CN107921030A - 抗体‑药物偶联物的共价连接子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有能与抗体的一个或多个游离巯基共价偶联的连接子的新颖且有益的组合物。具体地，本发明提供了连接子的分子结构、合成途径、偶联机制、以及在抗体‑药物偶联物(ADC)中的应用。

Description

抗体-药物偶联物的共价连接子及其制备方法与应用
本申请要求2016年8月14日提交的美国临时申请62/205,121的权益，其全部内容通过引用并入文本，包括任何附图、表格和图示。
发明背景
抗体药物偶联物(ADCs)是一类快速发展的靶向治疗药物，代表了既提高抗癌药物选择性又提高细胞毒活性的新的有效治疗方法。在美国已被批准用于治疗的ADC药物的实例是brentuximab vedotin(ADCETRIS)，是把嵌合抗CD30抗体偶联到单甲基耳他汀E上，用于治疗间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在设计抗体-药物偶联物时，运用传统的方法涉及将药物分子通过连接部分与抗体链的巯基偶联。游离巯基是通过还原反应破坏抗体的半胱氨酸链间二硫键而获得的。典型的抗体含有4个链间二硫键(重链间2个，重链和轻链间2个)。这些链间二硫键可以用二硫苏糖醇，三(2-羧乙基)膦或其他温和的还原剂选择性地还原，产生8个反应性巯基用于偶联结合。该方法可以实现每个给定的抗体偶联八个药物分子。
基于至少破坏两个二硫键的事实，根据这个原理设计出的ADC一旦进入血液循环，是不稳定的，会导致其半衰期将会缩短。因此，最近的ADC 设计和合成的采用了一种不同的方法，即通过偶联剂共价连接两个巯基，从而在抗体的两条重链之间以及在重链与轻链之间构建巯基桥键联接。目前这种研究方法主要集中在偶联剂的结构设计，该偶联剂不仅具有偶联两个巯基的功能，而且还包含促进发挥特定的生物活性的必要成分。
该领域早期研究是利用双马来酰亚胺与二硫键断裂产生的两个巯基进行反应。马来酰亚胺和巯基之间的共价连接过程是一个典型的烯烃转化反应。最近的巯基桥接反应的研究也是基于这个原理，其中涉及马来酰亚胺，双马来酰亚胺和具有卤素取代基的马来酰亚胺的示例性反应。然而，迄今为止，巯基桥接连接子成分仅限于马来酰亚胺及其衍生物，通常没有指定用于肿瘤靶向的ADC。例如，此前公开的使用类似基于马来酰亚胺及其衍生物与巯基进行共价偶联的方法，未详述活性剂与肿瘤靶向药物分子，蛋白质或多肽偶联的应用(参见例如PCT专利申请公开号WO 2013132268)；其他方法具体公开了利用马来酰亚胺类化合物制备肿瘤靶向ADC中的应用，但没有采用如本发明所提供的其中一个接头同时与两个硫醇基团反应的共价巯基桥接机制(例如参见中国专利申请公开号CN 103933575)。
发明概述
本发明提供了具有优势的将抗体偶联到其他化合物的新型连接子。此外，除了描述此连接子的结构合成和应用，本发明还提供了抗体/活性剂偶联物及其应用，例如在抗体-药物偶联物中的应用。
一些实施例提供了结构如式I的连接子-活性剂：
或其药学上可接受的盐，
其中：R1和R2代表能与巯基反应的官能团；
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数。
一些实施例中，R1和R2独立地选自
及它们的衍生物。
一些实施例提供了靶向部分和连接子活性偶联物，其结构为式II：
或其药学上可接受的盐，
其中：
A是靶向部分；
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或为可以空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数。
每个R3和R4独立地选自：以及它们的衍生物，或者可以为空。
这里用到的“空”是指该实体不存在。
附图说明
图1显示连接子与抗体二硫键断裂或还原后产生的两个相邻巯基反应而建立的共价巯基桥的示意图。
图2是将抗-Her2单克隆抗体与利用Mc-VC-PAB-MMAE制备的细胞毒素偶联获得的抗Her2ADC的SDS-PAGE图。
图3是MSL-C31的HIC-HPLC色谱图。
图4是MSL-C75的还原性SDS-PAGE结果。
图5是MSL-C75的HIC-HPLC色谱图。
图6是还原SDS-PAGE结果，a)裸抗体，b)CD59-C78。
图7是CD59-C78的HIC-HPLC色谱图。
发明详述
在接下来的详细描述中，参考文献包括所附图标，描绘了本发明的示例，非受限的和非详尽的实施例。这些实施例描述的足够详细，使得本领域技术人员能够实践此发明，在不超出本发明的精神或范围的前提下，可以用到其他实施例或进行其他的改变。因此，下面的详细描述不应被认为是限制性的，并且本发明的范围仅由所附权利要求限定。本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均全文引入作为参考，包括所有附图和表格。在某种程度上，这些内容与本发明的描述是一致的。
本发明提供了具有优势地新的连接子，连接子的一端共价偶联到抗体的两个游离巯基并且连接子的另一端与活性剂连接。本发明还提供了抗体/ 活性剂缀合物，包括例示性地抗体-药物缀合物(ADCs)。在一些实施方案中，本文提供的ADC将抗癌药物作为活性剂。
定义
本发明所使用的常用有机化合物的缩写定义如下：
BOC 叔丁氧羰基
Fmoc 9-芴甲氧羰基
℃ 摄氏度
DIPE A 二异丙基乙基胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
R.T. 室内温度
EtOH 乙醇
h 小时
Et3N 三乙胺
HOBt N-羟基苯并***
Prep-HPLC 制备型高效液相色谱
NaHCO3 碳酸氢钠
DCC 二环己基碳二亚胺
MeCN 乙腈
EDC 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺
DIC N,N-二异丙基碳化二亚胺
DEA 二乙胺
K2CO3 碳酸钾
M 摩尔/升
mL 毫升
MgSO4 硫酸镁
THF 四氢呋喃
CH2CL2 二氯甲烷
NaCl 氯化钠
Na2SO4 硫酸钠
HCL 盐酸
LC-MS 液相色谱-质谱仪
CHCL3 氯仿
NaAc 乙酸钠
Ac2O 乙酸酐
TFA 三氟乙酸
NaOH 氢氧化钠
本发明中的术语“活性剂”包括任何天然的或者合成的物质，当用于动物时具有生理功效的。根据本发明，活性剂可用于治疗，例如，恒温动物，特别是包括人类、兽医动物和养殖动物在内的哺乳动物。活性剂可作用于或显示于，动物体内或体上所需的目标，包括肿瘤组织。
“活性剂”包括但不限于：作用于突触部位和神经效应器连接点的药物；总体或局部镇痛药，催眠药和镇静药；用于治疗精神障碍如抑郁症和精神***症的药物；抗癫痫和抗惊厥药；用于治疗帕金森氏病和亨廷顿舞蹈症、衰老和阿尔兹海默症的药物；兴奋性氨基酸拮抗剂、神经营养因子和神经再生剂；营养因子；治疗中枢神经***(CNS)外伤或者中风的药物；用于治疗成瘾和药物滥用的药物；治疗细菌、病毒和/或微生物感染如流感、 HIV、疱疹、水痘等药物；自体活性物质和抗炎药物，治疗寄生虫感染和微生物引起的疾病的化疗药物；免疫抑制剂；抗肿瘤药物；激素和激素拮抗剂；重金属和重金属拮抗剂；非金属毒素拮抗剂；细胞抑制剂；显色剂和其他诊断物质；免疫活性剂和免疫反应剂；递质和它们各自的受体激发剂和受体拮抗剂，以及它们各自的前体和代谢物；转运蛋白抑制剂；抗生素；解痉药；抗组胺药；止呕药；弛缓剂；***；正义寡核苷酸和反义寡核苷酸；脑扩张器；精神药物；抗躁狂药；血管扩张器和压缩器；抗高血压药；治疗偏头痛的药物；高血糖剂和降血糖剂；矿物质和营养剂；抗肥胖药物；促蛋白合成类固醇；抗哮喘药；以及它们的混合物。
“抗体”，也被称为免疫球蛋白，是一种大Y型蛋白，用于免疫***识别和抵抗例如细菌和病毒的外来实体。抗体具有四条肽链，两条相同的重链和两条相同的轻链，由半胱氨酸的二硫键连接。
“单克隆抗体”是一种单特异性抗体，所有的抗体分子是相同的，因为其是由同一个亲本母细胞克隆产生的相同免疫细胞产生。单克隆抗体的制备可通过融合骨髓瘤细胞和已用所需抗原免疫的小鼠脾细胞(或来自兔的B 细胞)，然后通过例如亲和纯化等技术来纯化所得的杂交瘤。除了小鼠，重组单克隆抗体可以在病毒或酵母细胞中制备，利用全克隆或噬菌体/酵母展示技术，也可以通过免疫球蛋白基因片段的克隆来创建氨基酸序列有细微差别的抗体文库，从而获得所需特异性的抗体。所得到的抗体可通过发酵进行大规模制备。
“嵌合”或“人源化”抗体是在重组过程中利用初始抗体(通常是鼠)与人类DNA序列嵌合而成的抗体，例如，编码单克隆抗体的结合部分的小鼠 DNA与人抗体产生DNA以产生部分来源小鼠的，部分来源于人的单克隆抗体。使用转基因小鼠(工程改造产生人抗体)或噬菌体展示文库可以产生全人源抗体。
“连接子”具有两个反应性末端，一端用于结合或缔和生物部分或其片段，例如抗体或其片段，另一端用于偶联例如：细胞毒素等活性剂。
“细胞毒素”是指当存在细胞(如癌细胞)时对细胞有毒或诱导该细胞发生关键功能改变的实体。
本发明中的术语“烷基”表示直链或者支链的饱和碳氢化合物(即，不包含双键或三键)。烷基基团可以带有1到9个碳原子(当其在本发明中出现时，“1到9”的数值范围表示此范围中的任意一个整数，例如，“1到9个碳原子”表示此烷基基团可以包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，一直到9个碳原子。同时，此烷基的定义也包括无指定链长度的烷基)。烷基基团可以是包含1到9个碳原子的中等尺寸烷基。典型的烷基基团包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本发明中的术语“烯基”表示包含一个或多个双键的直链或者支链的碳氢化合物。烯基基团可以带有2到9个碳原子，也包括无指定链长度的烯基。烯基基团可以是包含2到9个碳原子的中等尺寸烯基。烯基基团也可以是包含2到4个碳原子的小尺寸烯基。烯基基团可以被设计为“C2-4烯基”或者相似设计。仅举例而言，“C2-4烯基”表示烯基链中有2-4个碳原子，即，烯基链的选择范围如下：乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯 -1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基、丁-1,2-二烯基-4-基。典型的烯基包括，但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。
本发明中的术语“炔基”表示包含一个或多个三键的直链或者支链的碳氢化合物。炔基基团可以带有2到9个碳原子，也包括无指定链长度的炔基。炔基基团可以是包含2到9个碳原子的中等尺寸炔基。炔基基团可也以是包含2到4个碳原子的低级炔基。炔基基团可以被设计为“C2-4炔基”或者相似设计。仅举例而言，“C2-4炔基”表示炔基链中有2-4个碳原子，即，炔基链可选自：乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、丁炔-3-基和2-丁炔基。典型的炔基包括但不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。
本发明中的术语“芳基”表示具有共轭π电子***的环或环***，并且包括碳环芳基(例如苯基)和杂环芳基(例如：吡啶)。该术语包括单环或多个稠环(即共享一对相邻原子的环)基团，整个环***是芳香性的。
本发明中的“环烷基”表示完全饱和的碳环或环体系。实例包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
本发明中的“杂芳基”表示包含一个或多个杂原子的芳香环或环体系
