度为0-1M的缓冲液进行洗脱,由此得到p55洗脱液部分。将所得p55洗脱液部分汇集,然后浓缩。向此浓缩物中添加SDS-PAGE试样缓冲剂,混合均匀。把混合物加到Prep Cell的SDS-PAGE凝胶上。按实例1步骤9的同样条件进行色谱分离。将所得p55溜分浓缩大约20倍,再将此浓缩物进行SDS-PAGE,之后用CBB着色。发现p55纯度很高,未观察到任何其它蛋白质带。
步骤2(Gag蛋白p17.p24和p15及完整Gag蛋白p55各自与HIV携带者血清的反应性,Gag蛋白已通过大肠杆菌大量生产并高度提纯)
按照与实例1步骤10基本相同的方法,把高纯度HIV-1Gag蛋白p17、p24、p15(见WO91/18990)和p55(见实例2步骤1)分别点加在聚偏二氟乙烯膜上,并分别与40例HIV携带者(具体说,35例无症状HIV携带者,1例ARC和4例AIDS病患者)和10例未感染者(健康个体)的血清反应。用基本与实例1步骤10相同的方法进行血清反应和着色反应。研究结果列在表10中。Gag蛋白p17、p24和p15分别能检测出92.5%(37/40)、87.5%(35/40)和85%(34/40)携带者中的特异抗体。Gag蛋白p55与全部40例HIV携带者的血清发生特异性反应,而且其反应比p17、p24和p15要强。尤其是注意到,其中1例无症状携带者的血清只与p55有反应,而Gag蛋白p17、p24和p15无一与之反应。反应性最弱的Gag蛋白是p15。
Gag蛋白p17.p24和p55与ARC和AIDS病患者血清的反应性比无症状HIV携带者血清的反应性要弱。这一现象在p15上未观察到。对10例健康者,均未发生反应。
由上述结果可以看出,Gag蛋白p55是筛选HIV感染最好的Gag抗原。
表1 表达LacZ-Env融合蛋白的质粒
质粒 5'克隆 5'克隆位点 3'克隆位点 3'克隆 产物**
位点*的核苷酸 的核苷酸 位点*
编号*编号*
pAS160 KpnI 6343 7031 BglII LacZ-Env(14-244)
pAS210 KpnI 6343 7611 BglII LacZ-Env(14-437)
pAS200 KpnI 6343 8131 HindIII LacZ-Env(14-611)
pAS172 Stul 6822 7391 Scal LacZ-Env(175-363)
pAS220 HaeIII 6969 7834 HaeIII LacZ-Env(224-510)
pAS311 BglII 7031 7611 BglII LacZ-Env(244-437)
pAS331 BglII 7031 8131 HindIII LacZ-Env(244-611)
pAS111 BglII 7031 8465 BamHI LacZ-Env(244-722)
pAS131 BglII 7031 8887 XhoI LacZ-Env(244-826)
pAS342 BglII 7611 8131 HindIII LacZ-Env(437-611)
pAS122 BglII 7611 8465 BamHI LacZ-Env(437-722)
pAS142 BglII 7611 8887 XhoI LacZ-Env(437-826)
pAS192 HaeIII 7834 8131 HindIII LacZ-Env(512-611)
pAS182 HaeIII 7834 8400 HaeIII LacZ-Env(512-699)
pAS351 HindIII 8131 8465 BamHI LacZ-Env(610-722)
pAS151 HindIII 8131 8887 XhoI LacZ-Env(610-826)
pAS451 BamHI 8465 8887 XhoI LacZ-Env(721-826)
*核苷酸序列及其编号来自Genbank data file HIVNL43。
**括号内的数为由Env蛋白(gb160)N-末端计数的氨基酸编号。
表2 LacZ-Env融合蛋白与三例HIV携带者血清通过Western印迹试验显示的反应性
质粒 产物 血清 A 血清 B 血清 C
pUR290 LacZ - - -
pAS160 LacZ-Env(14-244) - - +
pAS210 LacZ-Env(14-437) - - +
pAS200 LacZ-Env(14-611) + + +
pAS172 LacZ-Env(175-363) - - +
pAS220 LacZ-Env(224-510) - + +
pAS311 LacZ-Env(244-437) - - +
pAS331 LacZ-Env(244-611) + + +
pAS111 LacZ-Env(244-722) + + +
pAS131 LacZ-Env(244-826) + + +
pAS342 LacZ-Env(437-611) + + +
pAS122 LacZ-Env(437-722) + + +
