CN107915726B

CN107915726B - 新型3,5-二取代1h-吲哚衍生物及其合成与应用

Info

Publication number: CN107915726B
Application number: CN201711277059.5A
Authority: CN
Inventors: 杨羚羚; 晏婕; 苏荟琳; 王周玉; 钱珊; 王丽姣
Original assignee: Xihua University
Current assignee: Xihua University
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN107915726A

Abstract

本发明公开了一种新型3,5‑二取代1H‑吲哚衍生物及其合成与应用，它的结构式如式11所示，式中，R选自卤素、C₁～C₆甲基、C₁～C₆甲氧基、‑OH、‑COOH、‑SO₃H或‑SO₂NH₂。本发明还提供了制备该化合物的方法，该方法共八步，每步反应产率均高于60％，且其中四步反应产率都高于90％，本发明所有化合物纯度均大于95％，符合后期抗肿瘤细胞活性测试所需纯度。本发明制备得到的化合物11a‑11h对胰腺癌细胞株BxPC‑3均具有较好的抑制活性，其中式11e所示化合物的活性最好，IC₅₀高达2.28μmol/L，且该化合物对人正常细胞几乎无毒副作用。

Description

新型3,5-二取代1H-吲哚衍生物及其合成与应用

技术领域

本发明涉及一种新型3,5-二取代1H-吲哚衍生物及其合成与应用。

背景技术

癌症是除心血管疾病的第二大死因，就全球范围而言，近六分之一的死亡是由癌症造成。近年来癌症的发病率和死亡率仍在不断攀升，2015年我国约有429.2万新发恶性肿瘤病例和281.4万死亡病例，分别占全球新发病例的近22％和死亡病例的27％。

目前临床治疗恶性肿瘤的常用药物主要包括传统的细胞毒类药物，如阿霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺等，以及靶向药物，如索拉菲尼、吉非替尼、克唑替尼等。尽管这些药物在多种肿瘤治疗中发挥较好的临床疗效，但细胞毒类药物因普遍存在毒性大，患者耐受性差等缺点在临床使用中受到了一定限制；靶向药物通常也因个体差异大、耐药现象严重等不足不能达到令人十分满意的临床疗效。

鉴于此，开展新型抗肿瘤药物研究仍是全球新药开发任务的重点任务之一。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新型3,5-二取代1H-吲哚衍生物及其合成与应用。

本发明提供了一种式11所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物：

式中，R选自卤素、C₁～C₆甲基、C₁～C₆甲氧基、-OH、-COOH、-SO₃H或-SO₂NH₂。

优选地，所述R取代基的位置为式11所示化合物的3位取代或4位取代。

优选地，所述R选自卤素、C₁～C₄甲基或C₁～C₄甲氧基。

进一步优选地，所述化合物的结构为：

本发明提供了一种制备前述化合物的方法，它包括以下步骤：

(1)将POCl₃加入DMF中，搅拌0.5h，加入式1所示化合物，制得式2所示化合物；

(2)将式2所示化合物、二碳酸二叔丁酯、4-二甲氨基吡啶加入到四氢呋喃中，制得式3所示化合物；

(3)依次将式3所示化合物、NaBH₄加入甲醇中，淬灭，制得式4所示化合物；

(4)依次将式4所示化合物、二氯亚砜加入到DCM中，反应1.5h，淬灭，制得式5所示化合物；

(5)将式5所示化合物、式6所示化合物、K₂CO₃加入DMF中，制得式7所示化合物；

(6)将式7所示化合物、铁粉、NH₄Cl加入无水乙醇和水中，制得式8所示化合物；

(7)依次将式8所示化合物、式9所示化合物、HOBT、EDCI、DIEA加入DCM中，制得式10所示化合物；

(8)将式10所示化合物、三氟乙酸加入DCM中，制得目标化合物11。

优选地，步骤(1)中，所述POCl₃加入DMF中时的温度为0℃；所述式1所示化合物、POCl₃、DMF的摩尔比为1:8:10；所述式2所示化合物是通过将反应后所得反应液依次调节pH为7、萃取、浓缩得到；所述调节pH是利用6N NaOH调节pH；所述萃取是利用乙酸乙酯萃取3次；

