CN107922974A - 羧基官能亲水微珠的偶合 - Google Patents

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Abstract

一种聚合物基质，如聚合物涂料或聚合物水凝胶网络，含有可用作偶合位点的羧基基团，受体或分析物分子可附接于所述位点。在一个实例中，所述聚合物基质包括具有链烷酸基团或其衍生物的聚丙烯酰胺聚合物网络，所述聚合物基质可与羧基活化化合物反应以在所述聚丙烯酰胺网络上提供活化的链烷酸酯基团。胺封端的核酸可与所述活化的链烷酸酯基团反应，通过烷基酰胺基团将所述核酸捕获到所述聚合物网络上。

Description

羧基官能亲水微珠的偶合
技术领域
本发明一般涉及羧基官能亲水微珠的偶合方法以及用该方法形成的微珠。
背景技术
官能化聚合物基质被用于各种化学应用和生物应用。具体而言，表面和聚合物微珠上的聚合物涂料可用于各种分离技术中，或辅助检测化学体系和生物体系中的分析物。例如，聚合物微粒已用于色谱技术，以分离溶液中的目标分子。再如，具有一个磁性涂层的聚合物微粒已用于磁分离技术。最近，聚合物微粒已用以增强ELISA类技术并可用于捕获多聚核苷酸。
这些分离和分析技术有赖于所述聚合物基质的官能化，以吸引期望的目标分析物。既往的基质已遇到表面官能化不良的问题，或难以控制官能化位点的个数。官能化不良可导致分析物捕获减少或所捕获的分析物的表达水平下降，无论是因为缺少位点、位点接触不良还是因为其它空间位阻。对磁分离技术而言，分析物捕获的变化可导致分离效率降低。对色谱技术和各种多聚核苷酸捕获技术而言，官能化程度的变化可导致与多聚核苷酸相互作用的可供位点个数的变化，致使捕获、分离效率或检测改变。
发明概述
在一个示例性实施例中，一种聚合物基质，诸如一种聚合物涂料、一个聚合物水凝胶网络或一种聚合物微珠，包括可用作偶合位点的羧基基团，受体或分析物分子可附接于所述位点。在一个具体实例中，所述聚合物基质包括一个具有链烷酸基团或其衍生物的聚丙烯酰胺聚合物网络，所述链烷酸基团或其衍生物可在一种非水溶剂中与诸如一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物或一种琥珀酰亚胺基鏻化合物等羧酸酯活化化合物反应，在所述聚丙烯酰胺网络上提供活化的链烷酸酯基团，诸如琥珀酰亚胺基酯。诸如胺封端的寡核苷酸等亲脂性胺封端的核酸可在非水溶剂中与所述活化的链烷酸酯基团反应，通过烷基酰胺基团将所述核酸捕获到所述聚合物网络上。
附图简略说明
对于本领域技术人员而言，通过参考所述附图，可以更好地理解本发明，并明了本发明的多个特征和优点。
图1包括一个流程框图，图示说明一种用于偶合基质与检测分析物的示例性方法。
图2、图3、图4、图5和图6包括对示例性化学方案的图示说明。
图7包括有关示例性测序方法的图。
在不同的附图中使用相同的引用符号表示相似或相同的事项。
具体实施方式
在一个示例性实施例中，一种聚合物基质，如一种聚合物涂料、一个聚合物水凝胶网络或一种不连续的聚合物微粒，包括可用作偶合位点的羧基基团，受体或分析物分子可附接于所述位点。在一个具体实例中，所述聚合物基质包括一个具有链烷酸基团或其酯衍生物的聚丙烯酰胺聚合物网络，所述链烷酸基团或其酯衍生物可在一种非水溶剂中与诸如琥珀酰亚胺基脲鎓化合物或一种琥珀酰亚胺基鏻化合物等羧基活化化合物反应，提供位于所述聚丙烯酰胺网络上的活化的链烷酸酯基团。诸如胺封端的寡核苷酸等亲脂性胺封端的核酸可在一种非水溶剂中与所述琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团反应，通过一个烷基酰胺基团将所述核酸捕获到所述聚合物网络上。
例如，一种涂料、微珠或水凝胶基质可由一个聚丙烯酰胺聚合物网络形成，该网络用一种链烷酸基团或其一种酯衍生物进行官能化。具体而言，所述聚丙烯酰胺聚合物网络可按以下方式形成：具有羧基基团或其酯衍生物的丙烯酰胺单体与具有羟基基团的丙烯酰胺单体或交联剂共聚。所述羧基官能单体与含有羟基基团的所述丙烯酰胺单体和交联剂之间的比例影响着偶合位点的可供性，所述位点可与琥珀酰亚胺基脲鎓盐或琥珀酰亚胺基鏻盐等羧基活化化合物起反应。通过某一种聚丙烯酰胺基质的水解，例如，采用一种酸处理法，也可形成羧基官能聚合物丙烯酰胺基质。当在非水溶剂中与离子交换型或亲脂性胺封端的生物分子，如胺封端的核酸(如一种胺封端的寡核苷酸)，偶合时，所述聚合物涂料、水凝胶网络或微珠可包括一个具有烷基酰胺基团的聚丙烯酰胺聚合物网络，所述烷基酰胺基团与位于所述聚丙烯酰胺网络之丙烯酰胺主链上的所述酰胺基团的氮直接链接，并与所述核酸等所述生物分子链接。
在一个示例性实施例中，比如在一种非水溶剂中，可形成一种聚合物基质，方法是将一种琥珀酰亚胺基化合物涂覆于所述基质的聚合体表面。所述聚合物基质可包括一种链烷酸基团或其酯衍生物，该链烷酸基团或其酯衍生物可与所述琥珀酰亚胺基化合物起反应，形成一种琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团。在一种非水溶剂中，可将一种离子交换型或亲脂性胺封端的生物分子，如胺封端的核酸(阳反离子已被交换以包含油溶性铵阳离子或鏻阳离子)，涂覆于具有所述胺封端的生物分子的胺官能团的所述基质的表面，形成一种酰胺，替代所述琥珀酰亚胺基团，并保留将聚合物主链偶联到生物分子上的烷基酰胺部分。
在一个实例中，图1说明了一种用于偶合基质的方法100。如102所示，制备一种具有羧基官能的聚合物基质。该聚合物基质可以是一种涂料。在另一个实例中，所述聚合物基质可以是一种聚合物微粒。例如，所述聚合物微粒可以是一种亲水性聚合物微粒，如一种水凝胶聚合物微粒。
例如，如图2所示，一种聚合物微粒202可含有以羧基官能封端的基团。例如，羧基官能团可源于由所述聚合物微粒的聚合体的一个主链延伸的链烷酸基团或其酯衍生物。另外，所述聚合物微粒202也可选择性地表达其它官能，如羟基官能团或胺官能团。虽然所述聚合物微粒202按照图示说明，所述聚合物微粒202的某一表面具有基团和官能团表达，但是所述基团和官能团可遍及整个所述聚合物微粒202内部的聚合物颗粒202延伸。具体而言，可接触并偶合所述聚合物微粒202内部的官能团。