pAS142 LacZ-Env(437-826) + + +
pAS192 LacZ-Env(512-611) + + +
pAS182 LacZ-Env(512-699) + + +
pAS351 LacZ-Env(610-722) - - +
pAS351 LacZ-Env(610-826) + + +
pAS451 LacZ-Env(721-826) + + +
表3 确定Env蛋白上的表位区
血清 A 血清 B 血清 C
Env(14-244)
Env(224-510)
Env(244-437)
确定的表位区 Env(512-611) Env(512-611) Env(512-611)
Env(610-722)
Env(721-826) Env(721-826) Env(721-826)
表4 检测HIV携带者血清中的Env抗体
抗原 血清 + ± - 总计
AC 39 - - 39
LacZ-Env(512-611) ARC 1 - - 1
AIDS 4 - - 4
AC 34 3 2 39
LacZ-Env(721-826) ARC - 1 - 1
AIDS 1 3 - 4
表5 表达HIV-1 Env蛋白的质粒
质粒 5'克隆 5'克隆位点 3'克隆位点 3'克隆 产物**
位点*的核苷酸 的核苷酸 位点*
编号*编号*
pTE160 KpnI 6343 7031 BglII Env(14-244)
pTE210 KpnI 6343 7611 BglII Env(14-437)
pTE200 KpnI 6343 8131 HindIII Env(14-611)
pTE172 Stul 6822 7391 Scal Env(175-363)
pTE17-2 Stul 6822 7391 Scal Env(175-363)
pTE220 HaeIII 6969 7834 HaeIII Env(224-510)
pTE311 BglII 7031 7611 BglII Env(244-437)
pTE342 BglII 7611 8131 HindIII Env(437-611)
pTS23 BglII 7611 8887 XhoI Env(437-826)
pTE192 HaeIII 7834 8132 HindIII Env(512-611)
pTE18-192 HaeIII 7834 8131 HindIII Env(512-611)
pTE182 HaeIII 7834 8400 HaeIII Env(512-699)
pTE18-182 HaeIII 7834 8400 HaeIII Env(512-699)
pTS45 BamHI 8465 8887 Xhol Env(721-826)
*核苷酸序列及其编号来自Genbank data file HIVNL43。
**括号内的数为从Env蛋白(gb160)N-末端计数的氨基酸编号。
既使选择一种适宜的质粒,以可接受的产率单独表达Env蛋白也是困难的。
表6 表达HIV-1 Gag蛋白的质粒
质粒 5'克隆 5'克隆位点 3'克隆位点 3'克隆 产物***
位点*的核苷酸 的核苷酸 位点*
编号*编号*
pTG581 NdeI**787 2429 BclI Gag(1-500)
pTG581 NdeI**787 2429 BclI Gag(1-500)
pTG571 NdeI**787 2096 BglII Gag(1-437)
pEG571 NdeI**787 2096 BglII Gag(1-437)
pTG561 NdeI**787 2006 ApaI Gag(1-405)
pTG551 NdeI**787 1712 HindIII Gag(1-309)
pTG541 NdeI**787 1415 PstI Gag(1-210)
pTG531 NdeI**787 1247 NsiI Gag(1-154)
pTG207 NdeI**787 1415 PstI Gag(1-132)****
pTG521 NdeI**787 1145 PVuII Gag(1-119)
pTG121 PvuII 1145 2096 BglII Gag(121-437)
pTG110-2 PvuII 1145 2006 ApaI Gag(121-405)
pTG212 HindIII 1712 2429 BclI Gag(308-500)
pTG221 HindIII 1712 2096 BglII Gag(308K-437)
pTG210-2 HindIII 1712 2006 ApaI Gag(308-405)
*核苷酸序列及其编号来自Genbank data file HIVNL43。
**通过试管诱变把NdeⅠ引入在gag基因的起始密码子上。
***括号内的数为从Gag蛋白(p55)N-末端计数的氨基酸编号。
****在p24的第一个密码子上引入终止密码子,使之表达p17。
表7 表达Gag-Env融合蛋白的质粒
质粒 产物
Gag 蛋白质区 Env 蛋白质区
(a.a.) (a.a.)