步骤(2)中，所述反应温度为25±2℃；所述反应时间为3h；所述式2所示化合物、二碳酸二叔丁酯、4-二甲氨基吡啶、四氢呋喃的投料比为18.9:20.8:1:76.9mmol/mmol/mmol/ml；所述式3所示化合物式通过对反应后的反应液依次进行浓缩、重结晶得到；

步骤(3)中，所述反应温度为25±2℃；所述反应时间为0.5h；所述式3所示化合物、NaBH₄、甲醇的投料比为1:2.16:5.26mmol/mmol/ml；所述淬灭是利用丙酮将反应淬灭；所述式4所示化合物是浓缩、柱层析得到；所述柱层析是以PE:EA＝3:1为洗脱剂；

步骤(4)中，所述反应温度为25±2℃；所述式4所示化合物、二氯亚砜、DCM的投料比为1:4:4.2mmol/mmol/ml；所述淬灭是加水淬灭反应；所述式5所示化合物是通过萃取、干燥、浓缩、柱层析得到；所述萃取是利用DCM萃取3次；所述干燥是利用无水硫酸镁干燥；所述柱层析是以PE:EA＝4:1为洗脱剂；

步骤(5)中，所述反应温度为25±2℃；所述反应时间为12h；所述式5所示化合物、K₂CO₃、式6所示化合物、DMF的投料比为1:2:1.23:3.85mmol/mmol/mmol/ml；所述式7所示化合物是通过稀释、萃取、洗涤、干燥、浓缩、柱层析得到；所述稀释是加10倍水稀释；所述萃取是利用乙酸乙酯萃取3次；所述洗涤是利用饱和食盐水洗涤；所述干燥是利用无水硫酸镁干燥；所述柱层析是以PE:EA＝4:1为洗脱剂；

步骤(6)中，所述反应温度为80±2℃；所述反应时间为0.5h；所述式7所示化合物、铁粉、NH₄Cl、无水乙醇、水的投料比为1:5:0.48:12.9:6.45mmol/mmol/mmol/ml/ml；所述式8所示化合物是通过过滤、浓缩、稀释、萃取、洗涤、干燥、浓缩、柱层析得到；所述稀释是加水稀释；所述萃取是利用乙酸乙酯萃取3次；所述洗涤是利用饱和食盐水洗涤；所述干燥是利用无水硫酸镁干燥；所述柱层析是以PE:EA＝1:1为洗脱剂；

步骤(7)中，所述反应温度为25±2℃；所述反应时间为12h；所述式8所示化合物、式9所示化合物、HOBT、EDCI、DIEA、DCM的投料比为0.69:1:1:1:2.13:7.5mmol/mmol/mmol/mmol/mmol/ml；所述式10所示化合物是通过浓缩、洗涤、萃取、洗涤、干燥、浓缩、柱层析得到；所述洗涤是利用饱和碳酸氢钠洗涤；所述萃取是利用乙酸乙酯萃取3次；所述洗涤是利用饱和食盐水洗涤；所述干燥是利用无水硫酸镁干燥；所述柱层析是以DCM:MeOH＝60:1为洗脱剂；

步骤(8)中，所述反应温度为25±2℃；所述反应时间为12h；所述式10所示化合物、三氟乙酸、DCM的投料比为1:0.94:9.4mmol/ml/ml；所述目标化合物11是通过调节PH为8、萃取、干燥、浓缩、柱层析得到；所述调节pH是利用饱和碳酸氢钠调节；所述萃取是利用乙酸乙酯萃取3次；所述干燥是利用无水硫酸镁干燥；所述柱层析是以DCM:MeOH＝20:1为洗脱剂。

前述式11所示化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备治疗胰腺癌药物中的用途。

本发明公开了一种药物组合，它是以前述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助成分制备成药学上常用的制剂。

本发明中：

DCM为二氯甲烷。

DMF为二甲基甲酰胺。

HOBT为1-羟基苯并***。

EDCI为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

DIEA为N,N-二异丙基乙胺。

本发明所述“室温”为25±2℃。

本发明所述“过夜”为12±1h。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“盐”和“可药用的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

