CN107941777B - 一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微*** - Google Patents

一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器。本发明利用时域聚焦特性，只在时域聚焦平面产生样品的荧光激发，并同时实现对整个时域聚焦平面内荧光的激发。因此，本发明与原有技术相比，能够避免对非聚焦平面内样品的漂白，并能够有效提高SMS荧光显微技术的工作效率。

Description

一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***
技术领域
本发明涉及光学仪器领域、生物医学显微成像领域，具体涉及一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***及方法。
背景技术
目前在生物医药领域的研究对显微***分辨率的要求越来越高，研究人员需要了解各种微小形态物质的三维结构，然而传统白光宽场显微镜和激光共聚焦显微镜的光斑尺寸无法达到这样的分辨率，而超分辨显微***的出现完美地解决了这个问题。在超分辨显微技术中，目前的研究热点大多集中于各类荧光显微技术方面，诸如受激发射损耗(STED)荧光显微技术和单分子定位荧光显微技术(SMS)等。与STED荧光显微技术相比，SMS荧光显微技术的光路设计、机械结构都较为简单，无需多光束的合束，因此实际使用较广泛。SMS荧光显微技术的基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上万次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位。
E.Betzig等人在期刊Science第313期的文章Imaging IntracellularFluorescent Proteins at Nanometer Resolution中提到采用宽场照明和连续激光作为光源简化SMS荧光显微***的结构。但是，如果要对样品实现大深度的三维成像(成像范围在深度方向上大于1μm)时，需要结合微位移台改变样品的高度来实现。在这种工作模式下，由于在整个成像过程中，整个样品，包括处在非观测平面的区域内的荧光蛋白都会被激发。非观测平面荧光蛋白被长期激发，会导致荧光蛋白失去活性，被漂白。当微位移平台继续移动，使原来的非观测观测区域成为成像平面后，由于之前荧光蛋白已经被漂白，该成像平面将无法实现荧光蛋白再激发、成像的过程。该问题在利用SMS荧光显微技术进行深层组织成像时尤为明显。因此，现有的三维SMS并不能很好的满足实际的需求。
发明内容
本发明针对之前三维SMS荧光显微技术在进行深度方向扫描时，存在的荧光蛋白分子被漂白等问题，提出了一种新型的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***。该***利用时域聚焦特性，不漂白非聚焦平面的荧光蛋白分子，结构简单，并且通用性好、也可用于二维成像。
一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、可正对物镜往复移动的样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器；
所述第一激光器出射的激光经过扩束准直单元扩束准直后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射后照射至第二二色镜；
所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器并经第二二色镜透射的激光合束，经过第三透镜、第一二色镜后被聚焦在物镜的后焦平面处，宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；
所述第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；
所述样品台移动时，物镜出射的激光的时域聚焦平面处于样品的不同深度，激发样品不同深度处的荧光，实现对样品中被激活的荧光标记的逐层扫描；
所述样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，然后被第一二色镜反射后，再依次通过滤光片、第四透镜，最后被探测器接收并成像。
本发明的探测器得到的多个荧光图像，一般需要信号处理单元对探测器接收的每个时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，获得整个样品的三维超分辨结构。所述信号处理单元可以是为本发明三维超分辨显微***专配的单一拼接图像处理器也可以直接采用现有的工业计算机。当然，为便于研究和分析，本发明的三维超分辨显微***还可以包括具有图像显示功能、或者/和参数设置或者/和命令输入等功能的显示器，可以是为本发明三维超分辨显微***专配的显示器，也可以直接采用现有的工业计算机配套的显示器等。所述拼接操作为现有技术，可通过现有的软件或者编程实现。
作为优选，所述扩束准直单元包括同轴设置的第一透镜和第二透镜，第一透镜和第二透镜共焦放置，第一透镜靠近第一激光器设置，且第一透镜焦距小于第二透镜。本发明中，所述第一透镜和第二透镜用于将激光光束扩束准直，使得激光光束直径变大，发散角变小，更接近于平行光，有利于激光光束会聚形成更小的光斑；第一透镜和第二透镜一般选择凸透镜。
本发明中，所述的时域聚焦，是指单个飞秒脉冲的所有频率仅在物镜的聚焦平面上重和，并且彼此同相位，从而使脉冲在时域上的宽度极窄的聚焦效应；即时域聚焦时，将聚焦于整个聚焦平面，并且焦深极小，只激发样品位于时域聚焦平面内极薄层的荧光。
本发明的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***的一次工作循环包含以下步骤：
步骤A：所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器的激光合束，经过第三透镜、第一二色镜后进入物镜，宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；
