发明内容
为了更好地改善肥胖和/或糖尿病患者或潜在肥胖和/或糖尿病人群的状况,本申请获得了一种重组膜蛋白,特别是能够表达产生该蛋白的重组微生物。
具体来讲,本申请之一提供了一种重组膜蛋白,其氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。包含在如SEQ ID No.1中的如SEQ ID No.3的氨基酸序列可以等同替换为与其具有相同功能的氨基酸序列,这是本领域技术人员容易理解的,并且这种等同替换也在本申请的保护范围内。
本申请之二提供了一种能够编码如本申请之一所述的重组膜蛋白的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中,所述核苷酸序列包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
本申请之三提供了一种微生物,其能够表达产生如本申请之一所述的重组膜蛋白。
在一个具体实施方式中,所述微生物中含有如本申请之二所述的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中,所述核苷酸序列位于表达载体上。
在一个具体实施方式中,所述微生物选自益生菌中的至少一种。
在一个具体实施方式中,所述微生物选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococus)、肠球菌属(Enterococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)中的至少一种。
在一个具体实施方式中,优选所述微生物选自双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸链球菌(Streptococus lactis)中的至少一种。例如:双歧杆菌属长双歧杆菌(Bifidobacterium longum,ATCC 55813)、乳球菌属乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,ATCC 19257)、肠球菌属粪肠球菌(Enterococcus faecium,ATCCBAA-2319)、乳杆菌属干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,ATCC 393)、链球菌属乳酸链球菌(Streptococus lactis,ATCC 8403)。
本申请之四提供了一种组合物,所述组合物中包含如本申请之一所述的重组膜蛋白和/或如本申请之三中任意一项所述的微生物。
在一个具体实施方式中,所述组合物可以为食品、药品、饲料中的一种。并且根据作为食品、药品和饲料的用途,本领域的技术人员可以合理地添加相应的可接受的主料或辅料。由于部分生物群体对高脂食物具有很高的偏好性,为了在满足其口感偏好的同时,有效的控制其体重的增长,可以在组合物中加入高脂成分,例如,胆固醇、动物油脂、植物油脂、坚果等等。
在一个具体实施方式中,所述重组蛋白和/或所述微生物在所述组合物中的含量可以具有药学上的有效量。在用于食品和饲料时,所述重组蛋白和/或所述微生物的用量可以比较低,而用于作为药品时,则用量会偏高,这是本领域技术人员容易理解的。
在一个具体实施方式中,所述重组蛋白在所述组合物中的质量百分含量为2%至30%。
在一个具体实施方式中,所述微生物在所述组合物中的含量为1×107cfu/g至1×1011cfu/g。
本申请之五提供了如本申请之一所述的重组膜蛋白、本申请之二所述的核苷酸序列、如本申请之三中任意一项所述的微生物,以及如本申请之四所述的组合物中的至少一种在预防和/或改善生物代谢病症中的应用。或者换种表达方式讲,本申请之五提供了如本申请之一所述的重组膜蛋白、本申请之二所述的核苷酸序列、如本申请之三中任意一项所述的微生物,以及如本申请之四所述的组合物中的至少一种在制备用于预防和/或改善生物代谢病症药物和/或食品中的应用。
在一个具体实施方式中,所述生物选自人和/或动物中的一种。
在一个具体实施方式中,所述动物选自哺乳动物中的一种。
在一个具体实施方式中,所述哺乳动物可以为宠物。例如猫、狗、豚鼠、兔等。
在一个具体实施方式中,所述代谢病症选自肥胖症和/或糖尿病。
在一个具体实施方式中,所述肥胖为高脂饮食导致的肥胖。
在一个具体实施方式中,所述糖尿病为1或2型糖尿病。
“益生菌”是指提供对生物的保健或健康有益作用的微生物或微生物组分。根据定义,所述益生菌都具有被证明的非病原特性。
本申请中的微生物可以单独使用或者作为药物组合物的主要成分用于预防和改善因高脂饮食而导致的肥胖和糖尿病,其包含药效学有效量的本申请的重组膜蛋白或本申请的以表面展示方式表达重组膜蛋白的微生物。
本领域技术人员应该注意,上述“药学上的有效量”或“有效量”意指治疗有效量,本领域技术人员根据现有技术、经过简单的、有限次的实验即可确定其具体的数值。
本申请中的核苷酸序列可以交付给生物公司(例如按照Itatura等人所述的技术(Science,1977,198:1056-1063))来合成,也可以利用本领域已知的技术从宿主基因组中获得和鉴定基因。而本领域已知的技术包括进行基因的合成、克隆和重组表达载体的构建、核苷酸序列的鉴定、宿主细胞的转化和培养及重组蛋白的分离鉴定等操作参见Sambrooket al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989。
本申请的有益效果:
本申请的重组膜蛋白,特别是重组微生物能够更好地改善代谢病症(例如肥胖症和/或糖尿病),其可以显著降低因高脂饮食而引起的体重超重的问题;能够使生物的体重从过高水平恢复到正常水平。而且还能显著地改善高脂饮食生物的糖耐量。
实施例6口服糖耐量测定