在一个实例中，通过一种或多种单体或交联剂的一种混合物的聚合，可形成所述聚合物微粒。所述单体可包括一种羧基官能丙烯酰胺单体。因所述聚合方法而异，所述羧基官能丙烯酰胺单体包括一种受保护的羧基官能丙烯酰胺单体。具体而言，所述受保护的羧基官能丙烯酰胺单体包括一个保护基，保护所述羧基官能团的亲水性羟基，防止聚合期间的反应，或让所述单体更混溶于憎水相。
例如，所述单体可有如下结构式(I)：
式中，R1是一个有3至10个碳原子的烷基、一个有1至10个醚单元的聚醚基或是另一个极性基团；R2是一个有3至8个碳原子的直链或支链烷基，或是一个甲硅烷基；而R3是氢或一个有1至6个碳原子的烷基。在一个具体实例中，R1是一个有3至10个碳原子的烷基或是一个有1至10个醚单元的聚醚基。例如，R1可以是一个有3至6个碳原子(如3至5个碳原子)的烷基。在另一个实例中，R1可以是一个含有2至6个(如2至4个)单元(如环氧乙烷或环氧丙烷单元)的聚醚基。在另一个实例中，R1可以是一个极性基团，例如，一个仲胺。在一个实例中，R2是一个支链烷基，例如，有3至5个(如4个)碳原子的支链烷基。具体而言，R2可以是一个异丙基、异丁基、仲丁基或叔丁基，或它们的任一组合。所述甲硅烷基可以是一个三烷基甲硅烷基、一个有机二甲硅烷基或一个有机三甲硅烷基。例如，所述三烷基甲硅烷基可以是一个三甲基甲硅烷基或一个三乙基甲硅烷基。在另一个实例中，R3是氢。在另一个实例中，R3是一个甲基或乙基。
在一个实例中，所述单体可有如下结构式(II)：
式中，R1是一个有3至10个碳原子的烷基，或是一个有1至10个醚单元的聚醚基；R2是一个有3至8个碳原子的直链或支链烷基，或是一个甲硅烷基。例如，R1可以是一个有3至6个(如3至5个)碳原子的烷基。在另一个实例中，R1可以是一个含有2至6个(如2至4个)单元(如环氧乙烷或环氧丙烷单元)的聚醚基。在一个实例中，R2是一个支链烷基，例如，有3至5个(如4个)碳原子的支链烷基。具体而言，R2可以是一个异丙基、异丁基、仲丁基或叔丁基，或它们的任一组合。所述甲硅烷基可以是一个三烷基甲硅烷基、一个有机二甲硅烷基或一个有机三甲硅烷基。例如，所述三烷基甲硅烷基可以是一个三甲基甲硅烷基或一个三乙基甲硅烷基。
在一个具体实例中，所述受保护的羧基官能单体可以是用一个叔丁基保护基保护且具有如下结构式(III)的丙烯酰胺丁烷酸酯：
除了所述受保护的羧基官能单体以外，一种或多种单体或交联剂可跟所述羧基官能单体聚合。所述共聚单体或交联剂可以是一种可自由基聚合的共聚单体或交联剂，如一种乙烯基共聚单体或交联剂。因所述聚合方法而异，所述共聚单体或交联剂可包括跟一种憎水性保护基偶合的一种亲水性单体。在一个实例中，所述亲水性共聚单体可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯或它们的任一组合。在一个具体实例中，所述共聚单体是一种丙烯酰胺，如含有羟基、羧基或二者组合的一种丙烯酰胺。在另一个实例中，所述丙烯酰胺共聚单体可以是一种羟烷基丙烯酰胺，如羟乙基丙烯酰胺。具体而言，所述羟烷基丙烯酰胺可包括N-(羟甲基)丙烯酰胺(式IV，图示说明如下)、N-(羟乙基)丙烯酰胺(式V，图示说明如下)或二者的一种组合。
(IV)
(V)
在一个具体实例中，所述亲水性共聚单体或交联剂含有羟基。在另一个实例中，可用所述羧基官能单体和一种共聚单体或交联剂的一种混合物，如羧基官能丙烯酰胺单体和羟烷基丙烯酰胺共聚单体的一种混合物。在一个实例中，可包括所述羧基官能丙烯酰胺单体，使其与羟烷基丙烯酰胺的配比介于2:1至1:1000之间，如2:1至1:100之间、1:1至1:25之间、1:1至1:10之间，甚至1:1至1:2之间。
所述单体也可跟一种交联剂聚合。在一个实例中，可包括所述交联剂，使单体与交联剂之间的质量比介于15:1至1:2之间，如10:1至1:1之间、6:1至1:1之间，甚至4:1至1:1之间。该交联剂可具有降低的水中溶解度(如低于10g/l)，也可含有受保护的极性基团，致使其偏向于一种憎水相。聚合后，可解除受保护极性基团的保护，使所述交联剂的官能团亲水。具体而言，所述交联剂可以是一种二乙烯基交联剂。例如，一种二乙烯基交联剂可包括一种二丙烯酰胺，如N,N’-(乙烷-1,2-二基)双(2-羟乙基)丙烯酰胺、N,N’-(2-羟基丙烷-1,3-二基)二丙烯酰胺或二者的一种组合。在另一个实例中，一种二乙烯基交联剂包括二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、六亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、前述四种化合物中任一化合物的一种受保护衍生物，或上述物质的一种组合。在另一个实例中，可用一种憎水性保护基，如一种羟基保护基，保护所述交联剂。
此外，所述聚合可在一种致孔剂存在的情况下发生。一种示例性致孔剂包括一种芳香性致孔剂。在一个实例中，所述芳香性致孔剂包括苯、甲苯、二甲苯、三甲基苯、乙酸苯乙酯、己二酸二乙酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯酯、乙酸丁酯或这十种化合物的一种组合。所述致孔剂的溶解度参数一般为15–20。在另一个实例中，所述致孔剂是一种链烷醇致孔剂，如十二醇。相对于前述反应体系内的所述聚合相，所述致孔剂的含量可以介于1wt％至99wt％之间，如30wt％至90wt％之间，甚至50wt％至85wt％之间。
可选择性地包括一种聚合引发剂。一种示例性聚合引发剂通过自由基生成，可引发聚合。一种示例性聚合引发剂包括一种偶氮引发剂，如油溶性偶氮引发剂。另一种引发剂可包括过硫酸铵。又一种示例性引发剂可包括四甲基乙二胺。在一个实例中，基于聚合相的重量，聚合引发剂的含量可以为0.001wt％至3wt％。
或者，通过将一种由羟烷基丙烯酰胺和一种交联剂聚合而成的聚丙烯酰胺水解，可形成所述聚合物微粒。作为对一种酸处理的响应，一部分所述羟烷基酰胺单元转化成羧基官能团。
返回图1，可将一种羧基活化化合物，如一种琥珀酰亚胺基化合物，涂覆到所述聚合物基质上，如104所说明，比如在一种非水溶剂中进行。所述琥珀酰亚胺基化合物可跟所述羧基官能团(如一种链烷酸基团或其酯衍生物)反应，形成一种琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团，本文件中此过程称之为活化。
