CN107915705B - 一种二硫苏糖醇荧光探针 - Google Patents

一种二硫苏糖醇荧光探针 Download PDF

Info

Publication number
CN107915705B
CN107915705B CN201711162123.5A CN201711162123A CN107915705B CN 107915705 B CN107915705 B CN 107915705B CN 201711162123 A CN201711162123 A CN 201711162123A CN 107915705 B CN107915705 B CN 107915705B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dithiothreitol
fluorescent probe
solvent
compound
methanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201711162123.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107915705A (zh
Inventor
林伟英
张楠
董宝利
孔秀琪
王超
宋文辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Jinan
Original Assignee
University of Jinan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Jinan filed Critical University of Jinan
Priority to CN201711162123.5A priority Critical patent/CN107915705B/zh
Publication of CN107915705A publication Critical patent/CN107915705A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107915705B publication Critical patent/CN107915705B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种二硫苏糖醇荧光探针，其化学结构式为：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE002
。所述二硫苏糖醇荧光探针可用于检测溶液与细胞中的二硫苏糖醇，荧光检测条件为：单光子激发波长为580 nm，双光子的激发波长为800 nm，发射波长为638 nm，检测波段为520‑800 nm。

Description

一种二硫苏糖醇荧光探针
技术领域
本发明涉及一种基于罗丹明衍生物的二硫苏糖醇荧光探针及其应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
二硫苏糖醇（DTT），是一种合成硫醇，已被广泛应用于细胞生物学、生物化学和生物医学应用领域。DTT常被用作强还原剂，用于保护细胞和组织解毒剂，辐射防护剂等等。DTT可将巯基（SH）基保持在还原态，常被用来还原蛋白和多肽中的二硫键，以及在疫苗制剂中普遍用于防止蛋白半胱氨酸残基形成分子内和分子间的二硫键。DTT还具有抗氧化作用，对一些隐藏的二硫键，可借助变性条件下来还原二硫键，如高温或钠离子变性剂。此外，DTT是一种有毒的物质，例如，过渡金属存在时，DTT会引起生物分子的氧化损伤，同时DTT还可强化一些含砷和汞的化合物毒性。因此，实时检测生物及细胞内DTT含量，对于研究DTT的毒理具有重要意义。
在检测DTT的各种方法中，荧光分析法通常由于其的操作简单和高灵敏度得到广泛应用。然而，目前多数人研究显示，荧光探针检测生物硫醇中DTT的选择性较差。因此，研制一款可以在生物硫醇有效中检测DTT的荧光荧光探针就更为重要。尽管一些对特定硫醇的检测和鉴别的检验据报道，据我们所知，极少有特异性检测和鉴别二硫苏糖醇分子荧光探针。
发明内容
针对缺少特异性检测和鉴别二硫苏糖醇分子的荧光探针等问题，本发明提供一种基于罗丹明衍生物的检测生物体内二硫苏糖醇的荧光探针。
本发明的另一目的是提供一种简便的上述二硫苏糖醇的荧光探针的合成方法。
本发明的再一目的是提供一种上述二硫苏糖醇的荧光探针在检测生物体内二硫苏糖醇的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种二硫苏糖醇荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
式（I）。
一种上述二硫苏糖醇荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）4-二乙氨基酮酸和1,6-二羟基萘在浓硫酸中加热回流；然后将反应液冷却，加入高氯酸使其析出沉淀，抽滤、烘干并纯化，得化合物1：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE004
；
（2）在三乙胺存在下，化合物1与2,4-二硝基苯磺酰氯在溶剂中低温反应至化合物1反应完全，除溶剂后得固体，纯化，得二硫苏糖醇荧光探针：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE006
。
4-二乙氨基酮酸和1,6-二羟基萘的摩尔比为1-1.2:1。
所述步骤（1）中加热回流温度为90 ℃，冷却温度为-5-0 ℃。
步骤（1）中纯化为柱层析纯化：将固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇=10:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得化合物1的固体。
化合物1与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2。
步骤（2）中溶剂优选为二氯甲烷。
步骤（2）中反应温度为0-10 ℃。
作为优选，步骤（2）中纯化为柱层析纯化：固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇= 50:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得二硫苏糖醇的荧光探针粉末。
一种上述二硫苏糖醇荧光探针在检测溶液与细胞中二硫苏糖醇中的应用。
上述应用中荧光检测条件为：单光子激发波长为580 nm，双光子的激发波长为800nm，发射波长为638 nm，检测波段为520-800 nm，优选为600-700 nm。
本发明的荧光原理如下：
