CN107899078A - 一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程的技术领域，公开了一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法。所述方法为：在惰性氛围中，以水为反应介质，以含有炔基的高分子材料支架、修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂与修饰有炔基的活性小分子为原料，在催化剂的作用下发生叠氮基与炔基的反应，使得高分子材料支架上修饰有生物活性层，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。本发明的方法反应条件温和、灵活高效，能够实现三维结构材料表面的均匀稳固修饰，对三维结构形式没有限制，适用范围广；生物活性层与三维支架稳固结合。

Description

一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法
技术领域
本发明属于组织工程领域，涉及一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，尤其涉及高分子复杂三维结构支架表面的稳固生物活性修饰方法。
背景技术
组织工程支架材料作为组织工程的三大要素之一，其为组织工程细胞提供生长的三维环境，为组织修复提供良好的环境。理想的支架不仅需要适当的力学性能和降解性能，较高的孔隙率和比表面积以适于细胞的粘附和生长以及良好的生物相容性也是必不可少的。因此，组织工程支架向三维化发展，FDM熔融沉积制造技术、SLS选择性激光烧结技术、静电纺丝技术以及3D打印技术渐渐取代了溶剂浇铸法、粒子沥滤法、气体发泡法、纤维网格粘结法、阶段分离法、熔融成形法、溶液浇铸法和冷冻干燥法等传统制备三维支架的方法，提高了对三维支架孔径大小，孔隙率以及内部通道的控制。
组织工程支架除了具有理想的结构外，生物相容性也尤为重要，一方面需要避免引发炎症或致畸反应，另一方面作为细胞的生物载体，需要赋予材料某些生物功能性。这就需要对支架材料进行生物活性分子的修饰。三维支架材料制备方法的进步虽然在一定程度上改善了细胞粘附及生长的情况，但是却给材料活性分子的修饰带来了一些难度。修饰方法包括本体改性和表面改性。由于多数活性分子无法承受三维成型过程中的高温环境或极端的处理条件，多数活性分子的修饰为表面修饰。
组织工程支架的表面修饰包括物理修饰和化学修饰。物理修饰即将活性材料或带有活性分子的材料通过物理涂覆或生物粘合剂粘附到支架表面，一方面物理修饰在细胞培养的过程中具有不够稳固的缺点，另一方面对于较复杂结构的三维支架，无法做到内部孔隙的完全粘附。化学修饰即通过化学键合的方式将活性分子或带有活性分子的材料接合到三维支架的表面。其中通过光或射线引发键合的方法虽然相较于物理修饰更加牢固和方便，但是与物理修饰具有相同的缺点，即光或射线无法均匀无死角的照射于三维支架孔隙内部，对于孔隙较小或复杂架构的支架来说，尤为困难，因此光引发的化学键合更加适用于二维基材的生物活性修饰。通过溶液反应的方法化学修饰活性分子更加适合成型前的修饰，而成型后想要通过溶液反应则会在不同程度上破坏支架的结构。
点击化学(click chemistry)是2001年由诺贝尔化学奖获得者K.BarrySharpless首次提出的一个模块化合成概念,它是一种选用易得原料,通过模块化的、可靠的、高效率的、高选择性的化学转变来实现碳杂原子连接(C—X—C),以低成本快速合成各类新化合物的组合化学新方法。本发明选用共价键修饰有炔基的高分子材料制备成支架，然后利用点击化学的特点，使得三维支架在水相以温和的条件在界面发生快速高效的点击反应，从而实现三维支架表面生物活性的修饰。另外水凝胶的水相反应可以保证任何结构的三维支架内部得到均匀地修饰，且这种化学修饰稳定可靠。此外，由于水凝胶的灵活可控性，通过对交联剂的种类、用量及时间的调控，甚至可以对生物活性分子的空间及数量进行精准调控。同时选用的修饰有炔基的高分子材料能够加工成型成结构稳定的三维支架，具有较好的力学性能。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法。本发明的方法可以实现三维结构材料表面的均匀稳固修饰(以物理吸附为例，当吸附环境或条件被破坏会导致脱吸附，不够稳定)，对三维结构形式没有限制，适用范围广，灵活高效，为组织工程领域复杂三维结构材料稳固的生物活性修饰提供可能。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，包括以下步骤：