可将一种琥珀酰亚胺基化合物涂覆到所述聚合物基质上。所述琥珀酰亚胺基化合物可以是，比如一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物或一种琥珀酰亚胺基鏻化合物。在一个具体实例中，所述琥珀酰亚胺基化合物是一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物。所述琥珀酰亚胺基脲鎓化合物可以是一种O型琥珀酰亚胺基脲鎓。在一个实例中，所述O型琥珀酰亚胺基脲鎓是一种N-羟基琥珀酰亚胺基脲鎓。在另一个实例中，所述琥珀酰亚胺基化合物是一种琥珀酰亚胺基鏻化合物。
例如，如图2所示，一种N-羟基琥珀酰亚胺基化合物(NHS化合物)可跟所述微粒物202上的所述羧基官能团反应，比如在一种非水溶剂中反应，形成琥珀酰亚胺基链烷酸酯化合物(C(O)NHS)，如微粒物204的附图所说明。
返回图1，所述改性聚合物基质可被偶合至一种生物分子(如一种核酸)上，例如，通过将溶于某一种非水溶剂中的一种胺封端生物分子涂覆到所述聚合物基质上，如106附图所说明。在一个具体实例中，通过如下方式，可让所述生物分子亲脂：将金属反离子与含亲脂性基团的阳离子(如铵或鏻阳离子)进行交换。在一个具体实例中，一种胺封端的核酸可先经过离子交换，然后才跟所述聚合物基质偶合。具体而言，与核酸缔合的金属离子可用亲脂性反离子替代，如图3所说明。
如图3所示，一种生物分子的反离子(如金属离子)可用亲脂性反离子交换，提供一种比较亲脂的生物分子配合物。本文件所用的亲脂性反离子是掺有官能团(如烷基基团)的离子，当该反离子与所述生物分子缔合时，它遮挡所述生物分子的离子，使该生物分子更加亲脂且能溶于一种非水溶剂。例如，图示说明的所述生物分子是一种多聚核苷酸。如图示，所述多聚核苷酸由多个聚合的核苷酸形成。一个核苷酸的糖基团(X)跟一个相邻核苷酸的一个磷酸根基团键合。每个磷酸根基团与一个阳反离子(M+)缔合。在一个实例中，所述阳反离子(M+)可以是一种金属离子。另在一个实例中，所述阳反离子(M+)可以是铵根或质子。此外，所述多聚核苷酸可含有一个接头基团(L)，把一个反应基团(W)链接至所述核苷酸链。所述生物分子也可以是一种具有一个类似的接头/反应基团结构的多聚核苷酸类似物，该多聚核苷酸的所述反应基团(W)除了从糖基(X)延伸出来外还可从一个或多个所述碱基延伸出来，或者不从该糖基(X)而从一个或多个所述碱基延伸出来。
在一个实例中，所述接头基团(L)包括一种烃、一种醚或聚醚基，或它们的一种组合。所述反应基团(W)的官能可以是跟形成于某一基质(如一种聚合物基质)上的官能团反应。在一个具体实例中，所述反应基团(W)可以是一种胺、硫醇、马来酰亚胺、乙炔、叠氮，或它们的一种组合。例如，所述反应基团(W)可以是一种胺或硫醇。具体而言，所述反应基团(W)可以是一种胺。另在一个实例中，所述反应基团(W)可以是一种马来酰亚胺。又在一个实例中，所述反应基团(W)可以是乙炔。另外在一个实例中，所述反应基团(W)可以是一种叠氮。
在图3所示的实施例中，所述多聚核苷酸接触一种亲脂性反离子，如一种具有亲脂性基团的带正电荷的反离子。所述亲脂性反离子可含有跟一个或多个烃基(R1、R2、R3、R4)偶合并与一个反离子(Z)缔合的一个带正电荷的元(Y)。在一个实例中，所述带正电荷的元(Y)可以是氮、磷、硫、砷，或它们的任一种组合。具体而言，所述带正电荷的元(Y)是氮、磷、硫，或它们的一种组合。例如，所述带正电荷的元(Y)可以是氮或磷。具体而言，所述带正电荷的元(Y)是氮，与烃基(R1、R2、R3或R4)形成一种胺。
所述带正电荷的元(Y)可跟一个或多个烃基偶合，如至少两个烃基、至少三个烃基，或至少四个烃基，但一般不大于五个烃基。如图示，所述带正电荷的元(Y)包括四个烃基(R1、R2、R3或R4)。所述烃基(R1,R2,R3,or R4)可单独为一个烷基、一个芳基、它们的衍生物或组合。在一个实例中，一个烷烃基可包括一个甲基、乙基、丙基或丁基、它们的一种醚衍生物或一种组合。例如，所述丙基可以是一个正丙基、一个异丙基或它们的一种组合。在一个实例中，所述丁基可以是一个正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基或它们的任一种组合。一种示例性芳基可包括一个苯基、甲苯基、二甲苯基或多芳基(如萘基)、它们的醚衍生物或任一种组合。
具体而言，所述亲脂性反离子[Y(R1)(R2)(R3)(R4)]可包括一种亲脂性铵离子、一种亲脂性鏻离子、一种亲脂性胂离子、一种锍离子或它们的一种组合。一种示例性亲脂性铵离子包括一种四烷基铵、一种四芳基铵、烷基芳基混合铵或它们的一种组合。例如，一种示例性亲脂性铵离子是从如下基团中选择的：四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基铵、它们的烷基芳基混合物，或它们的一种组合。一种示例性亲脂性鏻离子包括四苯基鏻。一种示例性亲脂性胂离子是一种四烷基胂、一种四芳基胂、一种烷基芳基混合胂离子，或它们的一种组合。例如，所述亲脂性胂离子是四苯基胂。一种示例性亲脂性锍离子是一种三烷基锍离子。该离子(Z)可以是跟所述亲脂性基团[Y(R1)(R2)(R3)(R4)]的电性相反的一种离子，如一个氢氧根、一个卤离子、一个硝酸根、一个碳酸根、一个硫酸根、一个高氯酸根、一个苯酚根、一个四烷基硼酸根、一个四芳基硼酸根、一个磷酸根，或它们的任一组合。
由于所述交换，该多聚核苷酸配合物呈现亲脂特性且可分散于一种非水溶剂中。在一个实例中，所述非水溶剂是极性的。又在一个实例中，所述非水溶剂跟所述基质上的偶合基或所述聚合物的官能团，如所述多聚核苷酸配合物的所述反应基团(W)，不起反应。在一个实例中，所示溶剂包括一种酰胺、一种脲、一种碳酸酯、一种醚、一种亚砜、一种砜、一种位阻醇，或它们的一种组合。一种示例性酰胺或脲包括甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N',N'-四甲基脲、N,N'-二甲基-N,N'-三亚甲基脲，或它们的一种组合。一种示例性碳酸酯包括碳酸二甲酯、碳酸丙烯酯，或它们的一种组合。一种示例性醚包括四氢呋喃。一种示例性亚砜或砜包括二甲基亚砜、二甲基砜，或它们的一种组合。一种示例性位阻醇包括叔丁醇。在一个具体实例中，所述溶剂包括N-甲基吡咯烷酮。