从广东省实验动物中心购买SPF级昆明种雄性小鼠(12周龄,体重约24±2g/只),适应性喂饲7天后,随机分为3组:正常饲料对照组、高脂饲料模型组、重组干酪乳杆菌组(表达融合蛋白的重组乳杆菌1×109 CFU/天)和干酪乳杆菌(1×109 CFU/天)。各处理组动物每天通过灌胃的方式分别口服施用悬浮于磷酸盐缓冲液中的干酪乳杆菌、混合干酪乳杆菌和重组干酪乳杆菌,正常饲料对照组及高脂饲料模型组动物则使用等体积的磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物投喂高脂饲料,正常饲料对照组动物则投喂普通饲料。实验连续进行8周后,开始糖耐量测定。所有动物禁食10小时,尾静脉取血。然后,通过灌胃方法口服葡萄糖溶液(2克/公斤体重)。服后30、60、90和120分钟分别取血,利用血糖仪测定口服葡萄糖溶液前后血清血糖的含量。实验结果表明,经过饲喂4周的重组干酪乳杆菌,实验动物的糖耐量得到显著改善,与高脂饲料模型组相比,糖耐量曲线下面积下降了25.2%,在p<0.05水平上重组干酪乳杆菌组与高脂饲料模型组的糖耐量存在显著差异。在p<0.05水平上重组干酪乳杆菌组与干酪乳杆菌处理组的糖耐量也存在显著差异。而作为对照的干酪乳杆菌处理组与高脂饲料模型组相比,仅下降了8.2%,在p<0.05水平上干酪乳杆菌处理组与高脂饲料模型组的糖耐量没有显著差异(图5)。
序列表
<110> 广州佰斯伦生物技术公司
李校堃
<120> 一种重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物及应用
<130> LHA1760722
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(non)
<400> 1
Met Ala Ala Leu Leu Val Gly Thr Met Leu Ser Met Leu Thr Val Ile
1 5 10 15
Leu Ala Leu Pro Met Leu Gly Ser Thr Ala His Ala Leu Gly Met Ser
20 25 30
Ala Thr Ile Thr Ala Ala Leu Pro Ala Ala Met Val Ala Gly Val Gly
35 40 45
Leu Leu Leu Pro Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Thr Ile Val Ala Ser
50 55 60
Leu Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Ile Ser Ile Ala Ala Leu Gly Ile
65 70 75 80
Leu Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ile Thr Pro Ser Ala Ser Ser Ala Gly
85 90 95
Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Ala Thr Ala Leu Ala Val Gly Ser Leu
100 105 110
Gly Thr Ala Thr Leu Pro Pro Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr
115 120 125
Thr Pro Thr Ala Pro Gly Ala Gly Leu Leu Thr Pro Ala Ala Ser Leu
130 135 140
Ile Ser Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ile Leu Ile Thr Ala Thr Ser Ser
145 150 155 160
Thr Leu Gly Pro Gly Val Thr Ser Thr Gly Ala Pro Ser Val Gly Ala
165 170 175
Ala Ser Thr Leu Gly Pro Gly Leu Leu Ala Ile Ala Ser Leu Val Ala
180 185 190
Leu Leu Ala Gly Cys Gly Leu Ser Leu Pro Ile Leu Val Thr Ala Pro
195 200 205
Gly Leu Pro Ile Gly Thr Pro Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ser Ala Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Ala Pro Thr Thr Pro Met Pro Leu Gly Ile Ala Pro Gly
225 230 235 240
Gly Ala Ala Gly Ser Val Leu Leu Ala Met Ala Ala Ile Thr Gly Met
245 250 255
Gly Ala Thr Leu Pro Thr Val Ala Ser Ile Ala Ile Ala Ala Gly Ala
260 265 270
Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Pro Ala Ala
275 280 285
Ala Gly Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Ala Gly Ala
290 295 300
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gly Gly Val Ile Leu Pro Thr Met
305 310 315 320
Gly Leu Gly Gly Val Pro Val Gly Val Ser Leu Ala Leu Val His Pro
325 330 335
Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly Pro Ser Gly Ala Gly Gly Pro Gly Thr
340 345 350
Thr Gly Pro Ser Leu Pro Ala Gly Pro Gly Thr Thr Gly Pro Ser Gly