在惰性氛围中，以水为反应介质，以含有炔基的高分子材料支架、修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂与修饰有炔基的活性小分子为原料，在催化剂的作用下发生叠氮基与炔基的反应，使得高分子材料支架上修饰有生物活性层，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。
所述修饰有叠氮基的生物活性大分子是生物活性大分子通过改性引入叠氮基的化合物；所述含有炔基的交联剂是交联剂通过改性引入炔基的化合物；所述含有炔基的高分子材料支架是指高分子材料通过改性引入炔基，然后加工成型成支架；所述修饰有炔基的活性小分子是将活性小分子通过改性引入炔基的化合物，通过常规的方法制备得到。所述活性小分子为含有氨基或羧基官能团的短肽或糖基药物。这些物质也可以通过购买得到。
所述含有炔基的高分子材料支架是由含有炔基的高分子材料成型而成，所述含有炔基的高分子材料为非水溶性且修饰有炔基的高分子材料，所述含有炔基的高分子材料优选为修饰有炔基的聚乳酸、修饰有炔基的聚乙醇酸、修饰有炔基的聚丙烯酸、修饰有炔基的聚己内酯或修饰有炔基的聚氨酯中的一种以上，含有炔基的高分子材料的数均分子量30000-100000；所述含有炔基的高分子材料是将高分子材料通过改性引入炔基所形成的材料，通过常规的方法制备得到。
所述含炔基的高分子材料支架的三维成型方法包括静电纺丝、3D打印、FDM技术、3DP技术等方法中的一种；
所述修饰有叠氮基的生物活性大分子为修饰有叠氮基的明胶、修饰有叠氮基的透明质酸、修饰有叠氮基的透明质酸钠、修饰有叠氮基的壳聚糖中一种以上；所述修饰有叠氮基的生物活性大分子是将生物活性大分子通过改性引入叠氮基所形成的化合物，通过常规的方法制备得到。
所述含有炔基的交联剂为修饰有炔基的聚己内酯(PEG)(分子量优先为100～1000)、修饰有炔基的聚丙烯酸(PAA)中一种以上；
所述修饰有炔基的活性小分子为修饰有炔基的短肽或修饰有炔基的糖基药物中一种以上；优选为修饰有炔基的RGD、修饰有炔基的TGF-β1、修饰有炔基的七肽、修饰有炔基的RGDfk、修饰有炔基的cRGDfk、修饰有炔基的RGDS中一种以上；所述修饰有炔基的活性小分子是将活性小分子通过改性引入炔基的化合物，通过常规的方法制备得到，也可通过购买得到。所述活性小分子为含有氨基或羧基官能团的短肽或糖基药物。
所述催化剂独立为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA、无水硫酸铜/抗坏血酸钠；催化剂的用量为常规用量。
所述含有炔基的高分子材料中炔基：修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基：含有炔基的交联剂中炔基的摩尔比为1：(1.5～5)：(0.4～1)且这几种物质中叠氮基的摩尔量大于炔基的总摩尔量；
所述修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的含量满足：1mol修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基≥2mol，优选为＞2mol。
所述修饰有炔基的活性小分子中炔基与修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的摩尔比为(0.1～1.5)：1。
优选地，所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，具体步骤为：
(1-1)在惰性氛围和水中，将修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂与含有炔基的高分子材料支架通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架；所述含有炔基的交联剂为双官能度或多官能度的端基为炔基的交联剂；
(1-2)在惰性氛围和水中，将修饰有炔基的活性小分子和表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架在催化剂的作用下进行反应，洗涤，干燥，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。
步骤(1-1)和(1-2)中所述催化剂各自独立为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；催化剂的用量为常规用量；
步骤(1-1)和(1-2)中所述反应的条件各自独立为10～80℃反应2～48h；所述干燥的条件各自独立为40～70℃干燥12～24h。
又优选地，所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，具体步骤为：