本发明提供了一种新型3,5-二取代1H-吲哚衍生物，同时提供了制备该化合物的方法，共涉及维尔斯迈尔-哈克反应(Vilsmeier–Haack)、仲胺的叔丁氧羰基(Boc)保护、醛的还原、羧酸与胺的缩合等八步反应，每步反应产率均高于60％，且其中四步反应产率都高于90％，本发明所有化合物纯度均大于95％，符合后期抗肿瘤细胞活性测试所需纯度。本发明制备得到的化合物11a-11h对胰腺癌细胞株BxPC-3均具有较好的抑制活性，其中式11e所示化合物的活性最好，IC₅₀高达2.28μmol/L，且该化合物对人正常细胞几乎无毒副作用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1目标化合物的合成

1、中间体2的合成

在0℃下，将POCl₃(9.2ml,98.5mmol)以滴加到DMF(9.5ml,123.1mmol)中，搅拌0.5h后，将5-硝基-1H-吲哚(化合物1,2.0g，12.3mmol)加入反应液，接着于室温下反应1.5h。然后将反应液倒入大量冰水中并用6N NaOH调节pH为7，再用乙酸乙酯萃取(×3)，浓缩，得2.34g灰色固体，产率98％，纯度为95.2％。LCMS m/z:191.0[M+H]⁺。

2、中间体3的合成

分别将化合物2(2.34g,12.3mmol)，二碳酸二叔丁酯(2.95g,13.5mmol),4-二甲氨基吡啶(75.8mg,0.62mmol)加入至50ml四氢呋喃中，并于室温下反应3h，然后浓缩，乙酸乙酯进行重结晶得淡黄色固体3.3g，产率92％，纯度为97.0％。LCMS m/z:291.1[M+H]⁺。

3、中间体4的合成

在冰浴下，将化合物3(3.3g,11.4mmol)加入到60ml甲醇中，然后以加入NaBH₄(0.93g,24.6mmol)后移至室温反应0.5h。最后用丙酮将反应淬灭，浓缩，硅胶柱分离(PE:EA＝3:1)得3.03g棕黄色固体，产率91％，纯度为96.57％。LCMS m/z:293.0[M+H]⁺。

4、中间体5的合成

将化合物4(2.78g,9.5mmol)加入到40ml DCM中，接着在0℃下，将二氯亚砜(2.75ml,37.8mmol)加入到以上反应液，并将反应液移至室温反应1.5h。最后加水淬灭反应后用DCM萃取(×3)，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，硅胶柱分离(PE:EA＝4:1)得2.0g白色固体，产率67％，纯度为95.7％。LCMS m/z:311.1[M+H]⁺。

5、中间体7的合成

1)中间体7e的合成

分别将化合物5(400mg,1.3mmol),K₂CO₃(357mg,2.6mmol)和对氟苯硫酚(化合物6，165μl,1.6mmol)加入至5ml DMF中，并于室温反应过夜。然后加10倍水稀释，乙酸乙酯萃取(×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱分离(PE:EA＝4:1)得476mg固体，产率92％，纯度为96.0％。LCMS m/z:403.1[M+H]⁺。

2)中间体7a～7j的合成

合成中间体7a～7j方法与合成中间体7e的方法相同，其中6a～6j对应于6e，如表1所示，最终制得中间体7a～7j。

表1合成中间体7a～7f所用的原料及产品的产率、纯度

6、中间体8的合成

1)中间体8e的合成

分别将化合物7e(250mg,0.62mmol),铁粉(174mg,3.1mmol)和NH₄Cl(17mg,0.3mmol)加入至无水乙醇(8ml)和水(4ml)中，并于80℃反应0.5h。待反应完毕，趁热过滤，浓缩，加水稀释后，加入乙酸乙酯萃取(×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱分离(PE:EA＝1:1)，得196mg透明粘稠液，产率85％，纯度为95.3％。LCMS m/z:373.1[M+H]⁺。