355 360 365
Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Thr Thr Gly Pro Gly
370 375 380
Ala Pro Gly Thr Thr Gly Pro Thr Ala Pro Gly Pro Gly Ala Pro Ala
385 390 395 400
Val Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Ala Pro Leu Pro Gly Gly Ser Gly
405 410 415
Leu Gly Gly Pro Ala Leu Pro Gly Leu Ile Leu Gly Pro Ser Thr Gly
420 425 430
Val Ala Gly Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala Gly Val Thr Thr Gly Met
435 440 445
Ala Gly Pro Gly Thr Pro Thr Gly Ser Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly
450 455 460
Thr Ala His Gly Thr Leu Pro Gly Thr Ser Gly
465 470 475
<210> 2
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(non)
<400> 2
atgcgtcgta agttagttgg ttacatgtta tcaatgttaa ctgttatttt agctttattc 60
atgttaggtt caactgctca tgctaaggaa atgtcaaact ggattactga taacaagcca 120
gctgctatgg ttgctggtgt tggtttatta ttattcttag gtttatcagc tactggttac 180
attgttaact caaagcgttc agaattagat aagaagattt caattgctgc taaggaaatt 240
aagtcagcta acgctgctga aattactcca tcacgttcat caaacgaaga attagaaaag 300
gaattaaacc gttacgctaa ggctgttggt tcattagaaa ctgcttacaa gccattctta 360
gcttcatcag ctttagttcc aactactcca actgctttcc aaaacgaatt aaagactttc 420
cgtgattcat taatttcatc atgtaagaag aagaacattt taattactga tacttcatca 480
tggttaggtt tccaagttta ctcaactcaa gctccatcag ttcaagctgc ttcaacttta 540
ggtttcgaat taaaggctat taactcatta gttaacaagt tagctgaatg tggtttatca 600
aagttcatta aggtttaccg tccacaatta ccaattgaaa ctccagctaa caacccagaa 660
gaatcagatg aagctgatca agctccatgg actccaatgc cattagaaat tgctttccaa 720
ggtgatcgtg aatcagtttt aaaggctatg aacgctatta ctggtatgca agattactta 780
ttcactgtta actcaattcg tattcgtaac gaacgtatga tgccaccacc aattgctaac 840
ccagctgctg ctaagccagc tgctgctcaa ccagctactg gtgctgcttc attaactcca 900
gctgatgaag ctgctgctcc agctgctcca gctattcaac aagttattaa gccatacatg 960
ggtaaggaac aagttttcgt tcaagtttca ttaaacttag ttcatttcaa ccaaccaaag 1020
gctcaagaac catcagaaga tggtgaacca ggtactactg aaccatcaaa gccagatgaa 1080
ccaggtacta ctgaaccatc acaaccaggt aagccaggta agccaggtga accaggtact 1140
actgaaccag gtaacccagg tactactggt ccaactgctc cacaaccaga acgtccagct 1200
gttccaggtc catcacaacc agctgctcca aagccaggtc aatcaggttt aggtcaacca 1260
gctttaccag gtttaattaa gcaaccatca actggtgtta acggtgctgg tggtactgtt 1320
ggtaacggtg ttactactgg tatgaacggt ttcggtactc caactggttc agatcaatca 1380
acttcagctg gttacaacca tggtacttta ccacaaactt cagaataa 1428
<210> 3
<211> 317
<212> PRT
<213> 阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)
<400> 3
Met Ser Asn Trp Ile Thr Asp Asn Lys Pro Ala Ala Met Val Ala Gly
1 5 10 15
Val Gly Leu Leu Leu Phe Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Tyr Ile Val