所述交换后或作为所述交换的一部分，所述多聚核苷酸配合物可分散于所述非水溶剂中。所述被分散的多聚核苷酸配合物可用于一种基质的偶合。
例如，如图4所示，当所述聚合物微粒204的琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团与一种胺封端的核酸(如一种胺封端的寡核苷酸)反应，尤其是在一种非水溶剂(如上述)里反应的时候，可形成一种微粒物406，其中，所述核酸通过一个酰胺基附接于所述聚合物基质和所述聚合物基质的聚合物主链。
在图5所示的具体实施例中，一个聚丙烯酰胺聚合物网络可包括直接附接于所述聚丙烯酰胺聚合物网络的酰胺基508的氮原子上的基团。例如，一种链烷酸基团502或其酯衍生物可直接附接于所述酰胺508的氮原子上。在一个实例中，所述链烷酸基团502可有3至10个碳原子，如3至8个碳原子，3至6个碳原子，或3至5个碳原子。其它基团可选择性地附接于所述聚丙烯酰胺网络的其它酰胺基上。例如，一种羟基基团510可附接于所述聚合物网络。
为方便所述生物分子的偶合，一种琥珀酰亚胺基化合物，如一种N-羟基琥珀酰亚胺基脲鎓504可跟所述链烷酸基团502反应，比如在一种非水溶剂中反应，形成一种琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团506。如图6所示，在一种非水溶剂中，所生成的琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团506可与一种亲脂性胺封端的核酸反应，将所述核酸偶合到所述聚丙烯酰胺主链上。具体而言，从所述琥珀酰亚胺基链烷酸酯基团506里可除去所述琥珀酰亚胺基，将所述酯基602转化成一种酰胺基606并将所述胺封端的核酸604偶合到所述聚丙烯酰胺主链上。所述胺封端的核酸604可包括通过一个基团(R)与所述胺(H2N-)偶合的一种核酸(NA)上。在一个实例中，R是一个烷基、一个醚基，或它们的任一组合。在一个具体实例中，所述胺封端可位于所述核酸的一个5'端。具体而言，所述偶合可优先在一种非水溶液里进行。
就含有一个聚合物水凝胶网络的一种聚合物基质而言，所述聚合物水凝胶网络可包括一个具有所述烷基酰胺基团的聚丙烯酰胺聚合物网络，该烷基酰胺基团与所述丙烯酰胺聚合物网络的所述酰胺的所述氮原子直接偶合还通过所述官能团(R)与所述核酸偶合，该官能团可以是一个烷基也可以是聚醚基。具体而言，所述烷基可有3至8个碳原子。
以这一方式，原本具有羧基官能团的所述聚合物基质可偶合到一种生物分子(如一种核酸)上。在一个具体实例中，所述核酸可以是与某一模板核酸的一部分互补的一种寡核苷酸引物。在涉及所述模板核酸捕获、所述模板的扩增或所述核酸的检测(如测序)的方法中，被偶合到所述聚合物基质上的所述核酸可接触所述核酸模板，如108图示。具体而言，被偶合到所述聚合物基质上的所述核酸可以是与一种模板核酸的一个3'端部分互补的一种寡核苷酸引物。在一个替代实例中，被偶合到所述聚合物基质上的所述寡核苷酸引物可与所述模板核酸的所述5'端部分互补，也可与所述模板核酸的一个中间部分互补。
尤其在测序应用中，可延伸所述寡核苷酸引物，使其与所述模板核酸互补，如110图示。例如，所述寡核苷酸可作为一种引物，当合适条件下与所述模板核酸缔合并接触酶和核苷酸的时候，它可延伸至与所述模板核酸互补，形成所述模板核酸的一个互补拷贝。从所述延伸的寡核苷酸引物里可选择性地分离出所述模板核酸，并可附接于被偶合至所述聚合物基质的其它互补性寡核苷酸引物上。可延伸其它这样的寡核苷酸引物，生成多个偶合于所述聚合物基质上的所述模板核酸的拷贝。
如112图示，对所延伸的核酸或寡核苷酸引物，可测序，如下所述。所述偶合微粒物也可用于分离技术中。例如，可用所述偶合微粒物捕获模板多聚核苷酸。在一个实例中，偶合于所述聚合物的所述多聚核苷酸可在捕获的目标多聚核苷酸的基础上延伸。这样的偶合微粒物可用于测序技术，如一种基于离子或基于pH的测序技术。
例如，如图7所示，可将多个偶合的聚合物微粒物704，连同多个目标多聚核苷酸702，一起置于一种溶液里。所述多个微粒物704可与探针多聚核苷酸偶合，从而跟目标多聚核苷酸702键合。例如，所述偶合微粒物704可包括与所述目标多聚核苷酸702的一部分互补的一种寡核苷酸。
在一个具体实施例中，所述微粒物704和多聚核苷酸702经历了聚合酶链反应(PCR)扩增。例如，所形成的分散相液滴物706或708作为一种乳液的一部分且可包括一种亲水性水凝胶微粒物或一种多聚核苷酸。在一个实例中，所提供的所述目标多聚核苷酸702和所述亲水性微粒物704具有较低的相互相对浓度和比例，使得单个多聚核苷酸702有可能残留于同样的单一亲水性微粒物704分散相液滴内。其它液滴物，如一种液滴物708，可包括单一亲水性微粒物且无多聚核苷酸。每个液滴706或708可包括酶、核苷酸、盐或其它足以方便所述多聚核苷酸复制的成分。也可采用扩增技术，如有或无乳液的重组酶聚合酶扩增(RPA)。
所述目标多聚核苷酸的复制可包括调节所述复制条件。调节可选择性地包括：增减所述聚合酶的浓度；增减所述核苷酸的浓度；增减某一阳离子的浓度；增减某一反应的温度、时间或pH等等。调节可包括增减所述反应的速率、增减所述反应的产物收率等等。在存在适当的缓冲液或核苷酸(包括核苷酸类似物或生物素化核苷酸)的条件下，可进行复制。
具体而言，待扩增的所述多聚核苷酸可被所述聚合物微粒物捕获。核酸捕获的示例性方法可包括：将一种多聚核苷酸杂交于一种附接于某种聚合物微粒上的寡核苷酸上。核酸捕获方法可包括：(a)提供附接于一种单链寡核苷酸(如一种捕获寡核苷酸)的一种聚合物微粒；(b)提供一种单链多聚核苷酸；和(c)将该单链寡核苷酸杂交到所述单链多聚核苷酸，从而把该单链多聚核苷酸捕获到所述聚合物微粒上。每一个所述聚合物微粒可附接多个单链寡核苷酸(如捕获寡核苷酸)。在若干实施例中，可用多个单链多聚核苷酸进行步骤(c)。在若干实施例中，至少一部分所述单链寡核苷酸包括一个核苷酸序列，该序列与至少一部分所述单链多聚核苷酸互补(或部分互补)。
