CN107936115A - 水蛭素提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水蛭素提取方法，该方法包括如下步骤：称取A质量份水蛭粉末；准备B质量份的生理盐水；将所述水蛭粉末和所述生理盐水均置入浸提容器中进行预设时间的浸提处理；对所述浸提容器中已经浸提处理的混合液进行离心处理；离心处理后留取预设体积的上清液。本发明的有益之处在于提供了一种能够有效采集水蛭素的提取方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取方法，具体涉及一种水蛭素提取方法。
背景技术
水蛭为水蛭科动物蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥的干燥全体，味苦、咸；性平，具有通络活血、逐瘀散结之功效。
水蛭素是从水蛭唾液腺中分离出的一种多肽类分泌物，通过抑制凝血酶与血小板结合从而延缓血液凝固和促进纤维蛋白溶解。经过多年实验研究和临床应用研究证实，水蛭素的抗凝效果明显高于肝素，是迄今为止发现的最高效的且直接作用于凝血酶的抑制剂。因此，将其开发成高效特异性抗凝血抗血栓药物已受到国内外研究者的广泛关注，但水蛭素的抗凝血活性低、纯度低以及提取成本高等局限性使其临床上的应用与推广受限。因此，应用高效低廉的方法获得水蛭素的最大产量，将为水蛭素的实际生产带来很大改观，具有较高的经济效益和市场价值。
现有的水蛭素的提取方法所提取的凝血酶活性较低。
发明内容
一种水蛭素提取方法，该方法包括如下步骤：称取A质量份水蛭粉末；准备B质量份的生理盐水；将所述水蛭粉末和所述生理盐水均置入浸提容器中进行预设时间的浸提处理；对所述浸提容器中已经浸提处理的混合液进行离心处理；离心处理后留取预设体积的上清液。
进一步地，水蛭粉的质量份A与生理盐水的质量份B的比值的取值范围为0.05至0.2。
进一步地，水蛭粉与生理盐水的比值为1:6。
进一步地，水蛭粉与生理盐水的比值为1:8。
进一步地，水蛭粉与生理盐水的比值为1:10。
进一步地，生理盐水为浓度为0.9％氯化钠溶液。
进一步地，浸提处理的预设时间的取值范围为20分钟至150分钟。
进一步地，浸提处理的预设时间的取值范围为30分钟至120分钟。
进一步地，浸提处理的预设时间的取值范围为85分钟至110分钟。
进一步地，浸提处理的次数大于等于2。
本发明的有益之处在于：
提供了一种能够有效采集水蛭素的提取方法。所采集的水蛭素的活性较高。
附图说明
图1是本发明的水蛭素提取方法的步骤示意框图。
具体实施方式
如图1所示，本发明的水蛭素提取方法包括：称取A质量份水蛭粉末；准备B质量份的生理盐水；将水蛭粉末和生理盐水均置入浸提容器中进行预设时间的浸提处理，该时间为了方便说明定义为浸泡时间；对浸提容器中已经浸提处理的混合液进行离心处理；离心处理后留取预设体积的上清液。
其中，作为一种具体方案，可以称取1g水蛭粉末，加入5mL生理盐水，摇匀后浸提30分钟，浸提过程中持续或间断地摇晃容器。离心后取100μL上清液置1.5mL的EP管中。
为提高提取的效果，在进行浸提时，对容器施以超声波震荡，具体而言，将容器置于一夹持机构，驱动该夹持机构使容器摇晃；在容器的周边设置若干超声波探头向容器所处的方向施加超声波。在容器进行摇晃时，超声波的频率较高但幅值较低，且以脉冲的形式进行输出；在容器静止时，超声波的频率较低但幅值较高且以持续的形式输出。
在进行离心时，同样对容器施以超声波以提高提取效率，具体而言，设置若干超声波探头使容器做离心的运动的空间存在超声波，在开始离心的初始阶段，以较低的转速进行离心，此时使超声波以较高的频率和幅值进行持续输出，在满足第一预设时间后，使离心速度增加，同时使超声波以较高的频率和幅值进行脉冲输出，在满足第二预设时间后，使离心速度增加至最大，使超声波以较低的频率和幅值进行脉冲输出，这个脉冲的频率低于之前的脉冲频率。
采用这样的方式，可以利用离心时的时间进一步提高提取的效率。
(增加的部分，为了提高授权率)
为了检测所提取的液体的抗凝血酶的活性，可以采用以下的方案，取三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-Hcl)配制的0.5％牛纤维蛋白原溶液200μL，摇匀后于37℃水浴锅中温提5min，在此过程中每分钟滴加5μL浓度为40U/mL的凝血酶溶液(现配)，边滴加边轻轻摇晃直至可挑出白色絮状物，记录滴加凝血酶溶液的次数，并按照下式计算水蛭素的抗凝血酶活性：
式中U—每1g水蛭含凝血酶活性单位，单位U/g；
C1—凝血酶溶液的浓度，单位为μL/mL；
C2—供试品溶液的浓度，单位为g/mL；
V1—消耗凝血酶溶液的体积，单位为μL；
V2—供试品溶液的加入量，单位为μL。