(即，共用两个相邻原子的两个或多个稠环)，即在环骨架上除碳外，包括但不限于，氮、氧、硫等元素。当杂芳基是一个环***时，***中的每个环都是芳香族的。杂芳基可具有5-18个环成员(即，构成环骨架的原子数，包括碳原子和杂原子的数目)，目前的定义也包括无指定环大小的杂芳基。杂芳基的实例包括但不限于，呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、恶唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异恶唑基、异噻唑基、***、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并恶唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基。
本发明中的“杂环基”是指在非芳香环或环体系的骨架中含有至少一个杂原子。杂环基可以稠环、桥环或螺环的方式连接。杂环基的环体系中至少有一个环是非芳香性的，其可具有任意的饱和度。所述的杂原子可位于该环体系的非芳香环或芳香环上。所述杂环基可以具有3至20个环上原子(即，构成环骨架的原子数，包括碳原子和杂原子的数目)，目前的定义也包括无指定环数目范围的杂环基。杂环基团可以是包含3到10个环上原子的中等尺寸杂环基，杂环基团可以是包含3到10个环上原子的中等尺寸杂环基。杂环基团也可以是包含3到6个环上原子的小尺寸杂环基。
杂环基环的实例包括但不限于：氮杂环庚烯基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环丁烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二氧杂环己烯基、1,3-二恶烷基、1,4-二氧杂环己烯基、1,4-二恶烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,3-二氧戊环基、1,3-二硫戊环基、1,3-二硫戊环基、异恶唑啉基、异恶唑烷基、恶唑啉基、恶唑烷基、恶唑烷酮基、恶唑烷酮基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烯基、二氢吲哚基、异吲哚啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。
本发明中的“杂环基烷基”是指杂环基作为取代基通过亚烷基与其他基团相连。实例包括但不限于，咪唑啉甲基和二氢吲哚基乙基。
连接子/活性剂
一方面，本发明提供了连接子-活性剂，其结构为式I：
或其药学上可接受的盐，
其中：R1和R2代表能与巯基反应的官能团；
L1、L2、L代表连接子或为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数。
每个R1和R2都是可以与巯基反应的功能基团。
在一些实施例中，这两个巯基官能团中的任何一个都可以独立地选自马来酰亚胺、卤素、卤素取代的官能团、烷醛、烷酮、磺酰基烯烃、硅烷、异氰酸酯或降冰片烯，但是这两个官能团不能同时是马来酰亚胺也不能同时是卤素。
在具体的实施例中，每个R1和R2独立地选自：
以及它们的衍生物。
其中，在这个实施例中，R5、R6和R7独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(＝O)R12、C(＝O)OR8、 C(＝O)NR10R11、C(＝S)OR8、C(＝S)NR10R11、C(＝S)SR9、NR10(C＝O)R12、NR10(C＝S)NR10R11、O(C＝O)NR10R11、SO2R9、S(＝O)2OR8，及其组合，其中R8、R9、R10、R11、R12独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基，以及组合。
其中X是卤素，在部分实施例中，X可以是F、Cl、Br或I；
R1和R2可以相同或不同；
在一些实施例中，M选自C-R5、N、B、P、Si-R5、芳基、杂芳基、环烷基、(杂环基)烷基，其中，R5可以选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
在其他实施例中，M选自：
在具体实施例中，M可以选自：
在部分实施例中，Q是活性剂，选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、 DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调节剂、肽类以及核苷酸等。
在部分实施例中，Q选自美登素、耳他汀、加利车霉素、多柔比星、倍癌霉素和吡咯并苯并二氮杂。
在具体实施例中，Q选自MMAE、MMAF、PBD二聚体、DM1、DM4。活性剂可以是WO2013085925A1中公开的任一种活性剂，其全部内容通过引用并入文本。这里用到的“药物”和“活性剂”可以相互交换使用。
在一些实施例中，每个内部连接部分L1和L2独立地选自C1-C6烷基、 C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳香基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR6、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR6、C＝NR6、C(＝S)O、 C(＝S)NR6、C(＝S)S、NR6(C＝O)、NR6(C＝S)NR7、O(C＝O)NR6、S(＝O)2，以及它们的任意组合；
其中，R6和R7独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
在其他实施例中，每个L1和L2独立地选自：
或者为空。
在具体实施例中，每个L1和L2独立地选自：
或者可以为空。
L表示连接子，连接毒素Q到连接基团M。在部分实施例中，L包括不可裂解的单元，但在其他实施例中，L包括可裂解的单元。抗体-药物偶联物可具有1个连接子、2个连接子、3个连接子、4个连接子、5个连接子或6个连接子。
在一些实施例中，L选自C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、芳香基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR8、C(=O)、 C(=O)O、C(=O)NR8、C=NR8、C(=S)O、C(=S)NR8、C(=S)S、NR8(C=O)、 NR8(C=S)NR9、O(C=O)NR8、S(=O)2、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、 Ala-Ala-Asn-PAB、Ala-PAB、PAB以及它们的任意组合。
在这个实施例中，其中R8和R9独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、 C2-C6炔基。
在一些实施例中，L可以为空。当L为空时，活性剂Q直接连接到基团M上。
在一些实施例中，L可选自：
或者为空。
在一些实施例中，L可独立选自：
或者为空。
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式I的连接子-活性剂偶联物的具体结构是：
另一个方面，本发明提供了抗体-药物偶联物，其结构式为式Ⅱ：
或其药学上可接受的盐，
A是靶向部分；
S是靶向部分之巯基基团的硫原子；
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数；及每个R3和R4通过S和可与巯基反应的官能团之间的反应而形成。
在一些实施例中，这两个能与巯基反应的官能团中的任何一个都可以独立地选自马来酰亚胺、卤素、卤素取代的官能团、烷醛、烷酮、磺酰基烯烃、硅烷、异氰酸酯或降冰片烯，但是这两个官能团不能同时是马来酰亚胺也不能同时是卤素。
在具体的实施例子中，每个R3和R4都可以独立地通过巯基与以下结构的基团进行反应来形成： 及它们的衍生物。
其中，在这个实施例中，R5、R6和R7独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基，C3-C9杂环基、聚乙二醇、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(＝O)R12、C(＝O)OR8、 C(＝O)NR10R11、C(＝S)OR8、C(＝S)NR10R11、C(＝S)SR9、NR10(C＝O)R12、NR10(C＝S)NR10R11、O(C＝O)NR10R11、SO2R9、S(＝O)2OR8及其组合，其中R8、R9、R10、R11、R12可独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或它们的组合物。
在某些实施方案中，R3和R4具有10个或更少碳原子，优选5个或更少的碳原子是环状和/或包括酮基团。
在具体的实施例中，R3和R4都可以独立地选自： 以及它们的衍生物。在一个实施例中，R3和R4能够连接2个巯基以使抗体的轻-重链更加稳定。
当R3或R4为空时，L1或L2直接连到靶向部分上。
R3和R4可以是相同或不同。
只有当R3是时，R3和R4可以相同。
在一些实施例中，M可以选自，例如，C-R5、N、B、P、Si-R5、芳香基、杂芳基、环烷基、(杂环基)烷基，R5选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、 C2-C6炔基。
在其他的实施例中，M可以选自以下基团：
在具体实施例中，M可选自：
在一些实施例中，Q是活性剂，选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、 DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调节剂、肽类以及核苷酸等。这里用到的“药物”和“活性剂”可以相互交换使用。
在一些实施例中，Q选自美登素、耳他汀、加利车霉素、多柔比星、倍癌霉素和PBD。
在具体实施例中，Q选自MMAE、MMAF、PBD二聚体、DM1、DM4。在WO 2013085925A1中描述的活性化合物可以通过引用并入本专利。
在部分实施例中，每个内部连接部分L1和L2独立地选自C1-C6烷基、 C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR6、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR6、C＝NR6、C(＝S)O、 C(＝S)NR6、C(＝S)S、NR6(C＝O)、NR6(C＝S)NR7、O(C＝O)NR6、S(＝O)2，以及它们的组合物。
其中，在这个实施例中，R6和R7独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
在其他实施例中，每个L1和L2独立地选自：
或者可以为空。
在具体实施例中，每个L1和L2独立地选自：
或者可以为空。
L表示连接子，连接毒素Q至连接基团M。在部分实施例中，L包括不可分割的单元，但在其他实施例中L包括可分割的单元。抗体-药物偶联物可具有1个连接子、2个连接子、3个连接子、4个连接子、5个连接子或6个连接子。
在一些实施例中，L选自C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR8、C(＝O)、 C(＝O)O、C(＝O)NR8、C＝NR8、C(＝S)O、C(＝S)NR8、C(＝S)S、NR8(C＝O)、 NR8(C＝S)NR9、O(C＝O)NR8、S(＝O)2、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、 Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、Ala-PAB、PAB以及它们的组合。
在这个实施例中，其中R8和R9独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、 C2-C6炔基。
在一些实施例中，L可以为空。当L为空时，活性剂Q直接与M相连。
在一些实施例中，L可选自：
或者可以为空。
在部分实施例中，L可选自：
者可以为空。