2)中间体8a～8j的合成

合成中间体8a～8j方法与合成中间体8e的方法相同，其中7a～7j对应于7e，如表2所示，最终制得中间体8a～8j。

表2合成中间体8a～8f所用的原料及产品的产率、纯度

7、中间体10的合成

1)中间体10e的合成

将1-甲基-1H-吡唑-4-羧酸(9,101mg,0.8mmol),化合物8e(200mg,0.55mmol),HOBT(117mg,0.8mmol)，EDCI(154mg,0.8mmol)和DIEA(266μl,1.7mmol)在冰浴下加入至6mlDCM中，然后将反应液移至室温下反应过夜。待反应完毕后浓缩，用饱和碳酸氢钠洗涤，乙酸乙酯萃取(×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝60:1)得225mg白色固体，产率87％，纯度为98.1％。LCMS m/z:463.2[M+H]⁺。

2)中间体10a～10j的合成

合成中间体10a～10j方法与合成中间体10e的方法相同，其中8a～8j对应于8e，如表3所示，最终制得中间体10a～10j。

表3合成中间体10a～10f的原料及产品的产率、纯度

8、目标化合物11的合成

1)目标化合物11e的合成

将化合物10e(154mg,0.32mmol)和三氟乙酸(300μl,10％)加入至3ml DCM中，然后于室温下反应过夜。反应完毕后用饱和碳酸氢钠调节PH＝8，乙酸乙酯萃取(×3)，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得82mg白色固体，产率60％，纯度为96.7％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:363.1[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.91(s,1H),9.73(s,1H),8.30(s,1H),8.05(s,1H),7.97(s,1H),7.48-7.36(m,3H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.24(d,J＝2.0Hz,1H),7.16(t,J＝8.8Hz,2H),4.37(s,2H),3.91(s,3H)ppm。

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ162.4,160.7,139.2,133.7,132.9,132.8,131.6,131.5,131.4,126.8,125.7,119.4,116.8,116.5,116.3,111.8,111.0,109.7,39.3,30.0ppm。

96.7％HPLC纯度。

2)目标化合物11a的合成

目标化合物11a与目标化合物11e的合成方法相同，其中10a的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率63％，纯度为97.6％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:363.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.96(s,1H),9.73(s,1H),8.30(s,1H),8.04(s,1H),7.98(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.34(t,J＝12.0Hz,3H),7.24(d,J＝10.0Hz,1H),7.19(d,J＝8.4Hz,1H),6.99(td,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.46(s,2H),3.91(s,3H)ppm；

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ164.0,160.7,140.7,139.2,133.7,132.8,131.4,131.1,126.8,125.9,123.8,119.4,116.8,114.4,112.5,111.8,111.0,109.1,39.3,28.4ppm；

97.6％HPLC纯度。

3)目标化合物11b的合成

目标化合物11b与目标化合物11e的合成方法相同，其中10b的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率65％，纯度为98.1％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:397.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.95(s,1H),9.72(s,1H),8.30(s,1H),8.04(s,1H),7.98(s,1H),7.44(d,J＝9.2Hz,2H),7.36-7.28(m,4H),7.26-7.18(m,1H),4.46(s,2H),3.91(s,3H)ppm；

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ160.7,140.5,139.2,134.0,133.7,132.8,131.4,130.9,127.1,126.8,126.6,125.9,125.6,119.4,116.9,111.8,111.0,109.1,39.3,31.2ppm；

98.1％HPLC纯度。

4)目标化合物11c的合成

目标化合物11c与目标化合物11e的合成方法相同，其中10c的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率65％，纯度为97％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:377.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.92(s,1H),9.73(s,1H),8.30(s,1H),8.04(s,1H),7.97(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.33-7.30(m,2H),7.22-7.16(m,3H),6.98(d,J＝6.8Hz,1H),4.39(s,2H),3.91(s,3H),2.29(s,3H)ppm；

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ160.7,139.2,138.7,137.6,133.7,132.8,131.4,129.2,128.8,126.9,126.6,125.7,125.4,119.4,116.8,111.7,111.0,109.7,39.3,28.7,21.4ppm；