(2-1)在惰性氛围下，将修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂、含有炔基的高分子材料支架与修饰有炔基的活性小分子共同在水中通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面共价键合生物活性层的三维支架；所述含有炔基的交联剂为双官能度或多官能度的端基为炔基的交联剂。
步骤(2-1)中所述催化剂为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；催化剂的用量为常规用量；
步骤(2-1)中所述反应的条件为10～80℃反应2～48h；所述干燥的条件为40～70℃干燥12～24h。
又优选地，所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，具体步骤为：
(3-1)在惰性氛围和水中，将修饰有叠氮基的生物活性大分子与含有炔基的高分子材料支架通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架；此步骤中修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的含量小于含有炔基的高分子材料支架中炔基的含量；
(3-2)在惰性氛围和水中，将表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架、修饰有叠氮基的生物活性大分子与含有炔基的交联剂通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面改性的高分子材料支架；所述含有炔基的交联剂为双官能度或多官能度的端基为炔基的交联剂；
(3-3)在惰性氛围和水中，将修饰有炔基的活性小分子和表面改性的高分子材料支架在催化剂的作用下进行反应，洗涤，干燥，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。
步骤(3-1)～(3-3)中所述催化剂各自独立为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；催化剂的用量为常规用量；
步骤(3-1)～(3-3)中所述反应各自独立为10～80℃反应2～48h；所述干燥的条件各自独立为40～70℃干燥12～24h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明将共价键修饰有炔基的高分子材料加工成型制备成结构稳定的三维支架，然后通过叠氮基和炔基的反应在三维支架材料表面共价键合生物活性层，使得生物活性层均匀牢固修饰在三维支架中，这种化学修饰稳定可靠；而且通过化学键合修饰的活性分子在细胞培养处理过程中更加牢固可靠；
(2)本发明在水相中反应，水凝胶的水相反应能够实现三维结构内外表面的均匀修饰，对三维支架结构复杂程度没有限制；
(3)本发明中由于水凝胶(生物活性层)的灵活可控性，通过对交联剂的种类、用量及时间的调控，甚至可以对生物活性分子的空间及数量进行精准调控，可以实现精确定位和图案化设计；
(4)本发明的反应条件温和、高效，且点击化学种类繁多，适用范围广，灵活性强。
附图说明
图1为实施例1中含炔基的聚氨酯三维支架材料的拉曼(Raman)图谱；
图2为实施例1中表面键合有壳聚糖凝胶层的聚氨酯三维支架的拉曼(Raman)谱图；
图3为实施例2中含有炔基的聚氨酯三维支架的水接触角光学图；上图和下图为支架上不同位置测量的接触角光学图；
图4为实施例2中表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架的水接触角光学图；上图和下图为支架上不同位置测量的接触角光学图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。各实施例中所述修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的含量满足：1mol修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基≥2mol。
实施例1
(1)将含炔基的聚氨酯(Mn＝35000)进行三维打印(T＝205℃P＝3.5bar)，平均孔径尺寸为1200μm，质量0.5g(炔基含量0.68-1.02mmol/g PTMG，数据由核磁峰面积比得来，0.5g含炔基的聚氨酯含有0.5mmol炔基)，得到含有炔基的聚氨酯三维支架；