A是靶向部分。在一些实施例中，A可以选自抗体，抗体片段、替代体或变体，蛋白配体，蛋白支架，多肽，小分子配体。抗体片段可以是Fab、 Fab’、(Fab’)2、scFv、Fv片段。
本发明中的靶向的肿瘤相关抗原的实例包括但不限于以下列出的(1) 至(36)的肿瘤相关抗原。我们提供了每个抗原实例的名称、别称和GenBank 登录号。对应于这些示例性肿瘤相关抗原的核酸和蛋白质序列可以在 GenBank等公共数据库中找到。
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-1B型，GenBank登录号 NM_001203)；
(2)E16(LAT1、SLC7A5，GenBank登录号bandit_00:3486)；
(3)STEAP1(***6次跨膜上皮抗原，GenBank登录号NM_012449)；
(4)0772P(CA125、MUC16，GenBank登录号AF361486)；
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞强化因子、间皮素，GenBank 登录号NM_005823)；
(6)Napi3b(NAP1-3B、NPTI1b、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠) 成员2、II型钠依赖的磷酸盐转连蛋白3b，GenBank登录号NM_006424)；
(7)Sema5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、脑信号蛋白5b Hlog、sema结构域、七个血小板反应蛋白重复(I型和类I 型)、跨膜结构域(TM)和短的细胞质结构域、(脑信号蛋白)5b，GenBank 登录号AB040878)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008016Rik、RIKEN cDNA2700050C12、RIKENcDNA2700050C12基因，GenBank登录号 AY358628)；
(9)EBER(内皮素B型受体，GenBank登录号AY275463)；
(10)MSG783(RNF124、假象蛋白FLJ20315，GenBank登录号 NM_017763)
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAPI、STAMPI、STEAP2、 STMP、***癌相关基因I、***癌相关蛋白I、***的六次跨膜上皮抗原2、六次跨膜***蛋白，GenBank登录号AF455138)；
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体潜在阳离子通道、亚家族M、成员4，GenBank登录号NM_017636)；
(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGFI，畸形癌衍生生长因子，GenBank登录号NP_003203或NM_003212)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR((C3d/EB病毒受体)或Hs.73792， GenBank登录号M26004)；
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29，GenBank 登录号NM_000626)；
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白Ia)、SPAP1B、SPAP1C，GenBank登录号NM_030764)；
(17)HER2(ErbB2，GenBank登录号M11730)；
(18)NCA(CEACAM6，GenBank登录号M18728)；
(19)MDP(DPEPI，GenBank登录号BC017023)；
(20)IL20Ra(IL20Ra、ZCYT0R7，GenBank登录号AF184971)；
(21)Brevican(BAAN、BEHAB，GenBank登录号AF229053)；
(22)EphB3R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5，GenBank登录号 NM_004442)；
(23)ASLG659(B7h，GenBank登录号AX092328)；
(24)PSCA(***肝细胞抗原前体，GenBank登录号AJ297436)；
(25)GEDA(GenBank登录号AY260763)；
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体、BLyS受体3、BR3，GenBank登录号AF116456)；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型，GenBank登录号AK026467)；
(28)CD79a(CD79A、CD79a、免疫球蛋白相关α、与Ig(CD79B)共价相互作用并在表面与IgM分子形成复合物、转导B细胞涉及B细胞信号特异性蛋白，GenBank登录号NP_001774.1)；
(29)CXCR5(Burkit’s淋巴瘤受体1、被CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥作用，可能会影响HIV-2 传染、AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤、和白血病，GenBank登录号NP_001701.1)；
(30)HLA-D0B(Beta亚基(Ia抗原)的MHCII类分子，其结合多肽并将其呈递到小淋巴的CD4+T细胞，GenBank登录号NP_002111.1)；
(31)P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经再生，其缺陷可能导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理状况，GenBank登录号NP_002552.2)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2，GenBank登录号
NP_001773.1)；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(BP105)，富含亮氨酸重复(LRR)的I型膜蛋白家族，调节B细胞活化、凋亡及功能丧失，并与***性红斑狼疮患者疾病活动增强有关，GenBank登录号NP_005573.1)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，免疫球蛋白Fc结构域的假定受体，包含C2型Ig样和ITAM结构域，可能在B细胞分化中起作用，GenBank登录号NP_446170.1)；
(35)IRTA2(免球蛋白超家族易位相关受体2，假定的免疫受体，可能在B细胞发育和淋巴瘤发生中起作用；发生在B细胞恶性肿瘤中易位会导致家族遗传病，GenBank登录号NP_112571.1)；
(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖，与生长因子的EGF/调蛋白家族和卵泡抑素相关，GenBank登录号AF179274)。
在具体实施例中，A为靶向肿瘤相关抗原的人源化单克隆抗体，其抗体包括但不限于：曲妥珠单抗(anti-HER2)、帕妥珠单抗(anti-HER2)、利妥昔单抗(anti-CD20)、阿伦单抗(anti-CD52)、B贝伐珠单抗(anti-VEGF)、阿达木单抗(anti-TNF-alpha)、西妥昔单抗(anti-EGFR)、阿马西单抗(anti-mesothelin)、博纳吐单抗(anti-CD19)、本妥昔单抗(anti-CD30)、 Certolizumab pegol赛妥珠单抗(anti-TNF-alpha)、帕尼单抗(anti-EGFR)、尼妥珠单抗(anti-EGFR)、吉妥珠单抗(anti-CD33)、高利单抗 (anti-TNF-alpha)、替伊莫单抗(anti-CD20)、英利昔单抗(anti-TNF-alpha)、伊匹单抗(anti-CTLA-4)、奥法木单抗(anti-CD20)、托西莫单抗 (anti-CD20)。
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在一些实施例中，结构式为式II的抗体-药物偶联物的具体结构是：
在具体实施例中，上述化合物中，A包括但不限于曲妥珠单抗。
治疗用途
在具体实施例中，本发明的缀合物能够治疗癌症，包括但不限于：淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴恶性瘤。这种癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝癌、胃癌、胃部癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、脑胶质瘤、宫颈瘤、卵巢癌、口腔癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌症、肝瘤、乳腺癌，包括例如，HER2阳性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、B-细胞淋巴瘤、脑癌、头颈部癌和相关转移性肿瘤。
本发明的偶联物也可用于传递活性剂，用于治疗多种其他疾病，包括但不限于炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经***疾病和心血管疾病。
诊断用途
在其它实施例中，本发明的偶联物包含可检测的实体用作活性剂。例如，此可检测的实体可以是显色剂。显色剂可以是合成的或天然的产物，通过合适的成像或诊断设备，如电子显微镜，在可检测的波长范围内，能够反射或发射光。合适的显色剂包括但不限于有机染料、食品染料和荧光染料。
因此，在一个实施例中，本发明提供了一种诊断方法，该诊断方法包括：把怀疑具有目标分析物样品与本发明中的抗体-药物偶联物进行接触，其中，靶向部分选择性地结合到目标分析物上，Q是可检测的实体和/或是可以与一个或多个额外的实体会与之相结合的实体，所述的一个或多个额外的实体是可检测的实体，所述方法还包括分析所述样品以确定可检测的实体的存在，此实体存在表示目标分析物存在。在一个实施例中，此分析物是HER2，或者其它的与癌症相关的抗原。此方法可以在体内或体外进行。
抗体-药物偶联物的生物学活性
可以使用已知的方法对本发明的偶联物的药效和毒性进行评价。例如，某一特定的化合物或某类化合物的毒性可以通过对细胞系的体外毒性来判断，细胞系例如为哺乳动物的细胞系，尤其是人类细胞系。这些研究结果通常能预测在动物，例如哺乳动物，尤其是人中的毒性。可选择地，可以使用已知的方法来判定某类化合物在小鼠、大鼠、兔、狗、或猴等动物模型中的毒性。
某一特定化合物的药效的判定可以使用体外实验、动物模型和人体临床试验等公认的方法评价，几乎每一类病症都存在本领域认可的体外模型，包括本文公开的化合物能够治疗的病症，包括癌症，心血管疾病和各种免疫***功能障碍以及传染病。类似地，可以使用可接受的动物模型来判断治疗上述疾病时的效果。当选择模型以确定功效时，本领域普通技术人员可以根据现有技术的指导选择合适的模型，剂量和给药途径以及方案。
可以通过测定抗体的任何常规方法来测定本文提供的复合物对目标靶标的结合亲和力和特异性。本发明提供的复合物可以通过常规分析方法来进行抗癌药效的测定，如细胞抑制试验/细胞毒试验，细胞培养的效力测定，异种移植模型以及类似试验。
结合试验技巧和参考资料，根据目前技术发展水平，本领域技术人员能很容易选定合适的测定方法。从这些试验的结果中，我们可以确定作为抗肿瘤药物的合适剂量，并从这些试验的结果中确定用于治疗人类癌症的合适剂量。
剂型和给药方式
除了上述描述的复合物，该发明的药物组合物还包括一种生理上可接受的载体和/或稀释液，注射动物体内后能够将复合物运输到靶点。载体和/ 或稀释液一般是任何合适地介质，这样既能够达到预期目的，也不影响偶联物结合目标靶点的能力和将药物运输到靶点后的药效性能。特别地，载体和/或稀释液不能影响治疗剂的药理作用和复合物与目标靶点体内或体外结合的能力。优选地，载体和/或稀释液最好选自水、含有盐和/或缓冲剂的生理上可接受的水溶液或动物机体可接受的其它溶液。对于本领域技术人员来说，这些载体和溶液可以是蒸馏水、去离子水、纯化或超纯水、盐溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)以及含有与药物靶向***的其他成分相容的常用缓冲溶液。
所述组合物可以通过如下方式来进行给药，包括但不限于：(a)口服途径给药，剂型包括胶囊、片剂、颗粒、喷雾、糖浆或其他形式；(b)非口服途径给药，剂型包括水性悬液、油状制剂或点滴制剂、栓剂、膏剂或类似物，通过皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮内注射或其他方式给药；(c)局部给药；(d)直肠给药或(e)***给药，这些都是本领域技术人员认为适合将本发明实施例中的化合物与活体组织直接接触的给药方式及；(f)通过缓控释剂、储存释放、输液泵方式给药。
作为这种给药方式的进一步实例和给药方式的进一步公开，本发明公开了公开的化合物和药物组合物的各种给药方法，包括通过眼内、鼻内和耳内途径的给药方式。
在特定地实施例中，本发明提供的复合物可制成溶液，以静脉给药形式存在，或者以浓缩冻干形式存在，复溶后静脉给药(复溶例如用：生理盐水，5％葡萄糖溶液，或类似的等渗溶液)。通常通过静脉注射或输注给药。药物制剂领域技术人员，尤其是抗肿瘤抗体制剂人员，结合技能和参考资料，在开发合适的制剂方面没有困难。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明，这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例I连接子-活性剂偶联物的合成
实施例1-1化合物9的合成
i)三乙胺Et3N，甲醇MeOH，室温，2h；
ii)NaH，四氢呋喃THF，室温，5h；
iii)HCl，1,4-二氧六环，室温，16h；
iv)NaHCO3，水/四氢呋喃H2O/THF，室温，3h；
v)1-羟基苯并***HOBt，N,N'-二异丙基碳二亚胺DIC，N,N-二异丙基乙胺DIPEA，N,N-二甲基甲酰胺DMF，室温，12h；
vi)三乙胺Et3N，二氯甲烷CH2Cl2，室温，2h。
化合物2的合成
将1,3-二氨基-2丙醇(3.15g,0.035mol)和三乙胺(4.85mL,0.035mol)溶于甲醇(120mL)中，升温至45℃，向该溶液中缓慢逐滴滴加二碳酸二叔丁酯(Boc)2O(17.05g,0.078mol)的甲醇(80mL)溶液；完毕后，反应体系在45℃温度下搅拌30min，然后在室温下反应1.5h。减压去除溶剂，用*** (200mL)萃取粗产物3次，无水硫酸钠干燥，得到白色粉末状的化合物2 (9.94g,97.8％)。LC-MS m/z(ES+)，291.19(M+H)+。
化合物3的合成
将化合物2(3.89g,13.4mmol)溶于无水四氢呋喃(40mL)，在室温下加入溴乙酸叔丁酯(5.41mL,33.5mmol)。随后向该溶液中加入NaH(60％的含量分散于矿物油中，2.42g，60.5mmol)，反应5h后过滤。蒸发滤液，所得粗品用柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10：1-5：1)，得到白色固体化合物3(3.96g,73.1％)。LC-MS m/z(ES+)，405.26(M+H)+。
化合物4的合成
取化合物3(1.0g,2.5mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)中，搅拌，室温下加入5mL盐酸。室温反应16h。反应结束后，去除溶剂，得到白色粗产品(384.2mg,69.8％)。化合物4可以不经过纯化，可直接进行下一步反应。 LC-MS m/z(ES+)，221.05(M+H)+。
化合物5的合成
将化合物4(242.1mg,1.1mmol)溶于饱和碳酸氢钠/四氢呋喃的混合液 (v/v＝1:1,20mL)中，降温至0℃，加入丙烯酰氯(267μL,3.3mmol)。反应体系在0℃下剧烈搅拌10min后，升至室温反应3h。加入盐酸调节至pH<4，用50mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用饱和氯化钠(40mL)溶液洗涤，用无水硫酸镁进行干燥，过滤并去除溶剂，粗产品通过prep-HPLC纯化，得到了灰色粉末状产物5(196.0mg,69.6％)。LC-MS m/z(ES+)，257.12 (M+H)+。
化合物7的合成
将化合物5和N,N-二异丙基乙胺DIPEA(16.5μL,0.10mmol)溶于无水 N,N-二甲基甲酰胺(DMF，6mL)，降温至0℃，在0℃下加入HOBt(14.9mg, 0.11mmol)和DIC(13.9mg,0.11mmol)；15分钟后，加化合物6到反应混合物中，升至室温，搅拌过夜。反应结束后，加水(10mL)稀释，并用乙酸乙酯(20mL)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥有机相，真空去除溶剂。粗产品通过柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得到白色固体化合物7(24.3mg,62.6％)。LC-MS m/z(ES+)，467.22(M+H)+。
化合物9的合成
将化合物7(140.1mg,0.3mmol)溶于5mL CH2Cl2，冰浴降温至0℃；加入三乙胺Et3N(1mL,0.01mmol)和化合物8(73.7mg,0.1mmol)，在0℃下继续搅拌反应30min。然后升至室温下反应1.5h。反应结束后，减压去除溶剂，粗产品通过prep-HPLC纯化，得到了白色粉末状化合物9(90mg,74.8％)。 LC-MS m/z(ES+)，1204.49(M+H)+。
实施例1-2化合物17的合成
ⅰ)Et3N，CH2Cl2，室温，5h；
ⅱ)Et3N，THF，室温，4h；
ⅲ)CH2Cl2，室温，12h；
ⅳ)TFA，CH2Cl2，室温，3h；
ⅴ)K2CO3，H2O/EtOAc，室温，5h；
ⅵ)HOBt，DIC，DIPEA，DMF，室温，24h。
化合物11的合成
将化合物10(263.3mg,1.15mmol)溶于CH2Cl2(15mL)、Et3N(5.9μL, 0.04mmol)，在0℃下加入化合物6(300.1mg,0.39mmol)。升至室温下反应 5h。反应结束后，真空去除溶剂，粗产品通过prep-HPLC纯化，得到了白色固体合物11(193.2mg,49.7％)。LC-MS m/z(ES+)，994.43(M+H)+。
化合物13的合成
取化合物12(0.45g,4.2mol)和三乙胺(8mL,0.06mmol)溶于THF (15mL)，在0℃下将2-(叔丁氧羰基亚胺基)-2-苯乙腈(2.1g,8.3mol)的THF (30mL)溶液滴加到反应混合物中，滴加结束后升至室温下继续搅拌4h。反应结束后，将反应混合物减压浓缩至油状物并加CH2Cl2(50mL)，用氢氧化钠溶液(5％,30mL)和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤；减压去除滤液中的溶剂，粗产品通过柱层析纯化(硅胶，甲醇：二氯甲烷＝1：10， v/v)，得到黄色油状的化合物13(803.1mg,60.7％)。LC-MS m/z(ES+)， 304.22(M+H)+。
化合物14的合成
化合物13(800.1mg,2.65mmol)溶于CH2Cl2(10mL)，加入丁二酸酐 (265.2mg,2.65mmol)，反应混合物将反应混合物于室温下搅拌过夜。反应结束后，减压浓缩至油状物，粗产品通过柱层析纯化(硅胶，甲醇：二氯甲烷＝1：8)，得到灰色油状化合物14(506.5mg,47.6％)。LC-MS m/z(ES+)，404.24 (M+H)+。
化合物15的合成
将化合物14(503.5mg,1.25mmol)溶于CH2Cl2(10mL)，加入三氟乙酸(2mL)，室温下反应3h。结束反应后，减压去除溶剂，得到灰色油状化合物 15(190.2mg,75.1％)。无需进一步纯化。LC-MS m/z(ES+)，204.13(M+H)+。
化合物16的合成
将碳酸(68.3mg,0.5mmol)的水溶液(5mL)和溶于乙酸乙酯(10mL)中化合物15(67.2mg,0.33mmol)的混合物中加入丙烯酰氯(53.6μL, 0.67mmol)，冰浴降温，在0℃下向混合液中逐滴滴加丙烯酰氯(53.6μL, 0.67mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液，10min后升至室温下反应5h。反应结束后，用盐酸调节体系至pH<5；用乙酸乙酯(20mL)萃取2次，合并有机相并用饱和氯化钠(20mL)洗，无水硫酸镁干燥，过滤，去除溶剂；粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝10：1)，得到黄色油状化合物16(63.1mg, 61.7％)。LC-MS m/z(ES+)，312.15(M+H)+。
化合物17的合成
将化合物16(22.2mg,0.07mmol)，HOBt(9.7mg,0.07mmol)和DIC(11μL, 0.07mmol)溶于8mL DMF，冰浴降温至0℃，在0℃下加入化合物11(59.1mg, 0.06mmol)和DIPEA(12.4μL,0.07mmol)至混合物中，然后升至室温下继续反应24h。浓缩，粗产品通过prep-HPLC纯化，得到白色固体化合物17 (11.3mg,39.5％)。LC-MS m/z(ES+)，1287.56(M+H)+。
实施例I-3化合物25的合成
ⅰ)HOBt，DIPEA，吡啶，DMF，室温，32h；
ⅱ)EDA，DMF，室温，2h；
ⅲ)Et3N，CH2Cl2，室温，4h；
ⅳ)Et3N，CH2Cl2，室温，12h；
ⅴ)EDCI，HOBt，DIPEA，CH2Cl2，室温，24h。
化合物20的合成
将化合物18(191.6mg,0.25mmol)溶于DMF(15ml)并搅拌，在0℃氮气保护下加入HOBt(33.8mg,0.25mmol)和化合物19(197.3mg,0.26mmol)。15min后，加入吡啶(3ml)和DIPEA(52.4μL,0.30mmol),0℃下反应30min。然后升至室温下，搅拌3小时。向反应混合物补加DIPEA(52.4μL, 0.30mmol)，室温下继续反应32小时。反应结束后，减压去除溶剂，粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝20：1)，得到白色固体化合物20 (126.4mg,37.5％)。LC-MS m/z(ES+)，1344.77(M+H)+。
化合物21的合成
在室温下，将化合物20(126.4mg,0.01mmol)溶于DMF(8ml)溶解，室温加入二乙胺(4mL,38.8mmol)。搅拌2h后，减压去除溶剂，得到粗产品 21(104.1mg,99％)，无需纯化，可直接进行下一步反应。LC-MS m/z(ES+)， 1123.72(M+H)+。
在室温下，将二乙胺(4mL,38.8mmol)加入化合物20(126.4mg, 0.1mmol)的DMF(8mL)溶液中。搅拌2小时后，减压除去溶剂，得到粗产物21(104.1mg,99％)。该产品可以在不经过纯化的情况下用于下一步。 LC-MS m/z(ES+)，1123.72(M+H)+。
化合物23的合成