pGE216 308-406 14-244
pGE116 121-406 14-244
pGE221 308-406 14-437
pGE217 308-406 175-363
pGE117 121-406 175-363
pGE231 308-406 244-437
pGE131 121-406 244-437
pGE223 308-406 437-510
pGE123 121-406 437-510
pGE523 1-406 437-510
pGE2134 308-406 437-611
pGE1134 121-406 437-611
pGE5634 1-406 437-611
pGE271 1-119 437-611
pGE2112 308-406 437-722
pGE1112 121-406 437-722
pGE5612 1-406 437-722
pGE2142 308-406 437-826
pGE1142 121-406 437-826
pGE5642 1-406 437-826
pGE30 308-436 437-826
pGE33 308-406 512-611
pGE1133 121-406 512-611
pGE5633 1-406 512-611
pGE281 1-119 512-611
pGE31 308-437 512-611
pGE218 308-406 512-699
pGE118 121-406 512-699
pGE280 1-119 512-699
pGE34 308-406 721-826
pGE1145 121-406 721-826
pGE5645 1-406 721-826
pGE290 1-119 721-826
pGE32 308-435 723-826
表8 Gag-Env融合蛋白与HIV携带者血清的Western印迹试验
抗原 血清 + ± - 总计
AC 36 - - 36
Gag(308-406)-Env(512-611) ARC 1 - - 1
AIDS 4 - - 4
表9 纯Gag-Env融合蛋白与HIV-1携带者和未感染者
血清的反应性
血清 - + ++ +++ 总计
AC 0 1 1 53 55
ARC 0 0 0 1 1
AIDS 0 0 0 4 4
未感染个体 84 0 0 0 84
(健康个体)
-:与320ng纯融合蛋白不发生反应。
+、++、+++:与至少20ng、至少10ng和至少5ng发生反应
表10 Gag蛋白与HIV-1携带者血清抗体的反应性
(A)检测HIV携带者血清中的抗-p55抗体
与至少量反应的 反应的 测试的
血清 320 160 80 40 20 10 5(ng)
AC 3 2 3 27 35 35
ARC 1 1 1
AIDS 3 1 4 4
(B)检测HIV-1携带者血清中的抗-p17抗体
与至少量反应的 反应的 测试的
血清 320 160 80 40 20 10 5(ng)
AC 1 5 3 8 11 5 33 35
ARC 1 1 1
AIDS 2 1 3 4
(C)检测HIV-1携带者血清中的抗-p24抗体
与至少量反应的 反应的 测试的
血清 320 160 80 40 20 10 5(ng)
AC 4 2 4 6 9 3 3 31 35
ARC 0 1
AIDS 1 1 2 4 4
(D)检测HIV-1携带者血清中的抗-p15抗体
与至少量反应的 反应的 测试的
血清 320 160 80 40 20 10 5(ng)
AC 1 2 8 16 3 30 35
ARC 1 1 1
AIDS 1 2 3 4
Claims (14)
1、一种基本纯的HIV抗原,该抗原包含Gag-Env融合蛋白,其中所说的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽组成的,
所说的Gag肽包含Gag(308-437)所代表氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列,其中括号内的每一数值均系图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号,
所说的Env肽包含至少一部分Env(512-699)所代表的氨基酸序列,所说的部分包括至少一个对HIV抗体有反应的表位,其中括号内的每一数值均为图2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号。
2、根据权利要求1的HIV抗原,其中在所说部分Env肽中包含的表位是Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
3、一种HIV抗原,该抗原包括权利要求1的HIV抗原与含Gag(1-500)所代表的氨基酸序列的Gag蛋白的混合物,所说的氨基酸序列为图1-(1)至1-(2)所示的Gag蛋白的氨基酸序列,其中括号内的每一数值均为图1-(1)至1-(2)中的氨基酸的位置编号。
4、一种基本纯的HIV抗原,该抗原包括以基本分离形式存在的含Gag(1-500)所代表氨基酸序列的Gag蛋白,所说的氨基酸序列为图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白的完整氨基酸序列,其中括号内的每一数值均为图1-(1)至1-(2)中氨基酸的位置编号。
5、一种生产基本纯的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原的方法,其中所说的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽组成的,该方法包括:
(a)将第一个脱氧核糖核苷酸序列连接到可复制的表达媒介上以获得能够在宿主细胞中复制的第一个重组DNA分子,该分子包含所说的表达媒介和***在该媒介上的所说的第一个脱氧核糖核苷酸序列,
所说的第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含有Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列的Gag肽,其中括号内的每一数值均为图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号;
(b)把第二个脱氧核糖核苷酸序列连接到所说的第一个重组DNA分子上的第一个脱氧核糖核苷酸序列的下游,使所说的第二个序列融合到所说的第一个序列上,
所说的第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含有至少一部分Env(512-699)所代表氨基酸序列的Env肽,所说的部分包括至少一个对HIV抗体有反应的表位,其中括号内的每一数值均为图2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号,
由此获得第二个能在宿主细胞中复制的重组DNA分子,该分子包含所说的表达媒介,所说的第一个脱氧核糖核苷酸序列以及融合在该序列下游的第二个脱氧核糖核苷酸序列;
(c)用所说的第二个重组DNA分子转化原核细胞或真核细胞以制备成转化体;
(d)从未转化的原核细胞和真核细胞中选择出转化体;
(e)培养转化体以生产含有Gag-Env融合蛋白的HIV抗原,其中所说的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在所说的Env肽上的Gag肽组成的;
(f)从所培养的转化体中分离出所说的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原。
6、根据权利要求5的方法,其中所说的第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码Env(512-699)代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
7、根据权利要求5或6的方法,其中所说的表达媒介是由pT7系列或pUR290系列媒介得到的。
8、根据权利要求7的方法,其中所说的由pT7系列得到的表达媒介是pT7-7。
9、一种能够在宿主细胞中复制的重组DNA分子,其包含已***有第一个脱氧核糖核苷酸序列的可复制表达媒介以及融合在所说第一个序列下游的第二个脱氧核糖核苷酸序列,
所说的第一个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含Gag(308-437)代表的氨基酸序列中的至少10个相邻排列的氨基酸序列的Gag肽,其中括号内的每一数值均是图1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号,