(2)将0.5g聚氨酯三维支架(1eq)(含有0.5mmol炔基)、0.5g修饰有叠氮基的壳聚糖(2eq)(0.5g修饰叠氮基的壳聚糖含有约1mmol的叠氮基)和0.63g含有炔基的PEG200(0.5eq)(炔基含量为0.4mmol/g，1g含有炔基的PEG200中炔基的含量为0.4mmol)加入到20ml水中，通氮气除氧30min，称取0.003g铜粉加入到反应体系中，氮气保护下50℃反应6h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜粉和未反应的小分子，真空干燥得到表面键合有壳聚糖凝胶层的聚氨酯三维支架；
(3)将步骤(2)中表面键合有壳聚糖凝胶层的聚氨酯三维支架、500mg炔基修饰的RGDfk(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，500mg炔基修饰的RGDfk约含有0.5mmol炔基)(1eq)加入到20mL水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.4eq)和抗坏血酸钠0.01g(1eq)，在40℃下反应13h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的物质，真空干燥(干燥的温度为40℃)，获得表面具有RGDfk修饰的壳聚糖生物活性层的聚氨酯三维支架。
所述含炔基的聚氨酯的制备方法为：将PTMG2000在110℃下抽真空2h，然后降至室温；准确称量降至室温的PTMG2000(1eq)，在75℃下抽真空0.5h，然后加入20ml无水DMAc，搅拌均匀后加入HDI(2eq)和0.5％(wt％)二月桂酸二异丁锡催化剂，在氮气保护下75℃反应4h，得到聚氨酯预聚物；向聚氨酯预聚物中加入含炔基扩链剂DPPD(2,2-丙炔基-1,3-丙二醇)(1eq)，将温度升至80℃反应4h，继续升温至90℃熟化2h，最后加入过量乙醇在90℃下反应1h，将未反应的异氰酸酯反应完全；反应结束后用甲醇共沉淀产物，在60℃热风循环烘箱中烘干12h后转移到真空干燥箱中60℃干燥12h进一步除去溶剂，得到含炔基的聚氨酯。
所述修饰有叠氮基的壳聚糖的制备方法：将1g壳聚糖溶解在50ml乙酸溶液(2wt.％)中，调节PH值到5-7，加入1g2-溴-2甲基丙酸和2.3gEDC，室温搅拌24h，透析并冷冻干燥，得到反应产物；然后将反应产物溶于乙酸溶液(2wt.％)中，调节PH值为中性后加入0.6gNaN3，室温反应24h，透析，冷冻干燥3天，得到修饰有叠氮的壳聚糖。
所述含有炔基的PEG200的制备方法为将PEG(1.5mmol)溶于25mlCH2Cl2中，然后依次加入4-戊炔酸(2.25mmol)和DMAP(1.5mmol)，室温下搅拌五分钟后，将DCC(2.25mmol)溶解在15mlCH2Cl2，并加入到反应液中，室温下搅拌过夜，过滤，浓缩，产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱；最后，将含有炔基的PEG浓缩溶液在***中沉淀并过滤，得到含有炔基的PEG200，Mn＝240；含有炔基的PEG200中炔基含量约0.4mmol/g。
本实施例的含有炔基的聚氨酯三维支架的拉曼谱图如图1所示，表面键合有壳聚糖凝胶层的聚氨酯三维支架的拉曼谱图如图2所示；图1为实施例1中含炔基的聚氨酯三维支架材料的拉曼(Raman)图谱；图2为实施例1中表面键合有壳聚糖凝胶层的聚氨酯三维支架的拉曼(Raman)谱图。从图1和2可以看出，1,2118cm-1处炔基峰基本消失，表明点击反应发生且效率很高，修饰有叠氮基的壳聚糖成功键合到含炔基的聚氨酯三维支架表面。
实施例2
(1)将含炔基的聚氨酯(Mn＝70000)进行三维打印(T＝205℃P＝3.5bar)，平均孔径尺寸为800μm，质量0.8g(炔基含量0.68-1.02mmol/g PCL，数据由核磁峰面积比得来)，得到含有炔基的聚氨酯三维支架；
(2)将0.8g聚氨酯三维支架(1eq)(0.8g聚氨酯三维支架含有0.8mmol炔基)、1.8g修饰有叠氮基的PEG2000(2eq)(1.8g修饰叠氮基的PEG2000含有1.6mmol的叠氮基)和0.4g含有炔基的PAA(0.5eq)(炔基的含量为0.4mmol)加入到10ml水中，通氮气除氧30min；称取0.002gCuBr/0.002gPMDETA(0.01eq/0.1eq)溶解在0.3ml无氧水中，将其水溶液加入到反应体系中，氮气保护下30℃反应10h，将聚氨酯三维支架从反应液中取出，甲醇/水(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架；