97.3％HPLC纯度。

5)目标化合物11d的合成

目标化合物11d与目标化合物11e的合成方法相同，其中10d的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率60％，纯度为97％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:393.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.93(s,1H),9.72(s,1H),8.29(s,1H),8.04(s,1H),7.98(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.32(d,J＝9.2Hz,2H),7.23(t,J＝8.0Hz,1H),6.94(d,J＝7.6Hz,1H),6.90(s,1H),6.74(d,J＝10.0Hz,1H),4.41(s,2H),3.91(s,3H),3.74(s,3H)ppm；

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ160.7,160.0,139.2,139.1,133.7,132.8,131.4,130.2,126.9,125.7,120.3,119.4,116.8,113.4,111.7,111.0,109.6,55.5,39.3,31.2ppm；

97.0％HPLC纯度。

6)目标化合物11f的合成

目标化合物11f与目标化合物11e的合成方法相同，其中10f的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率65％，纯度为97.8％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:397.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.93(s,1H),9.71(s,1H),8.29(s,1H),8.02(s,1H),7.95(s,1H),7.44-7.27(m,7H),4.40(s,2H),3.90(s,3H)ppm；

97.8％HPLC纯度。

7)目标化合物11g的合成

目标化合物11g与目标化合物11e的合成方法相同，其中10g的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率66％，纯度为98.2％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:377.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.93(s,1H),9.71(s,1H),8.29(s,1H),8.02(s,1H),7.95(s,1H),7.51-7.45(m,2H),7.42(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),7.35-7.27(m,4H),4.40(s,2H),3.90(s,3H),3.35(s,3H)ppm；

98.2％HPLC纯度。

8)目标化合物11h的合成

目标化合物11h与目标化合物11e的合成方法相同，其中10h的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率63％，纯度为97.6％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:393.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.87(s,1H),9.73(s,1H),8.31(s,1H),8.05(s,1H),7.96(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.31(d,J＝8.8Hz,3H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),4.27(s,2H),3.91(s,3H),3.74(s,3H)ppm；

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ160.7,158.7,139.2,133.7,132.8,132.4,131.3,127.4,126.8,125.6,119.5,116.8,115.1,111.7,111.1,110.3,55.6,39.3,31.1ppm；

97.6％HPLC纯度。

9)目标化合物11i的合成

目标化合物11i与目标化合物11e的合成方法相同，其中10i的用量对应于10e，硅胶柱分离(DCM:MeOH＝20:1)得白色固体，产率62％，纯度为97.5％。

对其进行表征得：

LCMS m/z:441.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.97(s,1H),9.74(s,1H),8.30(s,1H),8.05(s,1H),7.99(s,1H),7.55(s,1H),7.45(d,J＝8.8Hz,1H),7.40-7.30(m,4H),7.26(t,J＝8.0Hz,1H),4.46(s,2H),3.91(s,3H)ppm；

¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ160.7,140.8,139.2,133.7,132.8,131.4,131.2,130.0,128.5,127.0,126.8,125.9,122.6,119.4,116.9,111.8,111.0,109.1,39.3,28.6ppm；

97.8％HPLC纯度。

10)目标化合物11j的合成

LCMS m/z:441.1[M+H]⁺；

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.89(s,1H),9.71(s,1H),8.29(s,1H),8.03(s,1H),7.94(d,J＝1.6Hz,1H),7.43(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),7.33-7.21(m,4H),7.12(d,J＝8.0Hz,2H),4.33(s,2H),3.90(s,3H)ppm；

97.9％HPLC纯度。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1

1、实验材料

DMEM：DMEM培养基

10％FBS：胎牛血清

DMSO：二甲基亚砜

实验肿瘤细胞株：胰腺癌BxPC-3细胞株，人正常肝细胞HL-7702

2、细胞的准备及处理

首先，将细胞株接种到含有DMEM+10％FBS培养基的96孔板中，于37℃,5％CO₂的条件下培养过夜。次日，向培养板中加入培养基稀释的梯度浓度的待测化合物及空白对照处理72小时，再向每孔加入浓度为5mg/mL的MTT试剂20μl，继续培养2-4h。待到甲瓒形成后，吸去上清液，再向每孔中加入150μL的DMSO，振荡使形成的甲瓒充分溶解，采用酶标仪测定570nm波长下的吸光度值(OD570)。