所说的第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码含有至少一部分Env(512-699)代表的氨基酸序列的Env肽,所说的部分包括至少一个对HIV抗体有反应的表位,其中括号内的每一数值均为图2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置编号。
10、根据权利要求9的重组DNA分子,其中所说的第二个脱氧核糖核苷酸序列负责编码Env(512-699)代表的氨基酸序列中的至少5个相邻排列的氨基酸序列。
11、根据权利要求9或10的重组DNA分子,其中所说的表达媒介来源于pT7系列或pUR290系列媒介。
12、根据权利要求11的重组DNA分子,其中所说的来源于pT7系列的表达媒介是pT7-7。
13、一种通过免疫学反应诊断后天免疫缺陷综合症用的试剂,其含有免疫学反应有效量的权利要求1-4任何之一的HIV抗原。
14、一种后天免疫缺陷综合症疫苗,其包括有效免疫量的权利要求1-4任何之一的HIV抗原以及至少一种药学可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6025141A (en) * | 1993-12-10 | 2000-02-15 | The Canadian Red Cross Society | Immunofluorescence assay for the detection of antibodies using recombinant antigens in insoluble form |
DE4411718A1 (de) * | 1994-04-05 | 1995-10-12 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | RFB-Retrovirusgenom |
EP0907740A1 (en) * | 1997-01-02 | 1999-04-14 | Universidade Federal De Minas Gerais | THE PROCESS FOR EXPRESSION AND PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEIN HYBRID PROTEIN (p24/p17) DERIVED FROM HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUSES (HIV-1) |
WO1998043669A1 (en) * | 1997-04-03 | 1998-10-08 | Thomas Jefferson University | Chimeric viral proteins |
MXPA02006379A (es) * | 1999-12-23 | 2004-06-21 | Medical Res Council | Mejoriasen o relacionadas con la respuesta inmune a vih. |
EP1409694A4 (en) * | 2001-07-05 | 2006-02-08 | Chiron Corp | POLYNUCLEOTIDES ENCODING ANTIGENIC POLYPEPTIDES OF HIV SUBTYPE B AND / OR SUBTYPE C, POLYPEPTIDES AND USES THEREOF |
US7786288B2 (en) * | 2003-10-23 | 2010-08-31 | Karp Nelson M | Immunizing compositions encoding an epitope obtained from the HIV-1 capsid protein cyclophilin A binding site |
FR2874612A1 (fr) * | 2004-08-27 | 2006-03-03 | Commissariat Energie Atomique | Epitotes t cd4+ du vih restreints a hla-dp4 et leurs applications |
EP2309269B1 (en) * | 2004-09-08 | 2016-10-26 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Compositions and methods for the detection of HIV-1/HIV-2 infection. |
KR101138930B1 (ko) * | 2007-02-16 | 2012-04-25 | (주) 에빅스젠 | Hⅰv nc 단백질을 포함하는 aⅰds 예방 및 치료용조성물 |
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Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3688051T2 (de) * | 1985-12-17 | 1993-06-24 | Akzo Nv | Immunochemisches reagenz. |
US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
PT88416B (pt) * | 1987-09-04 | 1992-10-30 | Wellcome Found | Processo para determinacao imunologica de anticorpos e processo para a preparacao de uma proteina com capacidade de ligacao a anticorpos e de composicoes farmaceuticas que a contem |
JPH01179687A (ja) * | 1987-12-30 | 1989-07-17 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Hiv融合蛋白質 |
IL90048A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Merck & Co Inc | Recombinant gag precursor of hiv,its preparation and its use as aids vaccine |
EP0343132B1 (en) * | 1988-05-06 | 1994-08-17 | Ferropas Ag | Methods and systems for producing HIV antigens |
CA2003383A1 (en) * | 1988-11-23 | 1990-05-23 | Sushil G. Devare | Synthetic dna derived recombinant hiv antigens |
JPH04500308A (ja) | 1989-05-17 | 1992-01-23 | リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド | 組換え型生成物のレトロウィルス媒介分泌 |
EP0449116B2 (en) * | 1990-03-21 | 2004-08-25 | Geneart GmbH | DNA sequences encoding modified retroviral gag polypeptides and vaccines containing them or aggregates thereof |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101475642B (zh) * | 2008-11-07 | 2013-06-05 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 一种艾滋病毒重组抗原及其融合蛋白 |
Also Published As
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