将丙烯酰氯(7.31mL,90.00mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液滴加到化合物22(2.64g,20.00mmo)和Et3N(16.60mL,120.00mmol)的无水 CH2Cl2(60mL)溶液中，此反应在0℃下在氩气下进行。使上述混合物升温至室温并反应4小时。然后将混合物用饱和碳酸氢钠溶液(150mL)和盐水 (150mL)处理，并用CH2Cl2(150mL×3)萃取。用无水硫酸镁干燥合并的有机层，真空除去溶剂。通过柱色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)纯化粗产物，得到呈白色固体的化合物23(4.88g,83.0％)。LC-MS m/z(ES+)，295.10 (M+H)+。
化合物24的合成
取化合物23(444.1mg,1.5mmol)和Et3N(0.23mL,1.66mmol)溶于 CH2Cl2(30ml)溶液中，逐滴加入巯基乙酸(0.23mL,3.32mmol)的CH2Cl2 (5ml)溶液；滴加完毕后，将体系升至室温下搅拌过夜。反应结束后，真空去除溶剂，粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝60：1-30：1)，得到黄色油状化合物24(1.72g,36.87％)。LC-MS m/z(ES+)，385.10(M+H)+。
化合物25的合成
取化合物24(22.2mg,0.057mmol)，HOBt(9.3mg,0.069mmol)和 EDCI(9.3mg,0.069mmol)溶于5mlCH2Cl2。随后，将化合物21(64.5mg, 0.063mmol)和DIPEA(20.3μL,0.104mmol)加入到反应混合物混合物中，升至室温下反应24小时。产物通过制备HPLC分离纯化所得溶液，得到白色固体化合物25(25.3mg,29.7％)。LC-MS m/z(ES+)，1479.80(M+H)+。
实施例I-4化合物31的合成
ⅰ)HOBt，DIPEA，吡啶，DMF，室温，24h；
ⅱ)DEA，DMF，室温，2.5h；
ⅲ)Et3N，CH2Cl2，室温，12h；
ⅳ)DIC，HOBt，DIPEA，DMF，室温，24h。
化合物27的合成
在0℃氮气保护下取化合物18(194.2mg,0.25mmol)溶于无水DMF (15ml)，加入HOBt(34.2mg,0.25mmol)和化合物26(200.3mg,0.28mmol)。 15分钟后，加入吡啶(3ml)和DIPEA(53.1μL,0.28mmol)，并在0℃下反应 30min。然后升至室温下搅拌3小时。向反应混合物反应混合物补加DIPEA (53.1μL,0.32mmol)，室温下继续反应24h。反应结束后，将混合物真空浓缩。粗产品通过柱层析纯化，得到白色固体化合物27(126.2mg,37.0％)。 LC-MS m/z(ES+)，1398.75(M+H)+。
化合物28的合成
将化合物27(126.2mg,0.09mmol)溶于DMF(8ml)，加入二乙胺(4mL)，继续搅拌反应2.5h。反应结束后，减压去除溶剂，得到粗产品28(73.3mg, 68.9％)，无需纯化，可直接进行下一步反应。LC-MS m/z(ES+)，1176.68 (M+H)+。
化合物30的合成
将化合物29(1.87g,7.5mmol)和Et3N(104μL,0.75mmol)溶于无水 CH2Cl2(40ml)，逐滴加入巯基乙酸(103.9μL,1.5mmol)的CH2Cl2(40ml)溶液；滴加完毕后，将体系升至室温下搅拌过夜。反应结束后，真空去除溶剂，粗产品通过柱层析纯化得到白色固体化合物30(1.72g,36.87％)。LC-MS m/z(ES-)，342.11(M-H)-。
化合物31的合成
取化合物30(22.2mg,0.065mmol)，HOBt(8.8mg,0.065mmol)和DIC (11μL,0.065mmol)溶于DMF(8ml)，冰浴降温至0℃。将化合物28(63.7mg, 0.054mmol)和DIPEA(12.4μL,0.054mmol)加入到反应溶液液中，升至室温下反应24h。反应结束后，粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝60： 1-30：1)，得到白色固体化合物31(11.3g,39.5％)。LC-MS m/z(ES+)，1499.78 (M+H)+。
实施例I-5化合物36的合成
ⅰ)K2CO3，EtOAc/H2O，室温，2小时；
ⅱ)EDCI，DMF，室温，12小时；
ⅲ)DIPEA，DMF，室温，12小时；
ⅳ)EDCI，HOBt，DIPEA，DMF，室温，24小时。
化合物33的合成
将2,4-二氨基苯甲酸32(501.8mg,3.3mmol)溶于乙酸乙酯(20ml)溶解，加入碳酸钾(9.0g,66mmol)的水(20ml)溶液。在混合液中加入丙烯酰氯 (1ml,13mmol)，反应混合物中有淡棕色沉淀析出。反应体系升至室温，沉淀析出物消失；2h后，反应结束。去除有机相，水相用5％的盐酸调节至 pH<4时有固体析出，过滤，收集的固体用石油醚洗，用乙酸乙酯溶解。然后将有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，真空去除滤液中的溶剂。将粗产品分散于水中，过滤，用***彻底洗涤，得到灰色粉末状化合物33(670.2mg, 78％)。LC-MS m/z(ES+)，261.09(M+H)+。
化合物34的合成
将化学物33(260.1mg,1.0mmol)和EDCI(210.09mg,1.1mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(126.6mg,1.1mmol)溶于DMF(14ml)中。在室温下搅拌过夜。反应结束后，减压去除溶剂。粗产品通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10： 1)，得到淡棕色固体化合物34(273mg,76.4％)。LC-MS m/z(ES+)，358.11 (M+H)+。
化合物35的合成
将4-氨基丁酸(260.1mg,1.0mmol)和DIPEA(489μL,2.8mmol)溶于 DMF(10ml)，冰浴降温，在0℃在加入化合物34(260.7mg,0.73mmol)的DMF (10ml)溶液。在0℃下搅拌10min后，升至室温并搅拌过夜。反应结束后，真空去除溶剂。粗产品通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1,v/v)，得到淡棕色固体化合物35(192.3mg,76.2％)。LC-MS m/z(ES+)，346.14(M+H)+。
化合物36的合成
将化合物35溶于无水DMF(10ml)中，在0℃下加入HOBt(14.9mg, 0.11mmol)，EDCI(21.1mg,0.11mmol)和DIPEA(19.2μL,0.11mmol)。15min 后，加入化合物21(112.3mg,0.1mmol)。反应体系升至室温，搅拌24h。反应结束向混合物中加水(15ml)，用乙酸乙酯(20ml)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，真空去除滤液中的溶剂。粗产品通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，得到白色固体化合物36(56.5mg,39％)。LC-MS m/z(ES+)，1450.84(M+H)+。
实施例I-6化合物43的合成
ⅰ)DMAP，CH2Cl2，室温，1小时；
ⅱ)NaOH，EtOH/H2O，80℃，2小时；
ⅲ)EDCI，HOBt，DIPEA，DMF，室温，18小时；
ⅳ)EEDQ，CH2Cl2，MeOH，室温，18小时。
化合物38的合成
在100ml圆底烧瓶中，将化合物37(1.05g,6.9mmol)和DMAP(1.94g, 15.9mmol)溶于CH2Cl2(20ml)溶液中，在0℃下逐滴加入丙烯酰氯(1.38g, 15.2mmol)，将反应在室温下搅拌1小时。加水(50ml)淬灭反应，用CH2Cl2 (20ml)萃取3次。合并有机相，用50ml饱和碳酸氢钠洗1次，饱和食盐水洗1次，用无水硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩，得到黄色半固态化合物38(1.51g,85.8％)。LC-MS m/z(ES+)，253.04(M+H)+。
化合物39的合成
将化合物38(1.56g,5.94mmol)和4-氨基丁酸(673.0mg,6.53mmol)与氢氧化钠(713.3mg,17.82mmol)和水(15mL)一起溶解于EtOH(15ml)中。将反应混合物在80℃下搅拌2小时。冷却至室温后，减压浓缩溶剂。用盐酸 (0.5N)将混合物酸化至pH<7。过滤收集固体，用水(10mL×2)洗涤并干燥，得到化合物39(490.2mg,25.8％)，为灰白色固体。LC-MS m/z(ES+)，320.03 (M+H)+。
化合物41的合成
将化合物39(230.1mg,0.72mmol)，HOBt(116.7mg,0.86mmol)，EDCI (151.8mg,0.79mmol)和DIPEA(279.2mg,2.2mmol)溶于DMF(20ml)中，冰浴，在0℃下搅拌1小时后，加入化合物40(149.1mg,0.79mmol)。反应体系升至室温，反应18小时。将反应混合物用盐水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。将有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(MeOH：CH2Cl2＝200/1-10/1，体积比)纯化残余物，得到呈黄色固体的化合物41(97.3mg,27.6％)。LC-MS m/z(ES+)，490.23(M+H)+。
化合物43的合成
将化合物41(90.1mg,0.18mmol)，EEDQ(54.6mg,0.22mmol)溶于无水 CH2Cl2(7ml)和无水MeOH(0.07ml)，室温下搅拌1h。1h后，加入化合物42(133.5mg,0.184mmol)，继续搅拌18h。反应结束后，真空浓缩，粗品通过prep-HPLC纯化，得到白色固体状化合物43(12.3mg,5.6％)。LC-MS m/z (ES+)，1197.51(M+H)+。
实施例I-7化合物49的合成
ⅰ)HCl(g)，MeOH，0℃，2小时；
ⅱ)吡啶，100℃，2小时；
ⅲ)NaOH，THF/H2O，室温，4小时；
ⅳ)EDCI，HOBt，DIPEA，DMF，室温，18小时；
ⅴ)EEDQ，CH2Cl2/MeOH，室温，18小时
化合物45的合成
将化合物44(1.13g,6.53mmol)溶于甲醇(30ml)中，在0℃下通入氯化氢气体，搅拌反应2h。浓缩反应混合物，残留物用水(50ml)溶解。加入饱和碳酸氢钠调节酸碱度为8，用乙酸乙酯(20ml)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤。浓缩滤液，得到黄色固态化合物45(710.1mg, 65.1％)。LC-MS m/z(ES+)，168.07(M+H)+。
化合物46的合成
将化合物45(700.5mg,4.19mmol)溶于吡啶(20ml)，0℃下将丙烯酰氯 (947.1mg,10.47mmol)逐滴加入到溶液中并搅拌。升温至100℃，搅拌反应 2h。冷却至室温，减压浓缩，粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝200： 1-10：1)，得到黄色固体化合物46(520.4mg,45.2％)。LC-MS m/z(ES+)， 276.09(M+H)+。
化合物47的合成
将化合物46(510.2mg,1.85mmol)，氢氧化钠(370.6mg,9.26mmol)溶于 THF(10ml)和水(10ml)，在室温下搅拌反应4h。反应结束后，浓缩，用盐酸(1N)调节pH为7。过滤，得到灰白色固体化合物47(360.2mg,74.1％)。 LC-MS m/z(ES+)，262.07(M+H)+。