其中，一个抗凝血酶活性单位即为中和一个单位的凝血酶的量。
具体而言，水蛭粉的质量份A与生理盐水的质量份B的比值的取值范围为0.05至0.2。比如，水蛭粉与生理盐水的比值为1:6或1:8或1:10。水蛭粉的质量份A与生理盐水的质量份B的比值的倒数定义为液料比。
作为具体方案，生理盐水为浓度为0.9％氯化钠溶液。
作为具体方案，浸提处理的预设时间的取值范围为20分钟至150分钟；更优的取值范围为30分钟至120分钟；作为更具体的时间取值范围，浸提处理的预设时间的取值范围为85分钟至110分钟。
浸提处理的次数大于等于2。可以反复对同一浸提容器中的水蛭粉进行多次提取，该次数定义提取次数。
如下表1和表2所示，设计不同的参数进行实验。
由表中数据可知，采用以上方法所获得的水蛭素提取物的抗凝血活性均大于200U/g，可见采用以上方法可以获得活性较好的水蛭素提取物。
作为进一步地优选的实施例，将浸泡时间设定在90min，液料比为12:1，提取次数为2。
重复进行五次不同的试验，试验结果如表3所示，由此可知，在浸泡时间设定在90min，液料比为12:1，提取次数为2的情况下，所提出的水蛭素的抗凝血活性达到300U/g以上，可见采用该工艺条件所提取的水蛭素的活性十分优良。
表1正交因素设计表
表2正交试验数据
表3试验数据结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种水蛭素提取方法，其特征在于：所述水蛭素提取方法包括如下步骤：
称取A质量份水蛭粉末；
准备B质量份的生理盐水；
将所述水蛭粉末和所述生理盐水均置入浸提容器中进行预设时间的浸提处理；
对所述浸提容器中已经浸提处理的混合液进行离心处理；
离心处理后留取预设体积的上清液。
2.根据权利要求1所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述水蛭粉的质量份A与所述生理盐水的质量份B的比值的取值范围为0.05至0.2。
3.根据权利要求2所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述水蛭粉与所述生理盐水的比值为1:6。
4.根据权利要求2所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述水蛭粉与所述生理盐水的比值为1:8。
5.根据权利要求2所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述水蛭粉与所述生理盐水的比值为1:10。
6.根据权利要求2所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述生理盐水为浓度为0.9％氯化钠溶液。
7.根据权利要求1所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述浸提处理的预设时间的取值范围为20分钟至150分钟。
8.根据权利要求7所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述浸提处理的预设时间的取值范围为30分钟至120分钟。
9.根据权利要求8所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述浸提处理的预设时间的取值范围为85分钟至110分钟。
10.根据权利要求1至9任意一项所述的水蛭素提取方法，其特征在于：所述浸提处理的次数大于等于2。
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|---|---|---|---|---|
| CN107337729A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-10 | 重庆多普泰制药股份有限公司 | 一种水蛭素粗提方法 |
| CN114703252A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-07-05 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒 |
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| CN114703252B (zh) * | 2022-06-02 | 2022-11-04 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒 |
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