本发明的荧光探针在二硫苏糖醇存在的条件下，荧光探针分子结构中的2,4-二硝基苯磺基可脱去，生成具有荧光发射能力很强的化合物1，此时荧光探针发射强烈红色荧光（峰值约为638 nm）；一定浓度范围内，荧光强度与二硫苏糖醇呈正相关，通过检测不同的荧光强度来测定二硫苏糖醇的浓度。
本发明具有以下优点：
本发明的二硫苏糖醇的荧光探针具有高特异性，在进行相应二硫苏糖醇检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内二硫苏糖醇药物的用量检测，具有广阔的应用前景。本发明的二硫苏糖醇的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（600- 800nm），通过绘制标准曲线进行生物及细胞内-二硫苏糖醇测定，可以实现对活细胞内二硫苏糖醇的快速准确检测。本发明的二硫苏糖醇的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
附图说明
图1是荧光探针的1H NMR图谱；
图2是荧光探针在不同浓度的DTT条件下的荧光光谱；
图3是荧光探针在638 nm处随DTT浓度变化线性关系图；
图4是荧光探针在固定浓度的DTT条件下随时间变化的荧光光谱；
图5是荧光探针在638 nm处随时间变化关系图；
图6是荧光探针与不同相关物质反应后的荧光光谱；
图7是荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 二硫苏糖醇荧光探针的制备。
4-二乙氨基酮酸（1 mmol）和1,6-二羟基萘（1 mmol）在浓硫酸（4 mL）中90℃加热回流；然后将反应液冷却至0℃，加入高氯酸（4 mL）使其析出沉淀，抽滤、烘干得固体，将固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇=10:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得化合物1的固体。
将化合物1 (1 mmol)、2、4-二硝基苯磺酰氯（1 mmol）、三乙胺（0.2 mmol）和二氯甲烷（10 mL）加入到50 mL单口烧瓶中，0℃下搅拌2h，反应完全，旋干后将所得固体进行柱层析纯化，得到淡红色产物即为本发明所述检测二硫苏糖醇(DTT)的荧光探针。将所得固体进行柱层析（二氯甲烷:甲醇=50:1）纯化，得到385 mg淡红色产物，即为本发明所述检测生物体及细胞内二硫苏糖醇荧光探针，产率42%，荧光探针的1H NMR图谱如图1所示。
实施例2 二硫苏糖醇荧光探针对不同浓度二硫苏糖醇的响应。
将实施例1中制备的二硫苏糖醇荧光探针溶于甲醇，再以磷酸盐缓冲生理盐水（pH7.4）配制成10 μM的探针溶液，溶液中甲醇含量为20wt%；配制二硫苏糖醇溶液，其浓度依次为0，10，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300 μM；然后分别将5mL荧光探针溶液与不同浓度的二硫苏糖醇溶液混合反应30 min，进行荧光检测（λex =580nm，λem= 638nm），测定各体系中荧光强度。
以波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，作荧光探针对不同浓度二硫苏糖醇的响应如图2所示：荧光强度的峰值在638nm左右，随着硫苏糖醇的浓度升高，荧光强度的峰值逐渐升高；以二硫苏糖醇浓度为横坐标，以638nm处的荧光强度为纵坐标，荧光强度与二硫苏糖醇浓度的线性关系如图3所示：在二硫苏糖醇的浓度10-300 μM间，荧光强度与二硫苏糖醇浓度呈线性正相关。
实施例3 不同反应时间对二硫苏糖醇荧光探针荧光强度的影响。
将实施例1中制备的二硫苏糖醇荧光探针溶于甲醇，再以磷酸盐缓冲生理盐水（pH7.4）配制成10 μM的探针溶液，其中甲醇含量为20wt%；以磷酸盐缓冲生理盐水（pH 7.4）配制300 μM二硫苏糖醇溶液。然后将5 mL荧光探针溶液与300 μM二硫苏糖醇溶液混合反应30min，进行荧光检测（λex = 580nm，λem= 638nm），每隔2min测定体系中荧光强度，测定40min。
以波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，作荧光探针对不同反应时间二硫苏糖醇的荧光强度如图4所示：荧光强度的峰值在638nm左右，随着反应时间的延长，荧光强度的峰值逐渐升高；以反应时间为横坐标，以638nm处的荧光强度为纵坐标，分析荧光强度与反应时间的关系如图5所示：反应0-30 min时，荧光强度迅速增长，30-40 min增长较为平缓，接近饱和状态。
实施例4 二硫苏糖醇荧光探针的抗干扰性。
将实施例1中制备的二硫苏糖醇荧光探针溶于甲醇，再以磷酸盐缓冲生理盐水（pH7.4）配制成10 μM的探针溶液，其中甲醇含量为20wt%；
将5 mL荧光探针溶液与分别与300 μM的干扰物质与二硫苏糖醇的PBS溶液混合反应30 min，进行荧光检测（λex = 580nm，λem= 638nm）。
不同物质的荧光强度的柱形图如图4所示，其中，CuSO4、MgSO4、CaCl2、CoCl2、NaNO2、Na2SO3、Na2SO4、ZnSO4、过氧叔丁基、过氧叔丁醇、HClO、H2O2、NO、Na2S、SnSO4、KI、HgCl2、Vc、Hcys、Cys、GSH、二硫苏糖醇编号为1-22。由图可知，本二硫苏糖醇荧光探针可抗多种干扰性物质的影响，特异性强。
实施例5二硫苏糖醇荧光探针对细胞中DTT的检测。
将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37 ℃、5%CO2和20% O2的培养箱中培养48h。用微量进样器吸取本发明所述检测细胞内二硫苏糖醇(DTT)的荧光探针(10 μM)注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。之后用PBS（磷酸缓冲生理盐水）冲洗培养细胞3次，然后进行荧光成像。
结果如图7所示，其中A表示探针（10 μM）分别加了0、50 μM、100 μM DTT在细胞分别在明场、561 nm激发的红色通道细胞图片、明场和红色通道叠加的细胞图以及800 nm激发的双光子荧光细胞图，B表示探针在浓度在0、50 μM、100 μM DTT中单光子红色通道荧光强度柱状图，C是探针在分析物浓度在0、50 μM、100 μM DTT分析物中双光子红色通道荧光强度柱状图。
结果如图7所示，其中，A表示探针（10 μM）在细胞分别在单光子荧光检测的明场、红色通道和两者叠加图像及双光子荧光通道图，B表示探针在浓度在0、50 μM、100 μM DTT中单光子红色通道荧光强度柱状图，C是探针在分析物浓度在0、50 μM、100 μM DTT分析物中双光子红色通道荧光强度柱状图。