化合物48的合成
将化合物47(120.5mg,0.5mmol)，HOBt(4.7mg,0.6mmol)，EDCI (96.8mg,0.5mmol)和DIPEA(178.1mg,1.4mmol)溶于DMF(10ml)中，冰浴，在0℃下搅拌1h后，加入化合物40(95.1mg,0.5mmol)到上述溶液中。反应体系升至室温，反应18h。用饱和食盐水(20ml)淬灭反应，用乙酸乙酯(10ml) 萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝100：1-20：1，体积比)，得到灰白色固体化合物41(71mg,35.8％)。LC-MS m/z(ES+)，432.07(M+H)+。
化合物49的合成
将化合物48(60.2mg,0.14mmol)，EEDQ(41.3mg,0.17mmol)溶于无水 CH2Cl2(6ml)和无水MeOH(0.06ml)，室温下搅拌1h。1h后，加入化合物 42(100.9mg,0.14mmol)，继续搅拌18h。反应结束后，减压浓缩。粗品通过 prep-HPLC纯化，得到白色固体状化合物49(12.4mg,7.61％)。LC-MS m/z (ES+)，1139.45(M+H)+。
实施例I-8化合物55的合成
ⅰ)Et3N，MeOH，室温，3h；
ⅱ)Na2CO3，THF/H2O，室温，3h；
ⅲ)HOBt，DIC，DIPEA，DMF，室温，12h；
ⅳ)TFA，CH2Cl2，室温，3h；
ⅴ)Et3N，CH2Cl2，室温，2h。
化合物50的合成
将化合物4(440.0mg,2mmol)溶于MeOH(10ml),，加入Et3N(332.7μL, 2.4mmol)，45℃反应。将溶于MeOH(10ml)的(Boc)2O(436.2mg,2mmol) 加到反应混合物中。将混合物在45℃剧烈搅拌30min后，降至室温，搅拌 2h。去除溶剂，粗产品用盐酸(5％,10ml)，饱和氯化钠溶液(15ml)洗，用乙酸乙酯(10ml)萃取3次。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，真空去除溶剂。粗产品通过石油醚/乙酸乙酯(10ml，v:v＝2:1)重结晶，得到白色粉末状化合物50(375.4mg,75.6％)。LC-MS m/z(ES+)，249.15(M+H)+。
化合物51的合成
将化合物50(248.0mg,1.0mmol)溶于饱和碳酸氢钠/THF (v:v＝1:1,20ml),0℃下将丙烯酰氯(121μL,1.5mmol)加入到溶液中。0℃下剧烈搅拌10min。升至室温，继续反应3h。3h后，用盐酸调整pH<4。用乙酸乙酯(20ml)萃取3次。合并有机相，用饱和食盐水洗涤(30ml)，用无水硫酸镁干燥，过滤并去除溶剂。粗品通过prep-HPLC纯化，得到灰色油状化合物51(176.1mg,58.3％)。LC-MS m/z(ES+)，303.16(M+H)+。
化合物52的合成
将化合物51(30.2mg,0.1mmol)，HOBt(14.7mg,0.11mmol)，DIC (13.9mg,0.11mmol)溶于无水DMF(6ml)中，冰浴降温至0℃。15min后，加入化合物6(20.5mg,0.09mmol)和DIPEA(19.2μL,0.11mmol)，反应体系升至室温，搅拌过夜。加水(10ml)稀释，用乙酸乙酯(20ml)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥，真空去除溶剂。粗产品通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到白色固体化合物52(28.2mg,60.7％)。LC-MS m/z(ES+)， 513.26(M+H)+。
化合物53的合成
将化合物52(28.2mg,0.06mmol)和三氟乙酸(1.0ml)溶于CH2Cl2(5ml) 溶液中，室温搅拌3h，减压去除溶剂，得到灰色固体化合物53(20.4mg, 88.2％)，无需进一步纯化，可直接进行下一部反应。LC-MS m/z(ES+)，413.21 (M+H)+。
化合物54
将化合物53(41.2mg,0.1mmol)溶于10mlDMF中，0℃条件冰浴。将 Et3N(6.9μL,0.05mmol)和化合物8(73.7mg,0.1mmol)逐滴加入反应混合物中，搅拌30min。反应体系升至室温，继续搅拌5h。减压浓缩，粗品通过 prep-HPLC纯化，得到白色粉末状化合物54(73mg,63.6％)。LC-MS m/z (ES+)，1148.47(M+H)+。
化合物55的合成
将化合物54(573.7mg,0.5mmol)溶于DMF(10ml)中，将溴乙酰溴(150.0mg,0.75mmol)加到反应混合物中，0℃条件下冰浴，搅拌10min。升至室温，继续搅拌3h。反应混合物加水(20ml)稀释，用乙酸乙酯(20ml) 萃取3次。合并有机相，浓缩，粗品通过prep-HPLC纯化，得到黄色粉末状化合物55(421mg,66.4％)。LC-MS m/z(ES+)，1270.38(M+H)+。
实施例I-9化合物59的合成
ⅰ)K2CO3，H2O/EtOAc，室温，5h；
ⅱ)CHCl3，回流，12h；
ⅲ)Ac2O，NaAc，100℃，2h；
ⅳ)HOBt，DIC，DIPEA，DMF，室温，24h。
化合物56的合成
将溶于水(5ml)的碳酸钾(51.2mg,0.37mmol)溶液和溶于乙酸乙酯 (10ml)的化合物15(50.0mg,0.25mmol)溶液混合，0℃下，将溶于乙酸乙酯 (8ml)的丙烯酰氯(16μL,0.2mmol)溶液缓慢地逐滴加入混合液中。冰浴降温， 0℃搅拌10min。升至室温，继续反应5h。用盐酸调整pH<5。用乙酸乙酯 (15ml)萃取3次。合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗(15ml)，无水硫酸镁干燥，过滤并去除溶剂。粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝8：1)，得到灰色油状化合物56(26.2mg,40.1％)。LC-MS m/z(ES+)，258.14(M+H)+。
化合物57的合成
将化合物56(26.0mg,0.10mmol)溶于CHCl3(10ml)，搅拌，加入顺丁烯二酸酐(28.1mg,0.11mmol)加热回流反应12h。结束后，冷却升至室温。过滤，收集固体产物，用CHCl3(30ml)洗3次，得到白色固体化合物57(20.1mg, 59.1％)。LC-MS m/z(ES+)，356.14(M+H)+。
化合物58的合成
将化合物57(20.1mg,0.054mmol)和醋酸钠(6.3mg,0.047mmol)溶于醋酸酐(10ml)，加热至100℃，反应2h。反应结束后，立即将反应混合物缓慢地倒入搅拌的碎冰中，并加入冰水。搅拌1h后，析出固体沉淀。过滤，用冰水(15ml)洗涤3次，得到白色固体化合58(9.1mg,46.1％)。LC-MS m/z (ES+)，338.13(M+H)+。
化合物59的合成
将化合物58(8.1mg,0.02mmol)，HOBt(3.25mg,0.02mmol)和DIC (3.7μL,0.02mmol)溶于5ml DMF中，0℃条件冰浴处理。加入化合物11 (20.1mg,0.02mmol)DIPEA(4.1μL,0.02mmol)。升至室温，反应24h。浓缩，通过prep-HPLC纯化，得到白色固体化合物59(9.3mg,34.9％)。LC-MS m/z (ES+)，1313.53(M+H)+。
实施例I-10化合物64的合成
ⅰ)DMF，80℃，6h；
ⅱ)K2CO3，EtOAc/H2O，室温，5h；
ⅲ)Ac2O，NaAc，90℃，3h；
ⅳ)HOBt，DIC，DIPEA，DMF，室温，24h。
化合物60的合成
将化合物32(140.0mg,0.9mmol)溶于DMF(6ml)，逐滴加入马来酸酐 (89.8mg,0.9mmol)。60℃，搅拌6h，减压浓缩至油状物。乙酸乙酯(5ml) 重结晶得到白色固体化合物60(209.1mg,90.7％)。LC-MS m/z(ES+)， 251.06(M+H)+。
化合物61的合成
将溶于水(15ml)的碳酸钾(201.3mg,1.4mmol)溶液和溶于乙酸乙酯 (20ml)的化合物60(209.1mg,0.9mmol)溶液混合，0℃下，将溶于乙酸乙酯 (10ml)的丙烯酰氯(90μL,1.1mmol)溶液缓慢地逐滴加入混合液中。升至室温，反应5h。用盐酸调整pH<5。用乙酸乙酯(20ml)萃取2次。合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗(20ml)，无水硫酸镁干燥，过滤。真空去除溶剂。得到灰色固体化合物61(201.0mg,82.7％)，无需进一步纯化，可直接进行下一部反应。LC-MS m/z(ES+)，304.07(M+H)+。
化合物62的合成
将化合物61的粗产物(201.0mg,0.7mmol)溶于醋酸酐(30ml)中，加入醋酸钠(60.5mg,0.7mmol)。90℃搅拌3h。将溶液倒入冰水中，并搅拌30min，用乙酸乙酯(20ml)萃取3次。合并有机相，通过prep-HPLC纯化浓缩，得到白色固体化合物62(92.2mg,48.6％)。LC-MS m/z(ES+)，287.06(M+H)+。
化合物64的合成
将化合物62(57.0mg,0.2mmol)，HOBt(27.2mg,0.2mmol)，DIC(29.3μL, 0.2mmol)和DIPEA(33.1μL,0.2mmol)溶于DMF(6ml)中。30min后，在0℃条件下加入化合物63(109.8mg,0.15mmol)。反应结束后，将混合物在室温下搅拌24小时。溶液通过prep-HPLC纯化浓缩，得到白色固体化合物64 (94.8mg,47.6％)。LC-MS m/z(ES+)，1000.53(M+H)+。
实施例I-11化合物69的合成
ⅰ)DMF，回流，12h；
ⅱ)Ac2O，NaAc，回流，6h；
ⅲ)DMF，80℃，12h；
ⅳ)HOBt，DIC，DIPEA，NMP，室温，36h。
化合物66的合成
将化合物65(145.0mg,1.0mmol)溶于DMF(6ml)，缓慢地逐滴加入马来酸酐(89.8mg,0.9mmol)。将混合物加热回流12h。冷却至室温，过滤沉淀的固体产物，用CH2Cl2(20ml)洗3次，得到白色固体化合物66(110.2mg, 45.1％)。LC-MS m/z(ES+)，244.02(M+H)+。
化合物67的合成
将化合物66(110.2mg,0.5mmol)和醋酸钠(14.2mg,0.2mmol)溶于醋酸酐(10ml)，加热回流6h。反应结束后，立即将反应混合物缓慢地倒入搅拌的碎冰中，并加入冰水。搅拌1h后，析出固体沉淀。过滤固体沉淀并用冰水(10ml)洗3次，得到白色固体化合物67(87.3mg,85.7％)。LC-MS m/z (ES+)，226.01(M+H)+。
化合物68的合成
将琥珀酸酐(38.8mg,0.4mmol)加到化合物67(87.3mg,0.4mmol)的DMF(6ml)溶液中，80℃搅拌过夜，减压浓缩至油状。粗产物通过prep-HPLC 纯化，得到白色固体化合物68(45.0mg,35.7％)。LC-MS m/z(ES+)，326.02 (M+H)+。
化合物69的合成
将化合物68(45.0mg,0.14mmol)，HOBt(19.0mg,0.14mmol)，DIC (20.5μL,0.14mmol)和DIPEA(23.2μL,0.14mmol)溶于DMF(10ml)，冰浴，0℃搅拌1h。加入化合物63(76.9mg,0.111mmol)到溶液中。使混合物升至室温，继续反应36h。溶液通过prep-HPLC纯化，得到白色固体化合物69(64.3mg,44.3％)。LC-MS m/z(ES+)，1039.49(M+H)+。
实施例I-12化合物74的合成
ⅰ)Et3N，正丁醇，90℃，18h；
ⅱ)Et3N，CH2Cl2，室温，18h；
