CN107936122A - 一种慢病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种慢病毒及其制备方法，所述慢病毒的慢病毒胞膜糖蛋白在元件G上游修饰有元件S；其中，所述元件S为特异性识别NK细胞膜表面蛋白的辅助蛋白元件，所述元件G为衍生自野生型慢病毒包膜糖蛋白的蛋白元件。本发明通过在慢病毒包膜糖蛋白上修饰特异性识别NK细胞的抗NK细胞表面分子CD56的单链抗体，可以与所侵染的NK细胞表面的CD56分子结合，拉近了病毒颗粒与NK细胞的距离，促进了膜融合，提高了慢病毒侵染效率。

Description

一种慢病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于制备CAR-NK细胞的慢病毒及其制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)是近年来最受关注的肿瘤过继性免疫治疗技术之一，主要通过在T细胞表面表达嵌合抗原受体，进行癌细胞抗原的识别和杀伤。CAR-T免疫疗法已在多个临床试验、尤其在血液性肿瘤治疗中取得了显著的效果。报道称，经过CAR-T免疫疗法，90％的急性淋巴细胞白血病患者得到完全缓解(S.L.Maude et al.Chimeric antigen receptor Tcells for sustained remissions in leukemia.Engl.J.Med.,371,1507-1517(2014))。但是，CAR-T免疫疗法面临着细胞因子风暴、脱靶效应、对实体瘤无显著疗效等问题。
NK细胞是一类非MHC依赖性的对肿瘤细胞具有强杀伤作用的淋巴细胞，主要通过细胞表面活化性受体和抑制性受体的交叉调控进行肿瘤细胞的识别。当NK细胞识别肿瘤细胞后，通过释放穿孔素和颗粒酶素、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞的凋亡。然而，肿瘤患者体内的NK细胞数量有限、杀伤作用较弱，并且肿瘤存在逃逸机制，使得NK细胞的抗肿瘤作用不能得到充分发挥。
将CAR分子修饰于NK细胞表面显著增强的NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用。目前已有大量研究设计出针对不同肿瘤靶点的CAR-NK，并正在进行临床实验。CAR-NK具有以下优点：细胞因子风暴副反应小，不发生移植物抗宿主病，生命周期短，安全性高。现有的CAR-NK技术也存在缺陷：用于制备NK细胞的慢病毒感染效率较低，仅10％左右。目前主要通过筛选富集来提高CAR-NK阳性细胞的含量，但是增加了方法的繁琐性和成本。
因此，提供一种具有高效侵染能力的慢病毒，用于制备CAR-NK细胞，在肿瘤免疫治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种慢病毒及其制备方法和应用，制备的慢病毒具有高效侵染NK细胞的能力，简化了CAR-NK细胞的制备过程，降低了免疫治疗成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种慢病毒胞膜糖蛋白，所述慢病毒胞膜糖蛋白在元件G上游修饰有元件S；
其中，所述元件S为特异性识别NK细胞膜表面蛋白的辅助蛋白元件，所述元件G为衍生自野生型慢病毒包膜糖蛋白的蛋白元件。
病毒包膜是包裹在病毒蛋白质衣壳外的一层包膜，主要来源于宿主细胞膜，但也包含病毒自身的糖蛋白，主要功能是协助病毒进入宿主细胞。包膜表面的糖蛋白首先识别并结合宿主细胞表面受体，随后病毒包膜与宿主细胞膜结合，最后病毒衣壳和病毒基因组进入宿主细胞，完成感染过程。本发明通过在慢病毒包膜糖蛋白上修饰特异性识别NK细胞的辅助蛋白元件，拉近了病毒颗粒与NK细胞的距离，促进了膜融合，提高了慢病毒侵染效率。
优选地，所述慢病毒胞膜糖蛋白还包括元件L，所述元件L为连接元件G和元件S的连接肽。
优选地，所述元件S为抗CD56单链抗体。
优选地，所述元件S带组氨酸标签。
本发明在慢病毒包膜糖蛋白上修饰特异性识别NK细胞的抗NK细胞表面分子CD56的单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，可以与所侵染的NK细胞表面的CD56分子结合，拉近了病毒颗粒与NK细胞的距离，促进了膜融合，提高了慢病毒侵染效率。
优选地，所述元件S的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述SEQ ID NO.1所示的核酸序列为：
CATCATCATCATCATCATCAAGTACAGCTCCAACAGTCAGGACCCGGTCTCGTTAAACCTTCCCAAACGCTGTCCCTCACTTGCGCCATCAGCGGAGATTCCGTGAGCTCTAACTCTGCCGCTTGGAACTGGATTAGGCAATCCCCCTCCCGAGGACTGGAATGGCTGGGAAGAACTTACTACCGCTCCAAATGGTACAACGACTACGCAGTGTCCGTCAAGTCTCGAATCACTATCAACCCTGACACAAGCAAAAATCAGTTTTCCCTGCAACTCAACTCAGTCACCCCTGAGGACACGGCGGTTTACTATTGCGCTAGAGAGAATATTGCCGCATGGACCTGGGCGTTCGATATATGGGGTCAGGGAACAATGGTAACCGTCAGCTCCGGCGGCGGCGGATCTGGAGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGCTCCGAAATCGTTATGACACAGTCCCCTGGAACACTCTCCCTGTCTCCTGGTGAAAGAGCTACTCTGTCCTGCCGCGCTAGTCAATCCGTATCCTCCTCCTACCTTGCTTGGTACCAACAAAAGCCCGGACTTGCCCCACGCCTCCTTATTTACGACACCTCACTCCGCGCAACAGATATCCCAGATAGATTCTCCGGATCAGGCTCCGGGACCGCTTTTACACTGACAATTTCTAGGCTCGAACCAGAGGACTTCGCTGTATATTACTGCCAACAGTATGGCTCTTCACCAACATTCGGACAAGGCACCAAAGTCGAAATCAAACGCACCGTAGCC.