在一个实例中，所述方法可进一步包括：将所述多聚核苷酸扩增进多个多聚核苷酸，并把至少一部分所述多个多聚核苷酸附接到所述亲水性微粒上，从而生成一种含有多个附接多聚核苷酸的亲水性微粒。所述方法也可包括：通过延伸所述偶合寡核苷酸，把所述多聚核苷酸扩增进多个互补性多聚核苷酸上，从而生成一种含有多个附接多聚核苷酸的水凝胶微粒。
在附加实例中，核酸扩增方法包括：在一种多聚核苷酸上进行一次引物延伸反应，该多聚核苷酸被杂交到一种附接于一种聚合物微粒的寡核苷酸里。在若干实施例中，核酸扩增方法包括如下内容：(a)提供一种附接于一个单链核苷酸(如一个引物寡核苷酸)的聚合物微粒；(b)提供一种单链模板多聚核苷酸；(c)将该单链寡核苷酸杂交到所述单链模板多聚核苷酸上；(d)在适合一种聚合酶催化聚合的条件下让该单链模板多聚核苷酸接触该聚合酶和至少一种核苷酸，使至少一个核苷酸聚合到所述单链寡核苷酸上，以便生成一种延伸的单链寡核苷酸。在若干实施例中，该方法还包含如下内容：(e)从所述延伸的单链寡核苷酸中除去(如进行变性)所述单链模板多聚核苷酸，使得所述单链寡核苷酸仍附接于所述聚合物微粒上；(f)将剩余的所述单链寡核苷酸杂交到第二种单链模板多聚核苷酸；且(g)在适合第二种聚合酶催化聚合的条件下让所述第二种单链模板多聚核苷酸接触该第二种聚合酶和至少一个第二种核苷酸，使至少一个第二种核苷酸聚合到所述单链寡核苷酸上，以便生成一种后续延伸的单链寡核苷酸。在若干实施例中，步骤(e)、(f)和(g)均可至少重复一次。在若干实施例中，所述聚合酶和所述第二种聚合酶包括一种热稳定聚合酶。在若干实施例中，核苷酸聚合的所述合适条件包括在一个高温下进行所述的核苷酸聚合步骤，如步骤(d)或(g)。在若干实施例中，核苷酸聚合的所述合适条件包括在交变温度(如一个高温和一个较低温度)下进行所述的核苷酸聚合步骤，如步骤(d)或(g)。在若干实施例中，所述交变温度的范围为60-95℃。在若干实施例中，所述温度循环周期可介于大约10秒至大约5分钟、大约10分钟或大约15分钟或更长时间。在若干实施例中，核酸扩增方法可产生一个或多个各自附接于多个模板多聚核苷酸的聚合物微粒，所述模板多聚核苷酸包含与单链模板多聚核苷酸或第二单链模板多聚核苷酸互补的序列。在若干实施例中，每一个所述聚合物微粒可附接多个单链寡核苷酸(如捕获寡核苷酸)。在若干实施例中，可用多个单链多聚核苷酸进行步骤(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)。在若干实施例中，至少一部分所述单链寡核苷酸包含一个核苷酸序列，与至少一部分所述单链多聚核苷酸互补(或部分互补)。在若干实施例中，核酸扩增方法(如上述)可在一种油(如分散相液滴)包水溶液里进行。
PCR后，形成微粒，如微粒物710，可包括所述亲水性微粒物712和所述目标多聚核苷酸的多个拷贝714或其互补物。虽然按照图示，所述多聚核苷酸714位于所述微粒物710的一个表面上，但该多聚核苷酸714可在该微粒物710内部延伸。水凝胶和具有较低的水中聚合物的浓度的亲水性微粒可包括位于所述微粒物710的内部和整体的多聚核苷酸片段，或者说，多聚核苷酸可驻留在孔隙和其它开口中。具体而言，该微粒物710可允许以下物质的扩散：酶、核苷酸、引物和用于监测所述反应的反应产物。每颗微粒的多聚核苷酸越多，具体测序技术中的信号越好。
在一个示例性实施例中，在一种测序装置里，可利用所述微粒物710。例如，一种测序装置716可包括一个微孔718阵列。一种微粒物710可置于一个微孔718内。
在一个实例中，可往所述微孔718里加入一种引物，或者说，所述微粒物710可先接触该引物，然后才置于该微孔718里。所述引物和多聚核苷酸形成一种核酸双链体，含有被杂交到该引物上的所述多聚核苷酸(如一种模板核酸)。所述核酸双链体是一种至少部分双链的多聚核苷酸。可向所述微孔718供应酶和核苷酸，以便于进行可检测的反应，如核苷酸掺入。
通过检测核苷酸添加量，可进行测序。采用诸如荧光发射法或离子检测法等方法可检测核苷酸添加量。例如，一组有荧光标记的核苷酸可被提供给所述***716且可迁移至所述微孔718。激发能也可被提供给所述微孔718。当一种核苷酸被一种聚合酶捕获并被添加至一种延伸引物的所述末端的时候，该核苷酸的一个标记可发荧光，指示所添加的核苷酸的类型。
在一个替代实例中，可顺序供给含有一类核苷酸的溶液。为响应核苷酸的添加，所述微孔718的局部环境内的pH可改变。pH值的这一变化可由离子敏场效应晶体管(ISFET)检出。因而可用pH变化产生一个信号，指示与所述微粒物710的所述多聚核苷酸714互补的核苷酸的顺序。
具体而言，一个测序***可包括位于某一离子传感器，如一个场效应晶体管(FET)，的一个传感器垫上方的一个微孔或多个微孔。在若干实施例中，一个***包括一个或多个被装入一个微孔的聚合物微粒，该微孔位于某一离子传感器(如FET)的一个传感器垫的上方，或包括被装入多个微孔的一个或多个聚合物微粒，这些微孔位于离子传感器(如FET)的传感器垫上方。在若干实施例中，一个FET可以是一个化学场效应晶体管，也可以是一个离子敏场效应晶体管。化学场效应晶体管(chemFET)包括一类作为化学传感器的场效应晶体管。它是MOSFET晶体管的结构类似物，其栅极上的电荷是由某一化学过程施加的。离子敏场效应晶体管(ISFET)可用于测量溶液的离子浓度；当该离子浓度(如H+)改变时，流经晶体管的电流相应地改变。
所述FET可以是一个FET阵列。本文件所用的一个“阵列”是传感器或微孔等元件的一个平面排列。所述阵列可以是一维也可以是二维的。一个一维阵列可以是这样一个阵列：在第一维度里有一列(或行)元件且在第二维度里有多行(或列)元件。第一维和第二维的列(或行)数可以相同也可以不同。
在所述FET传感器阵列上可制作一个或多个微流控结构，以供遏制或约束某一生物反应或化学反应。例如，在一个实施例中，所述微流控结构可配置成被置于所述阵列的一个或多个传感器的上方的一个或多个微孔(或显微孔、反应腔、反应孔，因为本文件中，这些术语可互用)，使得某一给定微孔下方的所述一个或多个传感器检测并测量所述给定微孔里的分析物的有无、水平或浓度。在若干实施例中，FET传感器与反应孔可有1:1的对应关系。