(3)将步骤(2)中得到的表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架、250mg炔基修饰的RGDS(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，250mg炔基修饰的RGDS约含有0.6mmol炔基)(0.8eq)加入到15mL水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.5eq)和抗坏血酸钠0.01g(1eq)，在50℃下反应6h，将聚氨酯三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的物质，真空干燥，获得具有RGDS修饰的PEG生物活性层的聚氨酯三维支架。
所述含炔基的聚氨酯的制备方法：将PCL2000在110℃下抽真空2h，然后降至室温；准确称量PCL2000(1eq)，在75℃下抽真空0.5h，然后加入20ml无水DMAc，搅拌均匀后加入MDI(2eq)和0.5％(wt％)二月桂酸二异丁锡催化剂，在氮气保护下75℃反应4h，得到聚氨酯预聚物；向聚氨酯预聚物中加入含炔基扩链剂DPPD(2,2-丙炔基-1,3-丙二醇)(1eq)，将温度升至80℃反应4h，继续升温至90℃熟化2h，最后加入过量乙醇在90℃下反应1h，将未反应的异氰酸酯反应完全；反应结束后用甲醇共沉淀产物，在60℃热风循环烘箱中烘干12h后转移到真空干燥箱中60℃干燥12h进一步除去溶剂，得到含炔基的聚氨酯。
所述修饰有叠氮基的PEG2000的制备方法为将PEG(2mmol-OH)在甲苯中共沸蒸馏并溶解在15mlTHF中；10min内逐滴滴加溶解在10mlTHF中的4-甲苯磺酰氯(20mmol)，室温反应24h；然后加入饱和NaHCO3水溶液，再搅拌4h，用50mlDCM萃取三次，合并有机相，将合并的有机相用***沉淀，得到PEG-OTs；之后再与溶解在10mlDMF的NaN3(23mmol)混合，30℃下搅拌24h，加入100ml的DCM，然后用盐水洗涤3次，冷却并从冷的二***中沉淀，得到修饰有叠氮基的PEG2000，叠氮基的含量为0.9mmol/g。
所述含有炔基的PAA的制备方法为：将丙烯酸(0.932g)、丙烯酸-3-氯丙基酯(0.236g)和RAFT试剂(0.018g)(十二烷基-1-苯基乙基碳酸二硫代酸酯)以300：30：1的摩尔比混合，60℃恒温油浴加热3h，得到混合物；将混合物与炔丙基胺(0.1eq)在1-[3’-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳酰亚胺亚碘酸盐(0.15％eq)中搅拌过夜(12h)，透析7天，冷冻干燥，得到含有炔基的PAA。
本实施例中含有炔基的聚氨酯三维支架的水接触角光学图如图3所示；表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架的水接触角光学图如图4所示。图3为实施例2中含有炔基的聚氨酯三维支架的水接触角光学图；图4为实施例2中表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架的水接触角光学图。从图3和4可以看出，对比图3，接触角明显减小，说明修饰有叠氮基的PEG成功键合到含炔基的聚氨酯三维支架表面。
实施例3
(1)将含炔基的聚丙烯酸(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，炔基浓度1mmol/g)(Mn＝65800)进行静电纺丝(六氟异丙醇为溶剂，在纺丝液浓度为6％，电压为12kV，推注速度为1ml/h，极距为10cm)，平均孔径尺寸为400μm，质量1g(1g的含炔基的聚丙烯酸中炔基的摩尔量为1mmol)，得到聚丙烯酸三维支架；
(2)将1g的聚丙烯酸三维支架(1eq)、1.5g修饰有叠氮基的明胶(1.5g修饰叠氮基的明胶中叠氮基含量大于2mmol/g)(2eq)和1.26g炔基功能化的PEG300(叠氮基的含量为0.38mmol/g)(0.5eq)加入到30ml水中，通氮气除氧40min，加入五水硫酸铜0.008g(0.2eq)和抗坏血酸钠0.03(1eq)，氮气保护下10℃反应36h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到表面键合有明胶凝胶层的聚丙烯酸三维支架；
(3)将步骤(2)中得到的表面键合有明胶凝胶层的聚丙烯酸三维支架、250mg炔基修饰的RGDS(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，250mg炔基修饰的RGDS含有0.45mmol的炔基)(0.5eq)加入到20mL水中，通氮气除氧40min；将0.002gCuBr/0.002gPMDETA(0.01eq/0.1eq)溶解在0.3ml无氧水中，将其水溶液加入到反应体系中，氮气保护下40℃反应8h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥(干燥的温度为40℃)，获得具有RGDS修饰的明胶生物活性层的聚丙烯酸三维支架。