优选地，所述元件L为柔性肽。
优选地，所述柔性肽的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述SEQ ID NO.2所示的核酸序列为：
GGAGGCGGTTCAGGAGGTGGCTCGAGCGGAGGCGGTTCA.
优选地，所述元件G为VSV-G、RD114、BaEv或MLV中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述VSV-G为疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G，所述RD114为内生性猫病毒包膜糖蛋白，所述BaEv为狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白，所述MLV为鼠白血病病毒包膜糖蛋白。
第二方面，本发明提供了一种编码如第一方面所述的慢病毒胞膜糖蛋白的核酸序列。
第三方面，本发明提供了一种载体，所述载体包括如第二方面所述的核酸序列。
优选地，所述载体为pMD2.G。
优选地，所述载体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第四方面，本发明提供了一种慢病毒，所述慢病毒导入有如第三方面所述的载体，表达如第一方面所述的慢病毒胞膜糖蛋白。
第五方面，本发明提供了一种制备如第四方面所述的慢病毒的方法，包括以下步骤：
(1)构建如第三方面所述的载体；
(2)将步骤(1)所述的载体和包装质粒共转染哺乳细胞，进行病毒包装。
优选地，步骤(1)所述构建的方法为将如第二方面所述的核酸序列***pMD2.G的HindIII和AdeI酶切位点之间，构建得到所述载体。
优选地，步骤(2)所述哺乳细胞为293T细胞。
作为优选技术方案，本发明提供了一种制备如第四方面所述的慢病毒的方法，包括以下步骤：
(1)将如第二方面所述的核酸序列***pMD2.G的HindIII和AdeI酶切位点之间，构建得到所述载体；
(2)将步骤(1)所述的载体和包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的慢病毒胞膜糖蛋白、如第二方面所述的核酸序列、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供了一种如第六方面所述的药物组合物用于制备T细胞免疫疗法***的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过在慢病毒包膜糖蛋白上修饰特异性识别NK细胞的抗NK细胞表面分子CD56的单链抗体，可以与所侵染的NK细胞表面的CD56分子结合；
(2)本发明的慢病毒包膜糖蛋白拉近了病毒颗粒与NK细胞的距离，促进了膜融合，提高了慢病毒侵染效率，得到的慢病毒侵染NK细胞的效率达80％以上。
附图说明
图1(A)为添加有一段信号肽序列的SEQ ID NO.3序列的电泳图，图1(B)为pMD2.G上酶切位点HindIII至***位点的核酸片段的电泳图，图1(C)为pMD2.G上***位点至酶切位点Adel的核酸片段的电泳图，图1(D)为融合产物的电泳图，图1(E)为酶切后的pMD2.G的电泳图，图1(F)为anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体酶切产物电泳图，其中，M为DNA标准分子量，从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp和10000bp的分子量；
图2(A)为anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体1-248bp的测序结果，图2(B)为anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体249-496bp的测序结果，图2(C)为anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体497-682bp的测序结果，图2(D)为anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体683-882bp的测序结果；
图3为慢病毒胞膜糖蛋白的构建示意图；
图4为anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体的结构示意图；
图5为慢病毒颗粒蛋白免疫印迹结果图，其中，1-anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体蛋白免疫印迹结果图，2-野生VSVG-pMD2.G载体蛋白免疫印迹结果图；
图6为慢病毒侵染NK细胞的侵染效率图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
PCR纯化试剂盒(上海生工生物)；
凝胶回收试剂盒(上海生工生物)；
HindIII酶(Thermo Scientific)；
AdeI酶(Thermo Scientific)；
T4DNA连接酶(Thermo Scientific)。
实施例1慢病毒包膜载体anti-CD56-VSVG-pMD2.G的构建
(1)合成在5'端添加有一段信号肽序列(SEQ ID NO.4：TTTATTCATTGGGGTGAATTGC)的编码慢病毒胞膜糖蛋白的核酸序列，长度为829bp，电泳结果如图1(A)所示，目的片段长度为829bp；
(2)根据载体pMD2.G的序列及***位点的要求，设计引物分别扩增酶切位点HindIII至***位点的核酸片段和***位点至酶切位点AdeI的核酸片段，引物序列见表1：