返回图7，另在一个实例中，所述微孔阵列的一个微孔718可通过操作而与测量装置连接。例如，对于荧光发射法，一个微孔718可通过操作而与某一光检测装置连接。就离子检测而言，所述微孔718的下表面可置于某一离子传感器(如一种场效应晶体管)的一个传感器垫上方。
涉及通过检测核苷酸掺入的离子副产物而测序的示例性***是Ion TorrentPGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪(Life Technologies)，它们是离子型测序***，通过检测核苷酸掺入所产生的氢离子副产物，对核酸模板测序。一般地，释放出的氢离子是用某一聚合酶进行的依赖于模板的核酸合成的过程中发生的核苷酸掺入的副产物。所述Ion TorrentPGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪通过探测所述核苷酸掺入的氢离子副产物，而检测所述核苷酸掺入。所述Ion Torrent PGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪可包括多个待测序的模板多聚核苷酸，每一模板均置于某一阵列的一个相应的测序反应孔内。所述阵列的每个微孔均可与至少一个离子传感器连接，该离子传感器可探测作为核苷酸掺入的一个副产物的H+离子的释放或溶液pH的变化。所述离子传感器包括与一个离子敏感检测层连接的一个场效应晶体管(FET)，该检测层可探测H+离子的有无或溶液pH的变化。所述离子传感器可提供反映核苷酸掺入的输出信号，该信号可表示为电压变化，该电压变化的幅度与某一相应微孔或反应腔里的H+离子浓度相关。可将不同类型的核苷酸顺序流进所述反应腔，且可由所述聚合酶以一个所述模板的序列所确定的顺序掺入到某一延伸引物(或聚合位点)内。每次核苷酸掺入均可伴有所述反应孔中H+离子的释放，连同该局部pH的一个伴随变化。所述H+离子的释放可由所述传感器的FET记录，该传感器产生信号，表明发生所述核苷酸掺入。某一特定核苷酸流动期间未掺入的核苷酸可不产生信号。来自所述FET的信号的振幅也可与某一特定类型的核苷酸的数目相关，该类核苷酸被掺入到所述延伸核酸分子内，从而允许分辨均聚物区域。因而，在所述测序仪的一次运行期间，多个核苷酸流入所述反应腔，连同多个微孔或反应腔的掺入监测，可让该仪器同时分辨许多核酸模板的序列。
实例
例1.一种羧酸酯-水凝胶的活化。
往5千亿个单位的羧酸酯-水凝胶(水凝胶的名称是LR570；聚合靶物直径为0.55微米，单体供料比例是：5.9％主链单体加上1.8％交联剂；每立方微米的水凝胶聚合体积里有3000万个羧酸酯单体)溶于666微升无水无胺的N-甲基吡咯烷酮(NMP)所形成的一种溶液里，添加6mg O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)、12微升三丁胺和适量NMP，使最终体积为1.0毫升。室温振摇1小时后，将上述混悬液以每分钟15,000转的转速离心分离0.5小时。从所得颗粒沉淀物里除去该混悬液的上清液，再将该颗粒沉淀物重新悬浮于800毫升新鲜的NMP里并以每分钟15,000转的转速离心分离1小时。从NHS酯活化的含有最终颗粒沉淀物的水凝胶里除去其上清液。
例2.水凝胶与胺封端DNA探针的偶合。
往实例1的所述羧酸NHS酯水凝胶颗粒沉淀物里，添加3.14微升7.41mM 5'-胺封端30聚体寡核苷酸(每个寡核苷酸的磷酸根均对应有一个四丁铵反离子)的NMP溶液。用NMP将该混悬液稀释至1500微升。添加0.55微升三丁胺后，将所述反应容器在一个恒温混匀仪中于70℃搅拌16小时。
随后，将所述混悬液以每分钟15,000转的转速离心分离0.5小时，并除去所述颗粒沉淀物中的上清液。再将该颗粒沉淀物重新悬浮于800微升NMP并以每分钟15,000转的转速离心分离0.5小时，除去其上清液。继续将所得颗粒沉淀物重新悬浮于800微升浓氢氧化铵(30％)中并于室温下在一个恒温混匀仪里搅拌15分钟；向该反应混合物中加入400微升去离子水，接着以每分钟15,000转的转速离心分离0.5小时，然后除去其上清液。继续将所得颗粒沉淀物重新悬浮于1.0毫升0.125N氢氧化钠水溶液里并于室温下在一个恒温混匀仪里搅拌15分钟，然后离心分离0.5小时，除去其上清液。通过如下步骤纯化所述寡核苷酸偶合的水凝胶：将所述颗粒沉淀物重新悬浮于1.0毫升蒸馏水中，以每分钟15,000转的转速离心分离0.5小时，除去上清液，并检验该上清液的pH值，重复以上步骤；当所述上清液的洗涤水的pH值达到7时，纯化结束。此时，将所述水凝胶颗粒沉淀物重新悬浮于1.0毫升TE缓冲液(10mM Tris，用HCl调节至pH 8.0的1mM EDTA)并于80℃保温1小时；离心分离(15,000转/分钟，0.5小时)后，按以上方法，用1.0毫升去离子水洗涤所述偶合水凝胶。将所得颗粒沉淀物重新悬浮于1.75毫升去离子水中备用。用一个细胞分选仪检验所述偶合产物的寡核苷酸总含量，显示每个水凝胶微粒含有200,000-300,000个寡核苷酸探针，粒径为0.61微米。
例3.一种羧酸酯-水凝胶的活化。
往750亿个单位的羧酸酯-水凝胶(水凝胶的名称是LT597；直径＝1.2微米，单体供料比例：7.0％主链单体加上在总体中占1.1％的交联剂；每立方微米的水凝胶聚合体积里有400万个羧酸酯单体溶于7200微升无水无胺的N-甲基吡咯烷酮(NMP)所形成的一种溶液里，添加22.6mg O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)、27微升三丁胺和适量NMP，使最终体积为7.5毫升。室温振摇1小时后，将上述混悬液以每分钟15,000转的转速离心分离50分钟。从所得颗粒沉淀物里除去该混悬液的上清液，再将该颗粒沉淀物重新悬浮于4毫升新鲜的NMP里并以每分钟15,000转的转速离心分离1小时。从NHS酯活化的含有最终颗粒沉淀物的水凝胶里除去其上清液。重复一次上述4ml NMP洗涤液/转的步骤。
例4.水凝胶与胺封端DNA探针的偶合。
往实例3的所述羧酸NHS酯水凝胶颗粒沉淀物里，添加193.4微升5.17mM 5'-胺封端30聚体寡核苷酸(每个寡核苷酸的磷酸根均对应有一个四丁铵反离子)的NMP溶液。用NMP将该混悬液稀释至9.976毫升。添加23.8微升42mM三丁胺的NMP溶液后，总反应体积为10ml，将所述反应容器在一个恒温混匀仪中于66℃搅拌16小时。向上述混悬液中，添加10ml水，冷却至室温，再向此混合物中添加10ml 0.25M NaOH。于室温下将该混合物在一个恒温混匀仪中搅拌15分钟，加入1毫升50x TE缓冲液，然后离心分离50分钟，并除去其上清液。将所得颗粒沉淀物重新悬浮于10毫升1x TE中，然后离心分离50分钟，并除去其上清液。此时，将该水凝胶颗粒沉淀物重新悬浮于10毫升1x TE缓冲液并于80℃保温1小时；离心分离(15,000转/分，50分钟)并除去上清液后，按上述方法，用10毫升1x TE洗涤该偶合水凝胶，然后离心分离50分钟，并除去其上清液。将所得颗粒沉淀物重新悬浮于14毫升去离子水中，并用5μm针头过滤器过滤备用。检验所述偶合产物的寡核苷酸总含量，显示每个水凝胶微粒含有2,360,000个寡核苷酸探针，粒径为2.71微米。
第一方面，一个制备某种聚合物基质的方法，包括在一种非水溶剂中让一种羧基活化化合物接触该聚合物基质。所述聚合物基质包括一个链烷酸基团或其酯衍生物。所述羧基活化化合物与所述链烷酸基团反应，形成一种活化的链烷酸酯基团。所述方法还包括：在所述非水溶剂中让一种亲脂性胺封端的寡核苷酸与所述聚合物基质接触，使该寡核苷酸的一个胺封端基团形成一个链烷酰胺基团，替代所述活化的链烷酸酯基团。
所述第一方面的在一个实例中，所述聚合物基质包括带所述链烷酸基团的聚丙烯酰胺。例如，该聚丙烯酰胺是一种交联的聚丙烯酰胺。另在一个实例中，所述聚丙烯酰胺还含有一种链烷醇基团。
所述第一方面的另一个实例和以上实例中，所述链烷酸基团有2至8个碳原子。例如，所述链烷酸基团有3至6个碳原子。
所述第一方面的又一个实例和以上实例中，所述链烷酸基团通过一个极性基团被添加至所述丙烯酰胺官能团。例如，该极性基团是一种聚醚结构。在一个实例中，所述聚醚含有1至10个醚单元。又在一个实例中，所述醚单元源于环氧乙烷或环氧丙烷单元。
在第一方面的一个附加实例和上述实例中，所述聚合物基质是一种聚合物涂料。
在第一方面的另一个实例和上述实例中，所述聚合物基质是一种聚合物水凝胶网络。
在第一方面的又一实例和上述实例中，所述羧酸酯活化化合物是一种琥珀酰亚胺基化合物。
在第一方面的一个附加实例和上述实例中，所述琥珀酰亚胺基化合物包括一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物、一种琥珀酰亚胺基鏻化合物或二者的一种组合。例如，所述琥珀酰亚胺基化合物是一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物。在一个具体实例中，所述琥珀酰亚胺基脲鎓是一种O型脲鎓化合物。
在第一方面的另一个实例和上述实例中，所述方法还包含用所述寡核苷酸接触一种模板核酸，而该模板核酸至少有一部分与所述寡核苷酸互补。例如，所述方法还包括延伸与所述模板核酸互补的所述寡核苷酸。
在第一方面的又一实例和上述实例中，所述胺封端的寡核苷酸含有位于一个5'端上的胺封端。
在第一方面的一个附加实例和上述实例中，所述胺封端的寡核苷酸的所述胺封端包括一个烷基胺封端基团。
在第二方面，一个偶合某种聚丙烯酰胺基质的方法，包括在一种非水溶剂中让一种羧基活化化合物接触该聚丙烯酰胺基质。所述聚丙烯酰胺基质含有一个羧基基团。所述羧基活化化合物与所述羧基基团反应，形成一种活化的链烷酸酯基团。该方法还包括，在所述非水溶剂中让一种亲脂性胺封端的核酸接触所述聚合物基质，使该核酸的所述胺封端基团形成一个酰胺基团，替代所述活化的链烷酸酯基团。
在第二方面的在一个实例中，所述聚丙烯酰胺还含有一个链烷醇基团。
在第二方面的另一实例和上述实例中，所述聚丙烯酰胺基质是一种聚丙烯酰胺涂料。
在第二方面的又一实例和上述实例中，所述聚丙烯酰胺基质是一个聚丙烯酰胺水凝胶网络。
在第二方面的一个附加实例和上述实例中，所述羧基活化化合物是一种琥珀酰亚胺基化合物。例如，所述琥珀酰亚胺基化合物包括一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物、一种琥珀酰亚胺基鏻化合物或二者的一种组合。在一个实例中，所述琥珀酰亚胺基化合物是一种琥珀酰亚胺基脲鎓化合物。例如，所述琥珀酰亚胺基脲鎓是一种O型脲鎓化合物。
在第二方面的另一个实例和上述实例中，所述方法还包含用所述核酸接触一种模板核酸，而该模板核酸至少有一部分与所述核酸互补。例如，所述方法还包括延伸与所述模板核酸互补的所述核酸。
在第四方面，采用上述方面和权利要求所述的方法，形成了一种聚合物水凝胶网络。
在第五方面，一种聚合物微珠，包含一个具有一个链烷酰亚胺基团的聚丙烯酰胺聚合物网络，该链烷酰亚胺基团与所述聚丙烯酰胺聚合物网络的一个氮基团直接偶合，并与一个核酸偶合。
注意，并非在所述概述或所述实例中所描述的所有活动都是必要的，一部分特定活动可能是不需要的，并且除了所述活动之外，还可以进行一个或多个其它活动。另外，活动的列表顺序不一定是它们的执行顺序。
在前述说明书中，已引用具体实施例描述了所述概念。不过，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离以下权利要求书中所阐明的本发明的范围的前提下，可做出各种修改和改变。相应地，说明书和附图被应视为示例性而非限制性的，并且拟将所有此类修改纳入本发明之范围内。
本文件所用的术语“包含”、“包括”、“含有”、“含”、“具有”、“有”或它们的任何其它变体均旨在涵盖非排他性的包含之意。例如，一种包含一系列特征的工艺、方法、物品或装置不一定仅限于那些特征，而是可包括没有明确列出或这类工艺、方法、物品或装置所固有的其它特征。此外，除非明确说明是相反的情况，否则“或”是指包容性“或”而非排他性“或”。例如，下列任一情况满足一个条件A或B：A为“真”(或“存在”)且B为“假”(或“不存在”)，A为“假”(或“不存在”)且B为“真”(或“存在”)，和A和B都为“真”(或“存在”)。
另外，采用“一种”或“一个”描述本文件所述的元件和成分。此举仅为方便起见，并为本发明之范围赋予一般含义。此描述应被理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非其明显具有其它含意。