最后，根据抑制率＝(空白对照组OD570-实验组OD570)/空白对照组OD570×100％，计算化合物对各种细胞的抑制率，并采用Graphpad软件拟合求得IC₅₀值。

3、实验结果

3.1抑制肿瘤细胞活性

我们选取了BxPC-3胰腺癌细胞株，测试了10个目标化合物对这两组细胞株的增殖抑制活性，测试结果见表4。

表4目标化合物11a-11j对胰腺癌细胞的抑制活性

从表4可以看出，目标化合物11a-11j对BxPC-3细胞株均有较好的增殖抑制活性(IC₅₀＜10μmol/L)，且这些化合物中苯基4-位取代比苯基3-位取代的抑制效果更好(11e优于11a,11f优于11b,11g优于11c,11h优于11d,11j优于11i,)。

所有10个目标化合物中11e对BxPC-3细胞株的增殖抑制活性最好，IC₅₀高达2.28μmol/L。

3.2化合物毒性

为了验证本发明制备的目标化合物是否为细胞毒类化合物并初步评价该化合物的毒性，我们测试了目标化合物11e在50μmol/L浓度下对多种肿瘤细胞和人正常肝细胞HL-7702的抑制活力，测试结果见表5。

表5目标化合物中11e对多种肿瘤细胞及人正常肝细胞HL-7702的抑制活性

从表5可以看出，化合物11e在50μmol/L时仅对胰腺癌细胞株BxPC-3有高达91±5％的抑制率，而对其他肿瘤细胞如乳腺癌细胞MDA-MB-231、套细胞淋巴瘤细胞JeKo-1、肺癌细胞PC-9和肝癌细胞HUH7等几乎无抑制活性。表明目标化合物11e是特异性抑制了胰腺癌细胞株BxPC-3的增殖，而非细胞毒原因造成的细胞增殖抑制。此外11e在50μmol/L浓度下对人正常肝细胞HL-7702的抑制率仅为17±2％，表明该化合物对人正常细胞几乎无毒副作用。鉴于以上结果，目标化合物11e是一个较好的抗胰腺癌苗头化合物。

综上，本发明提供了一种新型3,5-二取代1H-吲哚衍生物，同时提供了制备该化合物的方法，共涉及维尔斯迈尔-哈克反应(Vilsmeier–Haack)、仲胺的叔丁氧羰基(Boc)保护、醛的还原、羧酸与胺的缩合等八步反应，每步反应产率均高于60％，且其中四步反应产率都高于90％，本发明所有化合物纯度均大于95％，符合后期抗肿瘤细胞活性测试所需纯度。本发明制备得到的化合物11a-11h对胰腺癌细胞株BxPC-3均具有较好的抑制活性，其中式11e所示化合物的活性最好，IC₅₀高达2.28μmol/L，且该化合物对人正常细胞几乎无毒副作用。

Claims

1.式11所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐：

式中，R选自卤素、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、-OH、-COOH、-SO₃H或-SO₂NH₂。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述R取代基的位置为式11所示化合物的3位取代或4位取代。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：所述R选自卤素、C₁～C₄烷基或C₁～C₄烷氧基。

4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于：所述化合物的结构为：

5.一种制备权利要求1～4任意一项所述化合物的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述POCl₃加入DMF中时的温度为0℃；所述式1所示化合物、POCl₃、DMF的摩尔比为1:8:10；所述式2所示化合物是通过将反应后所得反应液依次调节pH为7、萃取、浓缩得到；所述调节pH是利用6N NaOH调节pH；所述萃取是利用乙酸乙酯萃取3次；

7.权利要求1～4任一项所述式11所示化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐在制备治疗胰腺癌药物中的用途。

8.一种药物组合，其特征在于：它是以权利要求1～4任意一项所述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅助成分制备成的制剂。