表1 PCR引物
①PCR扩增酶切位点HindIII至***位点的核酸片段的体系见表2，程序为95℃/3min，(95℃/20s，45℃/22s，72℃/35s)20个循环，72℃/5min，PCR产物的电泳结果见图1(B)，目的片段长度为641bp；
表2酶切位点HindIII至***位点的核酸片段的PCR体系
名称 体积
10×pfu缓冲液 5μL
dNTP 1μL
Primer1(SEQ ID NO.5) 2μL
Primer2(SEQ ID NO.6) 2μL
pMD2.G 1μL
Pfu酶 0.5μL(5U/μL)
ddH2O 补齐至50μL
②PCR扩增***位点至酶切位点Adel的核酸片段的体系见表3，程序为95℃/3min，(95℃/20s，48℃/22s，72℃/30s)20个循环，72℃/5min，PCR产物的电泳结果见图1(C)，目的片段长度为440bp；
表3***位点至酶切位点Adel的核酸片段的PCR体系
③PCR融合酶切位点HindIII至***位点的核酸片段(片段1)、5'端添加有SEQ IDNO.4的编码慢病毒胞膜糖蛋白的核酸序列(片段2)和***位点至酶切位点AdeI的核酸片段(片段3)，融合体系见表4，程序为95℃/3min，(95℃/20s，55℃/22s，72℃/120s)22个循环，72℃/5min，融合产物的电泳结果见图1(D)，目的片段长度为1850bp；
表4 PCR融合体系
名称 体积
10×pfu缓冲液 5μL
dNTP 1μL
Primer1(SEQ ID NO.5) 2μL
Primer4(SEQ ID NO.8) 2μL
片段1 1μL
片段2 1μL
片段3 1μL
Pfu酶 0.5μL(5U/μL)
ddH2O 补齐至50μL
④采用PCR纯化试剂盒凝胶回收PCR融合产物，采用HindIII酶和AdeI酶对融合产物进行双酶切，酶切体系见表5，体系放入PCR仪中37℃恒温反应2h；
表5融合产物酶切体系
名称 体积
融合产物 1μg
10×FD缓冲液 5μL
HindIII酶 1μL(10U/μL)
AdeI酶 1μL(10U/μL)
ddH2O 补齐至50μL
⑤采用HindIII酶和AdeI酶对pMD2.G进行双酶切，酶切体系见表6，体系放入PCR仪中37℃恒温反应2h，酶切后的pMD2.G的电泳结构见图1(E)，有两条长度不等的片段，采用凝胶回收试剂盒回收片段大的酶切pMD2.G(4.8kb)；
表6 pMD2.G酶切体系
名称 体积
pMD2.G 1μg
10×FD缓冲液 5μL
HindIII酶 1μL(10U/μL)
AdeI酶 1μL(10U/μL)
ddH2O 补齐至50μL
⑥连接酶切的融合产物和pMD2.G，连接体系见表7，体系放入PCR仪中16℃恒温反应2h，得到连接产物；
表7连接体系
名称 体积
酶切的pMD2.G 4μL
酶切的融合产物 10μL
10×T4DNA连接酶缓冲液 2μL
T4DNA连接酶 1μL(5U/μL)
ddH2O 补齐至20μL
(3)吸取10μL连接产物，采用42℃热激法进行转化，感受态菌株为XL10-Gold，平板涂布后在37℃培养箱中过夜培养；挑取转化后的单菌落于试管中，37℃、220rpm/min培养过夜，抽提载体，采用双酶切进行载体鉴定，并对重组载体进行测序鉴定，酶切结果见图1(F)，得到长度分别为1430bp和5.2kb的两条片段，说明anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体构建成功，载体的测序结果见图2(A)-图2(D)。
重组的慢病毒包膜糖蛋白的结构示意图如图3所示；anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体的结构示意图如图4所示。
实施例2慢病毒包装及验证
(1)在转染前24h，将293T细胞根据包装数量进行传代，按照24小时后可达到70-80％融合度的密度进行接种；
(2)24h后采用磷酸钙共沉淀转染法将anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体导入到293T细胞，转染前2h将细胞培养基更换为新鲜的DMEM高糖培养基，转染液的配制方法为：向15mL离心管中加入制备的anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体和包装质粒的混合液，与相应体积的CaCl2混合均匀制得CaCl2-DNA混合液，室温下温育5-10min，缓慢逐滴吹泡加入BBS液中混匀，室温下温育20-30min，得到转染液；
(3)将转染液滴加至293T细胞的培养液中，混匀后继续培养4-6h，4-6h后用PBS清洗1-2次，更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基，16h后更换为含5％胎牛血清的1640培养基，24h后收集上清4℃保存，更换为含5％胎牛血清的1640培养基，24h后根据细胞状态收集上清，浓缩病毒液；
(4)将病毒液在4℃下以400g离心10min，取上清，将上清液通过0.45μm的PVDF滤膜，4℃条下以20000g离心90min，可看到病毒沉淀，弃上清，根据病毒液原始体积，以1:100的比例，用适量PBS溶解沉淀，并转移至1.5mL离心管中；
(5)将离心管中的病毒液以500g离心5min，取上清，分装病毒液，直接使用或转移至-80℃冰箱保存备用。
对收获的慢病毒颗粒进行蛋白免疫印迹(western blot)检测，结果见图5，可见经anti-CD56-VSVG-pMD2.G载体获得的慢病毒可以正常表达组氨酸(His)标签蛋白。
实施例3慢病毒感染NK细胞
采用滋养细胞培养法常规培养获得NK细胞，阳性率达95％以上。
按照以下步骤进行NK细胞感染：
(1)将获得的NK细胞采用GT-T561培养基重悬，密度为2×106/mL；
(2)以1mL/孔的密度接种到12孔板，加入200μl病毒液，37℃、5％CO2培养8h，补加等体积的含2％自体血清和400U/mL IL-2的GT-T561培养基，继续培养至24h；