所述修饰有叠氮基的明胶的制备方法为：将1g明胶溶解在50ml水中，将PH值调节到5-7，加入1g2-溴-2甲基丙酸和2.3gEDC，溶液室温搅拌24h，透析并冷冻干燥，得到产物；然后将产物溶于水中，加入0.6gNaN3，室温反应24h，透析，冷冻干燥3天，得到叠氮化明胶。
所述含有炔基的PEG300的制备方法为将PEG(1.5mmol)溶于25mlCH2Cl2中，然后依次加入4-戊炔酸(2.5mmol)和DMAP(1.5mmol)，室温下搅拌五分钟后，将DCC(2.25mmol)溶解在15mlCH2Cl2，并加入到反应液中，室温下搅拌过夜，过滤，浓缩，产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱；最后，将含有炔基的PEG浓缩溶液在***中沉淀并过滤，得到含有炔基的PEG300；含有炔基的PEG300中炔基含量约0.38mmol/g。
实施例4
(1)将含炔基的PLA(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，炔基的含量为0.5mmol/g)(Mn＝54000)进行三维打印(T＝205℃P＝3.5bar)，平均孔径为1000μm，得到聚乳酸三维支架，质量为2g；
(2)将2g三维支架(1eq)(2g的含炔基的PLA中炔基的摩尔量为1mmol)、1g叠氮基的明胶(1g叠氮基的明胶中叠氮基含量大于2mmol/g)(2eq)、1.5g含有炔基的PEG200(炔基含量为0.4mmol/g)(0.6eq)和350mg修饰炔基的cRGDfk(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，350mg炔基功能化的cRGDfk含有0.7mmol的炔基)(1eq)加入到25ml水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.008g(0.2eq)和抗坏血酸钠0.03(1eq)，氮气保护下30℃反应12h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，获得具有cRGDfk修饰的明胶生物活性层的PLA三维支架。
所述修饰有叠氮基的明胶的制备方法为：将1g明胶溶解在50ml水中，将PH值调节到5-7，加入1g2-溴-2甲基丙酸和2.3gEDC，溶液室温搅拌24h，透析并冷冻干燥，得到产物；然后将产物溶于水中，加入0.6gNaN3，室温反应24h，透析，冷冻干燥3天，得到叠氮化明胶。
所述含有炔基的PEG200的制备方法为将PEG(Mn：1.5mmol)溶于25mlCH2Cl2中，然后依次加入4-戊炔酸(2.25mmol)和DMAP(1.5mmol)，室温下搅拌五分钟后，将DCC(2.25mmol)溶解在15mlCH2Cl2，并加入到反应液中，室温下搅拌过夜，过滤，浓缩，产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱；最后，将含有炔基的PEG浓缩溶液在***中沉淀并过滤，得到含有炔基的PEG200，Mn＝240；含有炔基的PEG200中炔基含量约0.4mmol/g。
实施例5
(1)将含炔基的聚氨酯(Mn＝50000)进行三维打印(T＝205℃P＝3.5bar)，平均孔径尺寸为500μm，质量1g(1g的含炔基的聚氨酯中炔基的摩尔量为1mmol)，得到聚氨酯三维支架；
(2)将1g三维支架(1eq)和0.9g修饰有叠氮基的PEG2000(叠氮基的含量为0.9mmol/g)(1eq)加入到10ml水中，通氮气除氧30min，称取0.002gCuBr/0.002gPMDETA(0.01eq/0.1eq)溶解在0.3ml无氧水中，将其水溶液加入到反应体系中，氮气保护下30℃反应24h，将三维支架从反应液中取出，甲醇/水(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到键合有PEG的聚氨酯三维支架；
(3)将步骤(2)中得到的键合有PEG的聚氨酯三维支架、0.9g修饰有叠氮基的PEG2000(1eq)、1.26g含有炔基的PEG300(端基为炔基，炔基的含量为0.38mmol/g)(0.5eq)加入到20mL水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.5eq)和抗坏血酸钠0.01(1eq)，在50℃下反应10min，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架；