ⅲ)EDCI，HOBt，DIPEA，DMF，室温，18h；
ⅳ)EEDQ，CH2Cl2，MeOH，室温，18h。
化合物71的合成
将化合物69(1.0g,6.10mmol)，4-氨基丁酸(691.9mg,6.71mmol)和三乙胺(3.09g,30.5mmol)溶于正丁醇(30ml)中。90℃下搅拌18h。冷却至室温，减压浓缩去除溶剂。加水(100ml)稀释，用乙酸乙酯(30ml)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝200：1-10：1，体积比)，得到黄色固体化合物71(482.3mg, 34.3％)。LC-MS m/z(ES+)，231.06(M+H)+。
化合物72的合成
将化合物71(450.5mg,1.95mmol)和TEA(590.8mg,5.85mmol)溶于 CH2Cl2(20ml),冰浴降温，0℃搅拌，逐滴滴加丙烯酰氯(947.2mg, 10.47mmol)。升至室温，搅拌18h。加水(50ml)进行淬灭反应，用CH2Cl2 (20ml)萃取3次，合并有机相，用盐水(30ml)洗，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到黄色固体化合物72(255.4mg,46％)。LC-MS m/z(ES+)， 285.07(M+H)+。
化合物73的合成
将化合物3(155.7mg,0.547mmol)，HOBt(88.7mg,0.656mmol)， EDCI(115.4mg,0.602mmol)和DIPEA(212.1mg,1.64mmol)溶于DMF (10ml)，0℃条件下搅拌1h。加入化合物40(113.3mg,0.602mmol)。升至室温，继续反应18h。将反应混合物用盐水(30ml)稀释，用CH2Cl2(20ml) 萃取3次。合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产品通过柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝200：1-10：1，体积比)，得到黄色固体化合物 73(90.2mg,36.2％)。LC-MS m/z(ES+)，455.17(M+H)+。
化合物74的合成
将化合物73(85.4mg,0.19mmol)，EEDQ(55.4mg,0.23mmol)溶于无水CH2Cl2(7ml)和无水MeOH(0.07ml)，室温下搅拌1h。随后，加入化合物42(135.7mg,0.19mmol)，继续搅拌18h。反应结束后，将反应混合物真空浓缩，通过prep-HPLC纯化，得到白色固体状化合物74(19.1mg,6.7％)。 LC-MS m/z(ES+)，1162.45(M+H)+。
表1其他连接子-活性剂偶联物
实施例Ⅱ抗体药物偶联的制备
一般偶联过程
DTPA(1mM)和3.0-5.0当量的TCEP(10mM)加到含抗体(10mg/mL)的 PCR管中，混合1h以还原抗体中的二硫键。将不同数量的连接子-活性剂加到反应混合物中，漩涡混合器震荡过夜。所有的反应都在室温下进行。所得产物通过凝胶电泳(SDS-PAGE)和HIC(疏水作用色谱法)-HPLC对结果进行分析。
利用还原性SDS-PAGE分析抗体药物偶联物：样本与缓冲液混合，采用8％-15％丙烯酰胺凝胶上样，并采用UVP BioDoc-it成像***分析凝胶图像。
2和3泳道的条带(≥50kDa)说明巯基桥接偶联是有效的(H,L)。75kDa 的条带代表由一对桥接巯基连接的重链和轻链(LH)组成的部分。由一对或两对桥接巯基连接的两条重链，形成的条带是100kDa(HH)。125kDa的条带代表只有一条重链和轻链之间没有形成桥接(LHH)。最后，150kDa的条带代表所有链都桥接抗体(LHHL)。
利用HIC-HPLC分析抗体药物偶联物的条件：HPLC柱：TSK-GEL Butyl-NPR柱4.6*35mm；缓冲液A：75％磷酸钠(20mM,pH7.0)，25％异丙醇(v/v)；缓冲液B：磷酸钠(20mM,pH7.0)，硫酸铵(1.5mM)；流速： 1.0mL/min。
抗体药物偶联物的体内评估
第一天，将含有人卵巢癌细胞株如OVCAR3细胞系，含5000个细胞的100μL培养基加到96孔板中(Cellstar)。将细胞在水饱和的CO2培养箱中37℃下孵育过夜。第二天，将两种共价巯基偶联的ADCs：MSL-31和 MSL-75，浓度梯度稀释后加到含有OVCAR3细胞的96孔板中(100μL/孔)。初始的偶联物浓度为100000ng/ml，稀释到0.001ng/ml。添加ADC的 OVCAR3细胞37℃孵育72h。共价巯基偶联ADC处理后的肿瘤细胞活性用细胞活性试剂盒CellCounting Kit-8(DOJIDO,CK04)检测，根据说明书，利用酶标仪进行检测(BIO-RAD iMarkSpectraMax L from Melecular device)。 IC50值表示50％细胞生长抑制率，该值由曲线拟合软件Graphpad计算。实施例II-1MSL-C31的制备
DTPA(1mM)和5.0当量的TCEP(10mM)加到含抗-MSL抗体(10mg/mL)的PCR管中，混合1h以还原抗体中的二硫键。随后，将25％ DMSO加到反应混合物中。化合物31(5.0当量,10mM)加到反应混合物中，漩涡混合器震荡过夜。所有的反应都在室温下进行。反应结束后，将混合物转移到Milliproe 4mL的超滤离心管中，用PBS洗3次，然后收集反应混合物。图2显示至少有一对巯基共价偶联的产物(右边泳道)比单独重链(H) 或轻链(L)(左边泳道)迁移的慢。重链和轻链共价偶联的条带在75kDa(HL) 处，两条重链共价偶联的条带在100kDa(HH)处。在HIC-HPLC的色谱图中有3个峰，分别代表DAR为3、4和5个的峰，根据HIC-HPLC的结果(图 3)MSL-C31合成物的DAR为3.60。
图2显示了a)裸抗体，b)MSL-C31(共价巯基-缀合物的产物)的还原性SDS-PAGE结果。
图3是MSL-C31的HIC-HPLC色谱图。
实施例II-2MSL-C75的制备
DTPA(1mM)和5.0当量的TCEP(10mM)加到含抗-MSL抗体 (10mg/mL)的PCR管中，混合1h以还原抗体中的二硫键。随后，将25％ DMSO加到反应混合物中。化合物75(5.0当量,10mM)加到反应混合物中，漩涡混合器震荡过夜。所有的反应都在室温下进行。反应结束后，将混合物转移到Milliproe 4mL的超滤离心管中，用PBS洗涤3次，然后收集反应混合物。利用电泳分析样本。图4是还原性SDS-PAGE结果。左边泳道是裸抗，右边泳道是MSL-C75的共价巯基偶联物。基于HIC-HPLC的数据， MSL-C75的DAR值是3.87。
图4是MSL-C75的还原性SDS-PAGE结果。
图5是MSL-C75的HIC-HPLC色谱图。
表2是ADC-C31和ADC-C75两个样本作用人卵巢癌细胞的IC50值：
样本 细胞类型 IC50(ng/mL)
MSL-C31 OVCAR3(MSL+) 37.38
MSL-C75 OVCAR3(MSL+) 50.00
实施例Ⅱ-3CD59-C78的制备
DTPA(1mM)和5.0当量的TCEP(10mM)加到含抗-CD59抗体(10mg/mL) 的PCR管中，混合1h以还原抗体中的二硫键。随后，将25％DMSO加到反应混合物中。化合物78(5.0当量,10mM)加到反应混合物中，漩涡混合器震荡过夜。所有的反应都在室温下进行。反应结束后，将混合物转移到 Milliproe 4mL的超滤离心管中，用PBS洗涤3次。在HIC-HPLC结果显示CD59-C78DAR为3.66。
图6是a)裸抗体，b)CD59-C78的还原SDS-PAGE结果。
图7是CD59-C78的HIC-HPLC色谱图。
实施例Ⅱ-4HER2-C78的制备
DTPA(1mM)和5.0当量的TCEP(10mM)加到含抗-Her2抗体(10mg/mL) 的PCR管中，混合1h以还原抗体中的二硫键。随后，将25％DMSO加到反应混合物中。化合物75(5.0当量,10mM)加到反应混合物中，漩涡混合器震荡过夜。所有的反应都在室温下进行。反应结束后，将混合物转移到 Milliproe 4mL的超滤离心管中，用PBS洗3次。
HER2-C78偶联的稳定性研究
为了测定共价巯基偶联对常规巯基偶联的ADCs的降解速率，利用 ELISA实验对前面制备的三种ADC样品进行稳定性研究。ELISA实验步骤如下：第一步，Her2-ECD(100ng)加到96孔板的每个孔中；第二步，用 Anti-Her2-Mc-VC-PAB-MMAE(常规偶联)， Anti-Her2-Di-Mc-VC-PAB-MMAE(双马来酰亚胺巯基偶联)和 Anti-Her2-PY-QJ2-MMAE(HER2-C78，本发明的共价巯基偶联)在包被的孔中温育以允许与Her-2ECD结合；第三步，结合在Her2-ECD抗原上的抗 her2的ADCs的数量通过偶联链亲和素/辣根过氧化物酶抗-人IgG检测，催化显色底物邻苯二胺(OPD)转化为有色产物。将外周血细胞孵育3天后结果显示常规巯基偶联的ADC的降解速率为26.7％，双马来酰亚胺偶联的 ADC的降解速率为18.9％，本专利的ADC的降解速率为5.1％。从表3中可以看出本专利的共价巯基偶联的ADC在以上三种ADC中的降解速率最低。
表3在人外周血中抗-Her2药物偶联降解速率汇总
注：Anti-Her2-Mc-VC-PAB-MMAE是传统的巯基偶联(ref-1)， Anti-Her2-Di-Mc-VC-PAB-MMAE是利用专利公开(Ref-2)描述的结构和过程的共价偶联。两种偶联方式均与HER2-C78比较DAR值。
实施例Ⅲ-抗体药物偶联物的活性
在一个实施例中，本发明的抗体药物偶联特指用于肿瘤细胞，并与肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原结合。ADC-抗原复合物通过内吞作用进入肿瘤细胞并形成胞内体，当胞内体中的该复合物与溶酶体融合后释放药物。释放的药物具有抑制肿瘤细胞的关键功能和/或杀死肿瘤细胞。如果药物释放到细胞表面或肿瘤细胞附近，也能通过一种旁路方式杀死肿瘤细胞。
因此，本发明提供的各种蛋白-药物复合物能抑制肿瘤细胞的生长和/ 或分化。这些拥有各种活性药物的化合物能用来***，自身免疫疾病和炎症，甚至是肿瘤或干细胞的分化。
实施例Ⅲ-1针对肿瘤活性
在一个实施例或发明主题中，抗体药物偶联物(ADCs)结合了特定靶向的单克隆抗体和具有杀死肿瘤能力的毒性药物，使ADCs成为能有效杀死肿瘤的药物。而且，本发明的共价巯基偶联能提高ADCs的稳定性，限制 ADC在血液循环中的降解，因此能降低其毒性。示例提供的数据显示的是用前面描述的方法制备的ADCs***，肿瘤模型是在裸鼠中移植人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。
为了检测共价偶联或常规偶联ADC生物学功能，抗Her2mAb常规偶联或共价巯基偶联相同的连接子和毒素。裸鼠中移植人癌细胞株 (MDA-MB-231)，当肿瘤体积达到100mm3时，腹腔注射ADCs(0,2.5,5.0, 10mg/kg)。每三天检测一次肿瘤体积，21天后处死裸鼠，解剖肿瘤并称重。
表4提供了常规偶联的ADC与巯基共价偶联的ADC在人乳腺癌裸鼠模型中的活性比较。
表4在裸鼠研究中共价巯基偶联的ADC抑制人肿瘤细胞生长
参考文献
1.Yao Xuejing,Jing Jiang,Xin Wang,Changjiang Huang Dong Li, Kuan Xie,Qiaoyu Xu,Hongwen Li,Zhuanglin Li,Liguang Lou and Jianmin Fang,2015“A novelhumanized anti-her2antibody conjugated with MMAE exerts potent anti-tumoractivity,”Breast Cancer Research&Treatment,153 (1):123-133.