(3)更换培养基为含1％自体血清和200U/mL IL-2的GT-T561培养基,以1×106/mL的密度接种继续培养至48h。
收集感染后的细胞进行流式细胞检测，结果如图6所示，本发明的慢病毒，由于慢病毒胞膜糖蛋白修饰有抗CD56单链抗体，与野生型慢病毒相比，对NK细胞具有更高的侵染效率，侵染效率达80％以上。
综上所述，本发明通过在慢病毒包膜糖蛋白上修饰特异性识别NK细胞的抗NK细胞表面分子CD56的单链抗体，可以与所侵染的NK细胞表面的CD56分子结合，拉近了病毒颗粒与NK细胞的距离，促进了膜融合，提高了慢病毒侵染效率，得到的慢病毒侵染NK细胞的效率达80％以上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 河南省华隆生物技术有限公司
<120> 一种慢病毒及其制备方法和应用
<130> 20171228
<141> 2017-12-29
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
catcatcatc atcatcatca agtacagctc caacagtcag gacccggtct cgttaaacct 60
tcccaaacgc tgtccctcac ttgcgccatc agcggagatt ccgtgagctc taactctgcc 120
gcttggaact ggattaggca atccccctcc cgaggactgg aatggctggg aagaacttac 180
taccgctcca aatggtacaa cgactacgca gtgtccgtca agtctcgaat cactatcaac 240
cctgacacaa gcaaaaatca gttttccctg caactcaact cagtcacccc tgaggacacg 300
gcggtttact attgcgctag agagaatatt gccgcatgga cctgggcgtt cgatatatgg 360
ggtcagggaa caatggtaac cgtcagctcc ggcggcggcg gatctggagg tggtggctca 420
ggtggcggag gctccgaaat cgttatgaca cagtcccctg gaacactctc cctgtctcct 480
ggtgaaagag ctactctgtc ctgccgcgct agtcaatccg tatcctcctc ctaccttgct 540
tggtaccaac aaaagcccgg acttgcccca cgcctcctta tttacgacac ctcactccgc 600
gcaacagata tcccagatag attctccgga tcaggctccg ggaccgcttt tacactgaca 660
atttctaggc tcgaaccaga ggacttcgct gtatattact gccaacagta tggctcttca 720
ccaacattcg gacaaggcac caaagtcgaa atcaaacgca ccgtagcc 768
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ggaggcggtt caggaggtgg ctcgagcgga ggcggttca 39
<210> 3
<211> 6629
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
gattctgcct aataaaaaac atttattttc attgcaatga tgtatttaaa ttatttctga 60
atattttact aaaaagggaa tgtgggaggt cagtgcattt aaaacataaa gaaatgaaga 120
gctagttcaa accttgggaa aatacactat atcttaaact ccatgaaaga aggtgaggct 180
gcaaacagct aatgcacatt ggcaacagcc cctgatgcct atgccttatt catccctcag 240
aaaaggattc aagtagaggc ttgatttgga ggttaaagtt ttgctatgct gtattttaca 300
ttacttattg ttttagctgt cctcatgaat gtcttttcac tacccatttg cttatcctgc 360
atctctcagc cttgactcca ctcagttctc ttgcttagag ataccacctt tcccctgaag 420
tgttccttcc atgttttacg gcgagatggt ttctcctcgc ctggccactc agccttagtt 480
gtctctgttg tcttatagag gtctacttga agaaggaaaa acagggggca tggtttgact 540
gtcctgtgag cccttcttcc ctgcctcccc cactcacagt gacccggaat ccctcgacat 600
ggcagtctag cactagtgcg gccgcagatc tgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 660
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 720
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 780
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 840
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 900
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 960