步骤B：所述第一激光器出射的激光经过第一透镜、第二透镜后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射；经过相位光栅反射后的激光经过第二二色镜、第三透镜和第一二色镜后，被聚焦到物镜的后焦平面处；第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；结合样品台的相对物镜移动，物镜出射的激光的时域聚焦平面可处于样品的不同深度，激发样品不同深度处的荧光，实现对步骤A中样品中被激活的荧光标记的逐层扫描；样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，之后被第一二色镜反射；被反射的荧光依次通过滤光片、第四透镜，被探测器接收并成像；
步骤C：所述第二激光器出射的激光持续照射样品，直到将步骤A中激活的样品内部分的荧光标记漂白为止；
重复步骤A、B、C的工作循环，直到样品中所有的分子被定位成像；最后经过信号处理单元对探测器接收的每个时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，获得整个样品的三维超分辨结构。
通过控制第二激光器的出射光强(小于1毫瓦)，控制被重新激活的荧光标记的比例(<<1％)。
作为优选，本发明中，所述第一激光器为飞秒激光器，出射的激光强度大，脉冲宽度为飞秒量级，出射激光的光谱带宽为10纳米。
作为进一步优选，所述第一激光器为钛蓝宝石飞秒激光器，最终输出峰值波长为830纳米，光谱带宽为10纳米，脉冲宽度小于100飞秒，输出平均功率为1.5瓦。采用该技术方案，可以在保证双光子激发效率的同时，减少对于非成像平面荧光标记的漂白，改善***在整个三维成像区域的成像质量。
作为优选，本发明中，所述的第二激光器为连续光激光器。作为进一步优选，所述第二激光器为连续光半导体激光器，输出波长为405纳米。
本发明中，所述相位光栅用于调节第一激光器出射激光的相位，使得激光光束中不同波长的光同级衍射的衍射角度不一致，即激光发生色散，激光光束中不同波长的激光在相位光栅表面反射角度不同，但同波长的激光光束仍为平行光。本发明通过引入相位光栅，使得第一激光器发射的激光中的不同波长的光在光学元件中经过的路径不同，最终展宽了飞秒激光的脉冲宽度。作为进一步优选，扩束准直后的激光以26.44°入射到相位光栅的表面。
本发明中，所述第三透镜用于将相位光栅反射后的激光聚焦，聚焦位置位于物镜的后焦平面处，其中激光光束中不同频率的激光将汇聚于物镜的后焦平面的不同位置。
本发明中，所述第二二色镜用于使来自第一激光器与第二激光器的光束进行合束。作为优选，所述第二二色镜对于405纳米激光具有高反射率，反射率大于90％，对于825至835纳米激光具有高透射率，透射率大于90％。
本发明中，所述第一二色镜用于透射激光，反射样品的荧光。作为优选，所述第一二色镜相对第三透镜倾斜45°放置。作为优选，第一二色镜包括两个透射带：分别为825纳米至835纳米以及400至410纳米；同时，第一二色镜反射500纳米至600纳米的光，反射率>95％。
本发明中，所述滤光片只透射样品的荧光，过滤其余杂散光。
作为优选，所述第四透镜为场镜，可有效减小探测器的尺寸。
本发明提到的“第一”“第二”“第三”等仅仅是为了区别不同的部件，在没有特殊说明的情况下，“第一”“第二”“第三”等对这些部件的连接次序、结构以及功能等等没有限定作用。
本发明利用时域聚焦特性，只在时域聚焦平面产生样品的荧光激发，并同时实现对整个时域聚焦平面内荧光的激发。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明可以有效克服现有SMS荧光显微技术对聚焦平面附近甚至焦平面几微米附近等非观察区域的荧光激发，避免对的漂白。
2、本发明可以实现对整个聚焦平面内荧光的激发，能够有效提高SMS荧光显微技术的工作效率。
附图说明
图1是本发明一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***的一个实施例的光路图；
其中：1、第一激光器；2、第一透镜；3、第二透镜；4、相位光栅；5、第三透镜；6、第一二色镜；7、物镜；8、样品台；9、滤光片；10、第四透镜；11、探测器；12、第二二色镜；13、第二激光器。
具体实施方式
下面结合附图说明本发明，但本发明并不限于此。
如图1所示是本发明一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***的一个实施例的光路图。该实施例的超分辨显微***包括：
1、第一激光器；2、第一透镜；3、第二透镜；4、相位光栅；5、第三透镜；6、第一二色镜；7、物镜；8、样品台；9、滤光片；10、第四透镜；11、探测器；12、第二二色镜；13、第二激光器；
其中，第一激光器1优选为Spectra-Physics公司的Mai Tai飞秒激光器。第一激光器1出射的波段从825纳米至835纳米、峰值波长为830纳米、脉冲宽度小于100飞秒、功率为1.5瓦的激光经过第一透镜2、第二透镜3后被扩束准直。扩束准直后的激光以26.44°入射到相位光栅4的表面，产生色散，即激光光束中825纳米至835纳米波段中，不同波长的光产生不同的衍射角度。825纳米至835纳米波段中波长越长的光，衍射角度越大。
其中，相位光栅4优选为THORLABS公司的GR25-1208型反射式刻线衍射光栅；第一透镜2焦距为50纳米，第二透镜3焦距为200纳米，第一透镜2、第二透镜3均为凸透镜。
其中，第二激光器13优选为Coherent公司的PowerLine连续光半导体激光器，中心波长为405纳米。来自第二激光器13的激光光束与被相位光栅4色散后的第一激光器1的激光光束通过第二二色镜12进行合束后，经过第三透镜5、第一二色镜6后，被聚焦在物镜7的后焦平面处，宽场照明整个样品，激活样品内部分被漂白的荧光标记；通过控制第二激光器的出射光强(小于1毫瓦)，控制被重新激活的荧光标记的比例(<<1％)。