Claims (10)

1.一种二硫苏糖醇荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式（I）。
2.一种如权利要求1所述的二硫苏糖醇荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,6-二羟基萘在浓硫酸中加热回流；然后将反应液冷却，加入高氯酸使其析出沉淀，抽滤、烘干并纯化，得化合物1：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
（2）在三乙胺存在下，化合物1与2,4-二硝基苯磺酰氯在溶剂中低温反应至化合物1反应完全，除溶剂后得固体，纯化，得二硫苏糖醇荧光探针：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸和1,6-二羟基萘的摩尔比为1-1.2:1。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，化合物1与2 ,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中纯化为柱层析纯化：将固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇=10:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得化合物1的固体。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中溶剂为二氯甲烷。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中纯化为柱层析纯化：固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇=50:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得二硫苏糖醇的荧光探针。
8. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中加热回流温度为90℃，冷却温度为-5~0℃；步骤（2）中反应温度为0-10 ℃。
9.一种如权利要求1所述的二硫苏糖醇荧光探针在检测溶液与细胞中二硫苏糖醇中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，荧光检测条件为：单光子激发波长为580nm，双光子的激发波长为800 nm，发射波长为638 nm，检测波段为520-800 nm。
CN201711162123.5A 2017-11-21 2017-11-21 一种二硫苏糖醇荧光探针 Expired - Fee Related CN107915705B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711162123.5A CN107915705B (zh) 2017-11-21 2017-11-21 一种二硫苏糖醇荧光探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711162123.5A CN107915705B (zh) 2017-11-21 2017-11-21 一种二硫苏糖醇荧光探针