上文已经针对特定的实施例描述了益处、其它优点和问题解决方案。然而，这些益处、优点、问题解决方案，以及可能导致任一益处、优点或解决方案出现或使其更加显著的任何特征都不应被理解为任一或所有的权利要求的某一关键特征、必要特征或基本特征。
在阅读本说明书之后，技术人员将理解，为清楚起见，本文件在独立实施例的背境下描述的某些特征也可以在单个实施例中以组合方式提供。相反的，为了简洁起见，在单个实施方式中描述的各种特征也可以独立地或以任一亚组合的方式来提供。此外，对范围中所述各值的引用包括该范围内的每个值。

Claims (32)

1.一种制备聚合物基质的方法，所述方法包括：
在非水溶剂中，使聚合物基质与羧基活化化合物接触，所述聚合物基质包含链烷酸基团或其酯衍生物，所述羧基活化化合物和链烷酸基团反应形成活化的链烷酸酯基团；以及
在非水溶剂中，使亲脂性胺封端的寡核苷酸与聚合物基质接触，亲脂性胺封端的寡核苷酸的胺封端基团形成链烷酰胺基团以代替活化的链烷酸酯基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物基质包括具有所述链烷酸基团的聚丙烯酰胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺是交联的聚丙烯酰胺。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺还含有链烷醇基团。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述链烷酸基团具有2至8个碳原子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述链烷酸基团具有3到6个碳原子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述链烷酸基团通过极性基团附接到所述聚丙烯酰胺的丙烯酰胺官能团上。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述极性基团是聚醚结构。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚醚结构包含1至10个醚单元。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述醚单元衍生自环氧乙烷或环氧丙烷单元。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述聚合物基质是聚合物涂料。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述聚合物基质是聚合物水凝胶网络。
13.根据权利要求1–13中任一项权利要求所述的方法，其中所述羧酸酯活化化合物是琥珀酰亚胺基化合物。
14.权利要求13所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基化合物包括琥珀酰亚胺基脲鎓化合物、琥珀酰亚胺基鏻化合物或二者的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基化合物是琥珀酰亚胺基脲鎓化合物。
16.权利要求15所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基脲鎓化合物是O型脲鎓化合物。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，还包含使所述寡核苷酸与模板核酸接触，所述模板核酸至少一部分与所述寡核苷酸互补。
18.根据权利要求17所述的方法，还包含将与所述模板核酸互补的所述寡核苷酸进行延伸。
19.根据权利要求1–18中任一项所述的方法，其中所述胺封端的寡核苷酸含有在一个5'端上的所述胺封端基团。
20.根据权利要求1–19中任一项所述的方法，其中所述胺封端的寡核苷酸的胺封端基团包括烷基胺封端基团。
21.一种偶合聚丙烯酰胺基质的方法，所述方法包括：在非水溶剂中，使羧基活化化合物与所述聚丙烯酰胺基质接触，所述聚丙烯酰胺基质含有羧基基团，所述羧基活化的化合物与所述羧基基团反应，形成活化的链烷酸酯基团；以及
在所述非水溶剂中，使亲脂性胺封端的核酸与所述聚合物基质接触，使所述亲酯性胺封端的核酸的胺封端基团形成一个酰胺基团以代替所述活化的链烷酸酯基团。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺还含有链烷醇基团。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺基质是聚丙烯酰胺涂料。
24.根据权利要求21–23中任一项所述的方法，其中所述聚丙烯酰胺基质是聚丙烯酰胺水凝胶网络。
25.根据权利要求21–24中任一项所述的方法，其中所述羧基活化化合物是琥珀酰亚胺基化合物。
26.权利要求25所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基化合物包括琥珀酰亚胺基脲鎓化合物、琥珀酰亚胺基鏻化合物或二者的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基化合物是琥珀酰亚胺基脲鎓化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺基脲鎓是O型脲鎓化合物。
29.根据权利要求21所述的方法，还包含使所述核酸与模板核酸接触，所述模板核酸至少一部分与所述核酸互补。
30.根据权利要求29所述的方法，还包含将与所述模板核酸互补的所述核酸进行延伸。
31.采用权利要求21–30中任一项所述的方法，形成聚合物水凝胶网络。
32.聚合物微珠，所述聚合物微珠包含聚丙烯酰胺聚合物网络，所述聚合物网络具有与聚丙烯酰胺聚合物网络氮基团直接偶联并与核酸偶联的链烷酰亚胺基团。
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