其中，第二二色镜12倾斜45°放置，且对于405纳米激光具有高反射率，对于825至835纳米激光具有高透射率，优选为Chroma公司的750dcxxr型二色镜。
第三透镜5为凸透镜，其球面正对合束后的激光设置，第三透镜5的光轴平行于合束后的激光光束。
其中，第一二色镜6倾斜45°放置，第一二色镜6包括两个透射带：分别为825纳米至835纳米以及400至410纳米，与此同时，第一二色镜6反射500纳米至600纳米的光(反射率>95％)。
来自第一激光器1的光束在物镜7的后焦平面聚焦后出射，光束中相同波长的光出射仍为平行光，825纳米至835纳米波段的光，在物镜7的焦平面产生时域聚焦。样品台8上的样品被PA-GFP荧光蛋白提前标定过，位于时域聚焦平面内的样品受到辐照后，荧光被激发，荧光中心波长为510纳米。其中时域聚焦的焦深由***点扩散函数决定，具体计算公式可从期刊Optics Express 2005年第13期的文章Simultaneous spatial and temporalfocusing of femtosecond pulses得到，利用该公式计算本实施例中，焦深为750纳米。
通过对样品台8的上下移动，物镜7出射的激光的时域聚焦平面可处于样品的不同深度，实现对样品的逐层扫描；样品的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜7，之后被第一二色镜6反射；被反射的荧光依次通过滤光片9、第四透镜10后，被探测器11接收并成像。
其中，滤光片9优选为Semrock公司的FF01-514/44-25型带通滤光片，为保证滤光效率，可以使用多片FF01-514/44-25型带通滤光片的组合，优选为2片。
第四透镜10为凸透镜。
其中，探测器11优选为Hamamatsu公司的ORCA-Flash4.0C13440-20CU型S-CMOS相机。
后续信号处理单元，通过对探测器11接收的每层的时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，即：在得到初始数据(多个荧光信号)后，可通过多种现有技术完成最终三维图像的拼接，如由黄振立等开发的Maliang算法等(Tingwei Quan,Pengcheng Li,Fan Long,ShaoqunZeng,Qingming Luo,Per NiklasHedde,Gerd Ulrich Nienhaus,and Zhen-Li Huang,"Ultra-fast,high-precision image analysis for localization-based superresolution microscopy,"Opt.Express 18,11867-11876(2010))，获得整个样品的三维超分辨结构。本实施例中，信号处理单元可采用工业计算机。
本发明利用时域聚焦特性，只在时域聚焦平面产生样品的荧光激发，并同时实现对整个时域聚焦平面内荧光的激发。因此，本发明与原有技术相比，能够避免对非聚焦平面内样品的漂白，并能够有效提高SMS荧光显微技术的工作效率。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、可正对物镜往复移动的样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器；
所述第一激光器出射的激光经过扩束准直单元扩束准直后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射后照射至第二二色镜；
所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器、并经第二二色镜透射的激光合束，再经过第三透镜、第一二色镜后被聚焦在物镜的后焦平面处，最后宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；
所述第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；
所述样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，然后被第一二色镜反射后，再依次通过滤光片、第四透镜，最后被探测器接收并成像；
所述第一激光器为飞秒激光器；所述第二激光器为连续光激光器。
2.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，所述扩束准直单元包括同轴设置的第一透镜和第二透镜，第一透镜和第二透镜共焦放置，第一透镜靠近第一激光器设置，且第一透镜焦距小于第二透镜。
3.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，所述第一激光器为钛蓝宝石飞秒激光器，最终输出峰值波长为830纳米，光谱带宽为10纳米，脉冲宽度小于100飞秒，输出平均功率为1.5瓦。
4.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，所述第二激光器为连续光半导体激光器，输出波长为405纳米。
5.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，扩束准直后的激光以26.44°入射到相位光栅的表面。
6.根据权利要求4所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，所述第二二色镜对于405纳米激光具有高反射率，对于825至835纳米激光具有高透射率。
7.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，所述第一二色镜、第二二色镜均倾斜45°放置。
8.根据权利要求6所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微***，其特征在于，第一二色镜包括两个透射带：分别为825纳米至835纳米以及400至410纳米；同时，第一二色镜反射500纳米至600纳米的光，反射率>95%。
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