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1020
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1080
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1140
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1200
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1260
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 1320
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 1380
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 1440
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 1500
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 1560
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 1620
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 1680
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 1740
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 1800
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 1860
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 1920
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 1980
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 2040
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 2100
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 2160
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 2220
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 2280
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 2340
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 2400
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 2460
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 2520
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtggatcccc tgagggggcc 2580
cccatgggct agaggatccg gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat 2640
gagcttggcc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 2700
tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 2760
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 2820
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 2880
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 2940
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 3000
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 3060
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 3120
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 3180
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 3240
aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 3300
agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 3360
catagaagac accgggaccg atccagcctc ccctcgaagc ttacatgtgg taccgagctc 3420
ggatcctgag aacttcaggg tgagtctatg ggacccttga tgttttcttt ccccttcttt 3480
tctatggtta agttcatgtc ataggaaggg gagaagtaac agggtacaca tattgaccaa 3540
atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt 3600
tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa 3660
tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 3720
atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 3780
tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 3840
taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 3900
atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 3960
aaagcacgtg agatctgaat tctgacacta tgaagtgcct tttgtactta gcctttttat 4020
tcattggggt gaattgccat catcatcatc atcatcaagt acagctccaa cagtcaggac 4080
ccggtctcgt taaaccttcc caaacgctgt ccctcacttg cgccatcagc ggagattccg 4140
tgagctctaa ctctgccgct tggaactgga ttaggcaatc cccctcccga ggactggaat 4200
ggctgggaag aacttactac cgctccaaat ggtacaacga ctacgcagtg tccgtcaagt 4260
ctcgaatcac tatcaaccct gacacaagca aaaatcagtt ttccctgcaa ctcaactcag 4320
tcacccctga ggacacggcg gtttactatt gcgctagaga gaatattgcc gcatggacct 4380
gggcgttcga tatatggggt cagggaacaa tggtaaccgt cagctccggc ggcggcggat 4440
ctggaggtgg tggctcaggt ggcggaggct ccgaaatcgt tatgacacag tcccctggaa 4500
cactctccct gtctcctggt gaaagagcta ctctgtcctg ccgcgctagt caatccgtat 4560
cctcctccta ccttgcttgg taccaacaaa agcccggact tgccccacgc ctccttattt 4620
acgacacctc actccgcgca acagatatcc cagatagatt ctccggatca ggctccggga 4680
ccgcttttac actgacaatt tctaggctcg aaccagagga cttcgctgta tattactgcc 4740
aacagtatgg ctcttcacca acattcggac aaggcaccaa agtcgaaatc aaacgcaccg 4800
tagccggagg cggttcagga ggtggctcga gcggaggcgg ttcaaagttc accatagttt 4860
ttccacacaa ccaaaaagga aactggaaaa atgttccttc taattaccat tattgcccgt 4920
caagctcaga tttaaattgg cataatgact taataggcac agccttacaa gtcaaaatgc 4980
ccaagagtca caaggctatt caagcagacg gttggatgtg tcatgcttcc aaatgggtca 5040
ctacttgtga tttccgctgg tatggaccga agtatataac acattccatc cgatccttca 5100
ctccatctgt agaacaatgc aaggaaagca ttgaacaaac gaaacaagga acttggctga 5160
atccaggctt ccctcctcaa agttgtggat atgcaactgt gacggatgcc gaagcagtga 5220
ttgtccaggt gactcctcac catgtgctgg ttgatgaata cacaggagaa tgggttgatt 5280
cacagttcat caacggaaaa tgcagcaatt acatatgccc cactgtccat aactctacaa 5340
cctggcattc tgactataag gtcaaagggc tatgtgattc taacctcatt tccatggaca 5400
tcaccttctt ctcagaggac ggagagctat catccctggg aaaggagggc acagggttca 5460
gaagtaacta ctttgcttat gaaactggag gcaaggcctg caaaatgcaa tactgcaagc 5520
attggggagt cagactccca tcaggtgtct ggttcgagat ggctgataag gatctctttg 5580
ctgcagccag attccctgaa tgcccagaag ggtcaagtat ctctgctcca tctcagacct 5640
cagtggatgt aagtctaatt caggacgttg agaggatctt ggattattcc ctctgccaag 5700
aaacctggag caaaatcaga gcgggtcttc caatctctcc agtggatctc agctatcttg 5760
ctcctaaaaa cccaggaacc ggtcctgctt tcaccataat caatggtacc ctaaaatact 5820