(4)将步骤(3)中得到的表面键合有PEG凝胶层的聚氨酯三维支架、400mg炔基修饰的TGF-β1(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，400mg炔基功能化的TGF-β1含有0.8mmol的炔基)(0.8eq)加入到20mL水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.5eq)和抗坏血酸钠0.01(1eq)，在50℃下反应6h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，获得具有TGF-β1修饰的PEG生物活性层的聚氨酯三维支架。
所述含炔基的聚氨酯的制备方法：将PCL2000在110℃下抽真空2h，然后降至室温；准确称量PCL2000(1eq)，在75℃下抽真空0.5h，然后加入20ml无水DMAc，搅拌均匀后加入MDI(2eq)和0.5％(wt％)二月桂酸二异丁锡催化剂，在氮气保护下75℃反应4h，得到聚氨酯预聚物；向聚氨酯预聚物中加入含炔基扩链剂DPPD(2,2-丙炔基-1,3-丙二醇)(1eq)，将温度升至80℃反应4h，继续升温至90℃熟化2h，最后加入过量乙醇在90℃下反应1h，将未反应的异氰酸酯反应完全；反应结束后用甲醇共沉淀产物，在60℃热风循环烘箱中烘干12h后转移到真空干燥箱中60℃干燥12h进一步除去溶剂，得到含炔基的聚氨酯。
所述修饰有叠氮基的PEG2000的制备方法为将PEG(2mmol-OH)在甲苯中共沸蒸馏并溶解在15mlTHF中；10min内逐滴滴加溶解在10mlTHF中的4-甲苯磺酰氯(20mmol)，室温反应24h；然后加入饱和NaHCO3水溶液，再搅拌4h，用50mlDCM萃取三次，合并有机相，将合并的有机相用***沉淀，得到PEG-OTs；之后再与溶解在10mlDMF的NaN3(23mmol)混合，30℃下搅拌24h，加入100ml的DCM，然后用盐水洗涤3次，冷却并从冷的二***中沉淀，得到修饰有叠氮基的PEG2000，叠氮基的含量为0.9mmol/g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，所有原料以及配方均可在可进行点击反应和合成水凝胶的理论基础指导下作出调整，涉及点击反应类型，包括环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学、碳碳多键的加成反应等等；点击顺序；点击方向；催化类型，包括亚铜催化、无铜催化；催化体系包括铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDET；水凝胶单体种类；三维支架材料种类、成型方法；活性分子种类；以及功能基团的修饰方法。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：包括以下步骤：
在惰性氛围中，以水为反应介质，以含有炔基的高分子材料支架、修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂与修饰有炔基的活性小分子为原料，在催化剂的作用下发生叠氮基与炔基的反应，使得高分子材料支架上修饰有生物活性层，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。
2.根据权利要求1所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：所述含有炔基的高分子材料支架是由含有炔基的高分子材料成型而成，所述含有炔基的高分子材料为修饰有炔基的聚乳酸、修饰有炔基的聚乙醇酸、修饰有炔基的聚丙烯酸、修饰有炔基的聚己内酯或修饰有炔基的聚氨酯中的一种以上，含有炔基的高分子材料的数均分子量30000-100000；
所述修饰有叠氮基的生物活性大分子为修饰有叠氮基的明胶、修饰有叠氮基的透明质酸、修饰有叠氮基的透明质酸钠、修饰有叠氮基的壳聚糖中一种以上；
所述含有炔基的交联剂为修饰有炔基的聚己内酯、修饰有炔基的聚丙烯酸中一种以上；
所述修饰有炔基的活性小分子为修饰有炔基的短肽或修饰有炔基的糖基药物中一种以上。
3.根据权利要求2所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：所述修饰有炔基的活性小分子为修饰有炔基的RGD、修饰有炔基的TGF-β1、修饰有炔基的七肽、修饰有炔基的RGDfk、修饰有炔基的cRGDfk、修饰有炔基的RGDS中一种以上。