20 25 30
Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala Ala Lys
35 40 45
Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ser Ser
50 55 60
Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val
85 90 95
Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp
100 105 110
Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr
115 120 125
Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val
130 135 140
Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu
145 150 155 160
Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser
180 185 190
Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala
195 200 205
Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr
210 215 220
Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn
225 230 235 240
Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro
245 250 255
Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp
260 265 270
Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro
275 280 285
Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val
290 295 300
His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp
305 310 315
<210> 4
<211> 954
<212> DNA
<213> 阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)
<400> 4
atgtcaaact ggattactga taacaagcca gctgctatgg ttgctggtgt tggtttatta 60
ttattcttag gtttatcagc tactggttac attgttaact caaagcgttc agaattagat 120
aagaagattt caattgctgc taaggaaatt aagtcagcta acgctgctga aattactcca 180
tcacgttcat caaacgaaga attagaaaag gaattaaacc gttacgctaa ggctgttggt 240
tcattagaaa ctgcttacaa gccattctta gcttcatcag ctttagttcc aactactcca 300
actgctttcc aaaacgaatt aaagactttc cgtgattcat taatttcatc atgtaagaag 360
aagaacattt taattactga tacttcatca tggttaggtt tccaagttta ctcaactcaa 420
gctccatcag ttcaagctgc ttcaacttta ggtttcgaat taaaggctat taactcatta 480
gttaacaagt tagctgaatg tggtttatca aagttcatta aggtttaccg tccacaatta 540
ccaattgaaa ctccagctaa caacccagaa gaatcagatg aagctgatca agctccatgg 600
actccaatgc cattagaaat tgctttccaa ggtgatcgtg aatcagtttt aaaggctatg 660
aacgctatta ctggtatgca agattactta ttcactgtta actcaattcg tattcgtaac 720
gaacgtatga tgccaccacc aattgctaac ccagctgctg ctaagccagc tgctgctcaa 780
ccagctactg gtgctgcttc attaactcca gctgatgaag ctgctgctcc agctgctcca 840
gctattcaac aagttattaa gccatacatg ggtaaggaac aagttttcgt tcaagtttca 900
ttaaacttag ttcatttcaa ccaaccaaag gctcaagaac catcagaaga ttaa 954
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(non)
<400> 5
Met Met Ile Phe Lys Glu Leu Ser Glu Lys Glu Leu Gln Lys Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gly Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ile His Lys Ile Lys Gln
20 25 30
Ile Phe Thr His Arg
35