2.An Deqiang et al.,2014 07 23一种三齿型连接子及其应用 CN103933575A。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种包含下式的连接子-活性剂：
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1和R2是能与巯基反应的官能团；
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数。
2.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中R1和R2各自包含选自马来酰亚胺、卤素、卤素取代的官能团、烷醛、烷酮、磺酰基烯烃、硅烷、异氰酸酯和降冰片烯的至少一种基团，并且其中R1和R2不能同时是马来酰亚胺，R1和R2也不能同时是卤素。
3.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中R1和R2独立地选自
以及它们的衍生物，其中，R5、R6和R7独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、NO2、CN、SCN、OR8，SR9，NR10R11、C(＝O)R12、C(＝O)OR8、C(＝O)NR10R11、C(＝S)OR8、C(＝S)NR10R11、C(＝S)SR9、NR10(C＝O)R12、NR10(C＝S)NR10R11、O(C＝O)NR10R11、SO2R9、S(＝O)2OR8，及其组合，其中R8、R9、R10、R11、R12独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基，以及其组合，其中X选自F、Cl、Br和I。
4.(删除)
5.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中R1和R2是不同的。
6.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中M选自C-R5、N、B、P、Si-R5、芳基、杂芳基、环烷基、和(杂环基)烷基，其中R5选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基以及C2-C6炔基。
7.(删除)
8.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中L1和L2独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR6、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR6、C＝NR6、C(＝S)O、C(＝S)NR6、C(＝S)S、NR6(C＝O)、NR6(C＝S)NR7、O(C＝O)NR6、S(＝O)2，以及其组合，其中R6和R7独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
9.(删除)
10.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中L包含不可裂解的单元。
11.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中L包含可裂解的单元。
12.如权利要求10或11所述的连接子-活性剂，其中至少有一个L包含C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR8、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR8、C＝NR8、C(＝S)O、C(＝S)NR8、C(＝S)S、NR8(C＝O)、NR8(C＝S)NR9、O(C＝O)NR8、S(＝O)2、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、Ala-PAB、PAB或它们的组合。
13.如权利要求12所述的连接子-活性剂，其中R8和R9独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、和C2-C6炔基。
14.如前述任一权利要求所述的连接子-活性剂，其中所述Q选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调节剂、显像剂、多肽和核苷酸。
15.如权利要求14所述的连接子-活性剂，其中Q选自美登素、耳他汀、加利车霉素、多柔比星、倍癌霉素和吡咯并苯并二氮杂。
16.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
17.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
18.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
19.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
20.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
21.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
22.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
23.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
24.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
25.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
26.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
27.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
28.一种具有下式的抗体-药物偶联物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数；
A是靶向部分；
S是靶向部分之巯基基团的硫原子；以及
每个R3和R4通过S和可与巯基反应的官能团之间的反应而形成。
29.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中R3和R4是不同的。
30.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中每个R3和R4独立地通过巯基与选自以下的基团反应而形成：
以及它们的衍生物，其中R5、R6和R7独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(＝O)R12、C(＝O)OR8、C(＝O)NR10R11、C(＝S)OR8、C(＝S)NR10R11、C(＝S)SR9、NR10(C＝O)R12、NR10(C＝S)NR10R11、O(C＝O)NR10R11、SO2R9、S(＝O)2OR8及其组合，其中R8、R9、R10、R11、R12独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基，及其组合。
31.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中每个R3和R4独立地选自：以及它们的衍生物。
32.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中M选自C-R5、N、B、P、Si-R5、芳基、杂芳基、环烷基和(杂环基)烷基，其中R5选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基。
33.(删除)
34.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中L1和L2独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR6、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR6、C＝NR6、C(＝S)O、C(＝S)NR6、C(＝S)S、NR6(C＝O)、NR6(C＝S)NR7、O(C＝O)NR6、S(＝O)2，及其组合，其中R6和R7独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
35.(删除)
36.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中L包括不可裂解单元。
37.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中L包括可裂解单元。
38.如权利要求36或37所述的抗体-药物偶联物，其中至少一个L包含C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR8、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR8、C＝NR8、C(＝S)O、C(＝S)NR8、C(＝S)S、NR8(C＝O)、NR8(C＝S)NR9、O(C＝O)NR8、S(＝O)2、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、Ala-PAB、PAB，或它们的组合。
39.如权利要求38所述的抗体-药物偶联物，其中R8和R9独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
40.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
41.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
42.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
43.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
44.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
45.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
46.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
47.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
48.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
49.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
50.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
51.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
52.如权利要求28-50中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含单克隆抗体。
53.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含抗体片段、替代体或变体。
54.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含蛋白配体或蛋白支架。
55.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含肽。
56.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含小分子配体。
57.一种用于治疗对象中病理状态的方法，其中所述方法包括给予有需要此治疗的对象权利要求28-51的抗体-药物偶联物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述病理状态选自癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经***的疾病和心血管疾病。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述病理状态是癌症。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症选自上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述癌症是HER2阳性癌症。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述靶向部分是结合HER2的抗体或其片段。
64.如权利要求59所述的方法，其中所述活性剂是细胞毒素。
65.如权利要求57所述的方法，其中所述对象是人。
66.一种诊断方法，其包括将怀疑具有目标分析物的样品与权利要求28所述的抗体-药物偶联物相接触，其中，所述靶向部分选择性地与所述目标分析物结合，Q是可检测的实体和/或是一个或多个额外的实体会与之相结合的实体，其中所述的一个或多个额外的实体自身可以是可检测的实体，并且其中所述方法还包括分析所述样品以确定可检测实体的存在，此实体存在表示所述目标分析物存在。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述分析物与癌症相关。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述分析物是HER2。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
70.如权利要求66所述的方法，其是在体内实施。
71.如权利要求70所述的方法，其是在人体中实施。
72.如权利要求66所述的方法，其是在体外实施。

Claims (72)

1.一种包含下式的连接子-活性剂：
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1和R2是能与巯基反应的官能团；
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数。
2.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中R1和R2各自包含选自马来酰亚胺、卤素、卤素取代的官能团、烷醛、烷酮、磺酰基烯烃、硅烷、异氰酸酯和降冰片烯的至少一种基团，并且其中R1和R2不能同时是马来酰亚胺，R1和R2也不能同时是卤素。
3.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中R1和R2独立地选自
以及它们的衍生物，其中，R5、R6和R7独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、NO2、CN、SCN、OR8，SR9，NR10R11、C(＝O)R12、C(＝O)OR8、C(＝O)NR10R11、C(＝S)OR8、C(＝S)NR10R11、C(＝S)SR9、NR10(C＝O)R12、NR10(C＝S)NR10R11、O(C＝O)NR10R11、SO2R9、S(＝O)2OR8，及其组合，其中R8、R9、R10、R11、R12独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基，以及其组合。
4.如权利要求2所述的连接子-活性剂，其中X选自F、Cl、Br和I。
5.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中R1和R2是不同的。
6.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中M选自C-R5、N、B、P、Si-R5、芳基、杂芳基、环烷基、和(杂环基)烷基。
7.如权利要求6所述的连接子-活性剂，其中R5选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基以及C2-C6炔基。
8.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中L1和L2独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR6、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR6、C＝NR6、C(＝S)O、C(＝S)NR6、C(＝S)S、NR6(C＝O)、NR6(C＝S)NR7、O(C＝O)NR6、S(＝O)2，以及其组合。
9.如权利要求8所述的连接子-活性剂，其中R6和R7独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
10.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中L包含不可裂解的单元。
11.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中L包含可裂解的单元。
12.如权利要求10或11所述的连接子-活性剂，其中至少有一个L包含C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR8、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR8、C＝NR8、C(＝S)O、C(＝S)NR8、C(＝S)S、NR8(C＝O)、NR8(C＝S)NR9、O(C＝O)NR8、S(＝O)2、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、Ala-PAB、PAB或它们的组合。
13.如权利要求12所述的连接子-活性剂，其中R8和R9独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、和C2-C6炔基。
14.如前述任一权利要求所述的连接子-活性剂，其中所述Q选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调节剂、显像剂、多肽和核苷酸。
15.如权利要求14所述的连接子-活性剂，其中Q选自美登素、耳他汀、加利车霉素、多柔比星、倍癌霉素和吡咯并苯并二氮杂。
16.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
17.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
18.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
19.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
20.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
21.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
22.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
23.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
24.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
25.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
26.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
27.如权利要求1所述的连接子-活性剂，其中式I的结构是：
28.一种具有下式的抗体-药物偶联物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
L1、L2、L代表连接子或可以为空；
M代表连接基团；
Q代表活性剂或可以为空；
m代表从0到6的整数；
n代表从0到8的整数；
A是靶向部分；
S是靶向部分之巯基基团的硫原子；以及
每个R3和R4通过S和可与巯基反应的官能团之间的反应而形成。
29.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中R3和R4是不同的。
30.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中每个R3和R4独立地通过巯基与选自以下的基团反应而形成：
以及它们的衍生物，其中R5、R6和R7独立地选自H、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、NO2、CN、SCN、OR8、SR9、NR10R11、C(＝O)R12、C(＝O)OR8、C(＝O)NR10R11、C(＝S)OR8、C(＝S)NR10R11、C(＝S)SR9、NR10(C＝O)R12、NR10(C＝S)NR10R11、O(C＝O)NR10R11、SO2R9、S(＝O)2OR8及其组合，其中R8、R9、R10、R11、R12独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基，及其组合。
31.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中每个R3和R4独立地选自：以及它们的衍生物。
32.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中M选自C-R5、N、B、P、Si-R5、芳基、杂芳基、环烷基和(杂环基)烷基。
33.如权利要求32所述的抗体-药物偶联物，其中R5选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基和C2-C6炔基。
34.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中L1和L2独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR6、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR6、C＝NR6、C(＝S)O、C(＝S)NR6、C(＝S)S、NR6(C＝O)、NR6(C＝S)NR7、O(C＝O)NR6、S(＝O)2，及其组合。
35.如权利要求34所述的抗体-药物偶联物，其中R6和R7独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
36.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中L包括不可裂解单元。
37.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中L包括可裂解单元。
38.如权利要求36或37所述的抗体-药物偶联物，其中至少一个L包含C1-C9烷基、C2-C9烯基、C2-C9炔基、芳基、杂芳基、C3-C9环烷基、C3-C9杂环基、聚乙二醇、O、S、NR8、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR8、C＝NR8、C(＝S)O、C(＝S)NR8、C(＝S)S、NR8(C＝O)、NR8(C＝S)NR9、O(C＝O)NR8、S(＝O)2、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、Ala-PAB、PAB，或它们的组合。
39.如权利要求38所述的抗体-药物偶联物，其中R8和R9独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基。
40.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
41.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
42.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
43.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
44.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
45.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
46.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
47.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
48.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
49.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
50.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
51.如权利要求28所述的抗体-药物偶联物，其中式II的结构是：
52.如权利要求28-50中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含单克隆抗体。
53.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含抗体片段、替代体或变体。
54.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含蛋白配体或蛋白支架。
55.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含肽。
56.如权利要求28-51中任何一项所述的抗体-药物偶联物，其中A包含小分子配体。
57.一种用于治疗对象中病理状态的方法，其中所述方法包括给予有需要此治疗的对象权利要求28-51的抗体-药物偶联物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述病理状态选自癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、神经***的疾病和心血管疾病。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述病理状态是癌症。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症选自上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述癌症是HER2阳性癌症。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述靶向部分是结合HER2的抗体或其片段。
64.如权利要求59所述的方法，其中所述活性剂是细胞毒素。
65.如权利要求57所述的方法，其中所述对象是人。
66.一种诊断方法，其包括将怀疑具有目标分析物的样品与权利要求28所述的抗体-药物偶联物相接触，其中，所述靶向部分选择性地与所述目标分析物结合，Q是可检测的实体和/或是一个或多个额外的实体会与之相结合的实体，其中所述的一个或多个额外的实体自身可以是可检测的实体，并且其中所述方法还包括分析所述样品以确定可检测实体的存在，此实体存在表示所述目标分析物存在。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述分析物与癌症相关。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述分析物是HER2。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
70.如权利要求66所述的方法，其是在体内实施。
71.如权利要求70所述的方法，其是在人体中实施。
72.如权利要求66所述的方法，其是在体外实施。
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