4.根据权利要求1所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：所述催化剂独立为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；
所述含有炔基的高分子材料中炔基：修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基：含有炔基的交联剂中炔基的摩尔比为1：(1.5～5)：(0.4～1)且这几种物质中叠氮基的摩尔量大于炔基的总摩尔量；
所述修饰有炔基的活性小分子中炔基与修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的摩尔比为(0.1～1.5)：1。
5.根据权利要求1所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：具体步骤为：
(1-1)在惰性氛围和水中，将修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂与含有炔基的高分子材料支架通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架；所述含有炔基的交联剂为双官能度或多官能度的端基为炔基的交联剂；
(1-2)在惰性氛围和水中，将修饰有炔基的活性小分子和表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架在催化剂的作用下进行反应，洗涤，干燥，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。
6.根据权利要求5所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：步骤(1-1)和(1-2)中所述催化剂各自独立为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；
步骤(1-1)和(1-2)中所述反应的条件各自独立为10～80℃反应2～48h；所述干燥的条件各自独立为40～70℃干燥12～24h。
7.根据权利要求1所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：具体步骤为：
(2-1)在惰性氛围下，将修饰有叠氮基的生物活性大分子、含有炔基的交联剂、含有炔基的高分子材料支架与修饰有炔基的活性小分子共同在水中通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面共价键合生物活性层的三维支架；所述含有炔基的交联剂为双官能度或多官能度的端基为炔基的交联剂。
8.根据权利要求7所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：步骤(2-1)中所述催化剂为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；
步骤(2-1)中所述反应的条件为10～80℃反应2～48h；所述干燥的条件为40～70℃干燥12～24h。
9.根据权利要求1所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：具体步骤为：
(3-1)在惰性氛围和水中，将修饰有叠氮基的生物活性大分子与含有炔基的高分子材料支架通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架；此步骤中修饰有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的含量小于含有炔基的高分子材料支架中炔基的含量；
(3-2)在惰性氛围和水中，将表面键合有生物活性大分子的高分子材料支架、修饰有叠氮基的生物活性大分子与含有炔基的交联剂通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到表面改性的高分子材料支架；所述含有炔基的交联剂为双官能度或多官能度的端基为炔基的交联剂；
(3-3)在惰性氛围和水中，将修饰有炔基的活性小分子和表面改性的高分子材料支架在催化剂的作用下进行反应，洗涤，干燥，得到表面共价键合生物活性层的三维支架。
10.根据权利要求9所述在三维支架表面共价键合生物活性层的方法，其特征在于：步骤(3-1)～(3-3)中所述催化剂各自独立为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；
步骤(3-1)～(3-3)中所述反应各自独立为10～80℃反应2～48h；所述干燥的条件各自独立为40～70℃干燥12～24h。
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