ttgagaccag atacatcaga gtcgatattg ctgctccaat cctctcaaga atggtcggaa 5880
tgatcagtgg aactaccaca gaaagggaac tgtgggatga ctgggcacca tatgaagacg 5940
tggaaattgg acccaatgga gttctgagga ccagttcagg atataagttt cctttataca 6000
tgattggaca tggtatgttg gactccgatc ttcatcttag ctcaaaggct caggtgttcg 6060
aacatcctca cattcaagac gctgcttcgc aacttcctga tgatgagagt ttattttttg 6120
gtgatactgg gctatccaaa aatccaatcg agcttgtaga aggttggttc agtagttgga 6180
aaagctctat tgcctctttt ttctttatca tagggttaat cattggacta ttcttggttc 6240
tccgagttgg tatccatctt tgcattaaat taaagcacac caagaaaaga cagatttata 6300
cagacataga gatgaaccga cttggaaagt aactcaaatc ctgcacaaca gattcttcat 6360
gtttggacca aatcaacttg tgataccatg ctcaaagagg cctcaattat atttgagttt 6420
ttaattttta tgaaaaaaaa aaaaaaaaac ggaattcacc ccaccagtgc aggctgccta 6480
tcagaaagtg gtggctggtg tggctaatgc cctggcccac aagtatcact aagctcgctt 6540
tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct aagtccaact actaaactgg 6600
gggatattat gaagggcctt gagcatctg 6629
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
tttattcatt ggggtgaatt gc 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
gacacaagct tacatgtggt accga 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
gcaattcacc ccaatgaata 20
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
tggctcgagc ggaggcggtt caaagttcac catagttttt ccac 44
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
gacacgtcga ccacatggtg aggagtcacc t 31

Claims (10)

1.一种慢病毒胞膜糖蛋白，其特征在于，所述慢病毒胞膜糖蛋白在元件G上游修饰有元件S；
其中，所述元件S为特异性识别NK细胞膜表面蛋白的辅助蛋白元件，所述元件G为衍生自野生型慢病毒包膜糖蛋白的蛋白元件。
2.根据权利要求1所述的慢病毒胞膜糖蛋白，其特征在于，所述元件S和元件G通过元件L相连，所述元件L为连接肽；
优选地，所述元件S为抗CD56单链抗体；
优选地，所述元件S带组氨酸标签；
优选地，所述元件S的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述元件L为柔性肽；
优选地，所述柔性肽的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述元件G为VSV-G、RD114、BaEv或MLV中的任意一种或至少两种的组合。
3.一种编码如权利要求1或2所述的慢病毒胞膜糖蛋白的核酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求3所述的核酸序列；
优选地，所述载体为pMD2.G；
优选地，所述载体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒导入有如权利要求4所述的载体，表达如权利要求1或2所述的慢病毒胞膜糖蛋白。
6.一种制备如权利要求5所述的慢病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建如权利要求4所述的载体；
(2)将步骤(1)所述的载体和包装质粒共转染哺乳细胞，进行病毒包装。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为将如权利要求3所述的核酸序列***pMD2.G的HindIII和AdeI酶切位点之间，构建得到所述载体；
优选地，步骤(2)所述哺乳细胞为293T细胞。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将如权利要求3所述的核酸序列***pMD2.G的HindIII和AdeI酶切位点之间，构建得到所述载体；
(2)将步骤(1)所述的载体和包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的慢病毒胞膜糖蛋白、如权利要求3所述的核酸序列、如权利要求4所述的载体或如权利要求5所述的慢病毒中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求9所述的药物组合物用于制备T细胞免疫疗法***的药物。
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