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107915705A CN107915705A (zh) 2018-04-17
CN107915705B true CN107915705B (zh) 2021-04-30

Family

ID=61897436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711162123.5A Expired - Fee Related CN107915705B (zh) 2017-11-21 2017-11-21 一种二硫苏糖醇荧光探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107915705B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109096180B (zh) * 2018-09-20 2021-08-13 渤海大学 一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别h2s荧光探针及其合成方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012039499A1 (ja) * 2010-09-24 2012-03-29 独立行政法人理化学研究所 グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用
CN103571457A (zh) * 2012-08-02 2014-02-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种荧光探针及其在动态检测硫醇中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012039499A1 (ja) * 2010-09-24 2012-03-29 独立行政法人理化学研究所 グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼを用いた脱保護法、及びその利用
CN103571457A (zh) * 2012-08-02 2014-02-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种荧光探针及其在动态检测硫醇中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rhodamine-based fluorescent probes for selective detection of glutathione and cysteine;Wei Ming et al.;《Res Chem Intermed》;20170725;第43卷;第7387-7398页 *
有机小分子荧光探针的合成及性能研究;刘晓东;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20141015;第B014-463页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107915705A (zh) 2018-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108069966B (zh) 用于snap蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用
CN108047060B (zh) 一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用
CN107602502B (zh) 一种用于生物硫醇检测的esipt型荧光探针及应用
Wang et al. A novel pyrazoline-based selective fluorescent probe for detecting reduced glutathione and its application in living cells and serum
EP3160971B1 (en) Method for selective detection and estimation of histidine and cystein
CN105712964B (zh) 一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用
CN109336815B (zh) 一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针
Sun et al. 2, 4-Dinitrobenzenesulfonate-functionalized carbon dots as a turn-on fluorescent probe for imaging of biothiols in living cells
CN109825284B (zh) 一种乙二胺-β-环糊精修饰的Mn掺杂ZnS量子点及其制备方法和应用
Gong et al. Two-stage ratiometric fluorescent responsive probe for rapid glutathione detection based on BODIPY thiol-halogen nucleophilic mono-or disubstitution
Zhang et al. Highly sensitive and selective detection of biothiols by a new low dose colorimetric and fluorescent probe
CN110092773B (zh) 一种氧杂蒽类衍生物及其制备方法和应用
CN106929006B (zh) 一种以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用
CN108690011A (zh) 一种检测半胱氨酸的荧光探针
CN108863961B (zh) 一种三氮唑类蒽醌衍生物银离子荧光探针及其制备方法和应用
EP3039082B1 (en) A squaraine based fluorescent probe and a process for the preparation thereof
CN111073634B (zh) 基于硝基还原、硫氮转位的硝基还原酶荧光探针及其制备方法
CN108752373B (zh) 一种基于苯硼酯识别过氧化氢的荧光探针
CN107915705B (zh) 一种二硫苏糖醇荧光探针
CN111233928B (zh) 一种香豆素衍生物Mito-Cys及其制备方法和应用
Wei et al. Mitochondria-targeted ratiometric fluorescent imaging of cysteine
Fedorowicz et al. Synthesis and evaluation of dihydro-[1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] pyridin-2-ium carboxylates as fixed charge fluorescent derivatization reagents for MEKC and MS proteomic analyses
CN111269160B (zh) 含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物及制备和应用
CN114349717A (zh) 一种基于苯并噻唑衍生物半胱氨酸的荧光探针及其制备方法
CN112094233B (zh) 标记型萘酰亚胺荧光探针及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210430

Termination date: 20211121

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee