CN107898732A - 一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品 - Google Patents

一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品。本发明提供的组合物包括水解贝壳硬蛋白、百合提取物、竹荪提取物、灵芝提取物和姜根提取物。本发明选用百合提取物、竹荪提取物、灵芝提取物和姜根提取物四种中药提取物与水解贝壳硬蛋白进行复配，各组分合理组方、协同配合，所得组合物能够有效地保护皮肤免于UVB照射引起的损伤具有显著地美白、淡斑功效。

Description

一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品
技术领域
本发明涉及化妆品领域，特别涉及一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品。
背景技术
近年来随着环境污染、生活节奏加快、夜生活丰富等，越来越多的人长期处于亚健康状态，从而导致皮肤黯沉、色斑增多、衰老加快等现象日益加重。爱美之心人皆有之，光滑美白的肌肤是人人追求的目标，特别是女性朋友，随着物质生活水平的提高，人们逐步追求生活品质，追求天然的物质。
目前，市场上的护肤品主要以各种天然植物提取物作为有效成分。其中，美白淡斑护肤品虽种类繁多，但效果参差不齐，大都对黑色素的去除效果不显著，美白淡斑效果并不理想。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品，该组合物能够有效地抑制黑色素的形成，具有显著地美白、淡斑功效。
本发明公开了一种具有美白、淡斑功效的组合物，以重量份计，包括：
作为优选，以重量份计，所述组合物包括：
在本发明提供的一些具体实施例中，所述组合物包括：
水解贝壳硬蛋白0.01份、百合提取物3份、竹荪提取物5份、灵芝提取物3份、姜根提取物1.5份。
在本发明提供的一些具体实施例中，所述组合物包括：
水解贝壳硬蛋白0.05份、百合提取物3份、竹荪提取物3份、灵芝提取物5份、姜根提取物2份。
在本发明提供的一些具体实施例中，所述组合物包括：
水解贝壳硬蛋白0.1份、百合提取物0.5份、竹荪提取物1份、灵芝提取物1份，姜根提取物0.2份。
作为优选，所述水解贝壳硬蛋白制备方法为：
步骤1:取珍珠粉碎，加水搅拌得到珍珠浆，加入乳酸，于95～100℃反应1.5h～3h，过滤，分别收集滤液和滤渣；
步骤2：取滤渣加水，调节pH值至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，39～41℃酶解反应2.5～4h，过滤，收集滤液；
步骤3：合并步骤1和步骤2的滤液，混匀，离心、冻干，得到水解贝壳硬蛋白。
其中，步骤2中，优选将pH值至7.0，所述酶解反应的次数优选为2次，酶解反应的温度优选为40℃，酶解时间优选为3h。
作为优选，在本发明所述组合物中，所述百合提取物的制备方法为：以百合花瓣为外植体，经诱导培养得到百合愈伤组织，依次经传代培养、摇瓶培养，清洗后分散于甘油中，获得百合提取物。其中，百合花瓣优选采用百合的花瓣，优选采用N6培养基诱导培养得到百合愈伤组织。
在本发明提供的一些具体实施例中，所述百合提取物的制备方法为：
切取灭菌后的百合花瓣，作为外植体，将外植体置于N6固体培养基中诱导培养，得到百合愈伤组织；从愈伤组织中选取形体较好的细胞团传代培养，从而获得疏松颗粒状的细胞团；经过滤，筛选出单个细胞或小数目的细胞团作为活性细胞，移至装有培养液的摇瓶中进行摇瓶培养，得到游离的细胞。然后将游离细胞放到纱布上，用清水冲洗，去除培养液中的杂质，最后分散于甘油中，得到百合提取物。
在本发明中所述组合物中，所述竹荪提取物和灵芝提取物为水提物，为本领域技术人员公知的，可以通过商业途径购买得到或通过现有技术中公开的方法水提得到，其规格符合国家或行业标准即可。
作为优选，所述竹荪提取物、灵芝提取物分别由竹荪、灵芝经水提得到。更优选地，所述竹荪提取物、灵芝提取物分别由竹荪、灵芝、姜根以20～30倍量的水提取2次，每次1h～5h，过滤、浓缩得到。
在本发明提供的一些具体实施例中，所述竹荪提取物的制备方法为：
取竹荪，以20～30倍量的水提取2次，第一次2h，第二次1h，合并两次提取液，过滤、浓缩至恒重，得竹荪提取物。
所述灵芝提取物的制备方法为：
取灵芝，以20～30倍量的水提取2次，第一次5h，第二次1h，合并两次提取液，过滤、浓缩至恒重，得灵芝提取物。
在本发明中所述组合物中，所述姜根提取物为醇提物，为本领域技术人员公知的，可以通过商业途径购买得到或通过现有技术中公开的方法提取得到，其规格符合国家或行业标准即可。
作为优选，所述姜根提取物由生姜根95％乙醇超声振荡提取得到。
在本发明提供的一些具体实施例中，所述姜根提取物的制备方法具体为：
取生姜根，35～42℃热处理1h，粉碎，95％乙醇超声振荡提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，滤液浓缩至质量浓度为18mg/ml～30mg/ml，得姜根提取物。
其中，热处理的温度优选为40℃，优选将滤液浓缩至质量浓度为20mg/ml。
本发明还提供了上述组合物在制备具有美白、淡斑功效的化妆品中的应用。
本发明还提供了一种具有美白、淡斑功效的护肤品，由上述组合物及化妆品上可接受的辅料制成。
本发明的具有美白、淡斑功效的组合物，以重量份计，包括：水解贝壳硬蛋白0.01～1份；百合花提取物0.01～3份；竹荪提取物0.01～5份；灵芝提取物0.01～5份；姜根提取物0.01～2份。本发明选用百合提取物、竹荪提取物、灵芝提取物和姜根提取物四种中药提取物与水解贝壳硬蛋白进行复配，各组分合理组方、协同配合，所得组合物能够显著降低LEF-1的表达量及酪氨酸酶的活性从而降低黑色素的合成；并提高Laminin332及胶原蛋白I的表达量以提高皮肤的屏障能力。保护皮肤免于UVB照射引起的损伤，并且能恢复自然衰老细胞中的蛋白酶体亚基活性，延缓衰老，具有显著地美白、淡斑功效。
具体实施方式
本发明公开了一种具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有美白、淡斑功效的组合物及其应用、护肤品进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例中采用的3D皮肤模型均购自法国Lab Skin Creations；蛋白酶体测试试剂盒(购自Sigma公司)。
实施例1组合物的制备
(1)取珍珠洗净、烘干、粉碎过100目筛，称取200g珍珠粉，加入少量去离子水，在水浴上搅拌成珍珠浆，待温度升高到90℃时，加入430ml乳酸，煮沸，95～100℃反应2h，不断搅拌，反应结束后，过滤，滤液单独存放，滤渣加适量去离子水，用Ca(OH)2调节pH值至7.0，加入0.2g中性蛋白酶，在40℃下反应3h；然后加入0.2g中性蛋白酶，在40℃下反应3h，反应结束后，过滤，合并前后两次滤液，混匀，超速离心机超离后，冻干，即得水解贝壳硬蛋白。
(2)取百合，消毒灭菌，切取灭菌后的百合花瓣，作为外植体，将外植体置于N6固体培养基中诱导培养，得到百合愈伤组织；从愈伤组织中选取形体较好的细胞团传代培养，获得疏松颗粒状的细胞团；经过滤，筛选出单个细胞或小数目的细胞团作为活性细胞，移至装有培养液的摇瓶中进行摇瓶培养，得到游离的细胞。然后将游离细胞放到纱布上，用清水冲洗，去除培养液中的杂质，最后分散于甘油中，得到百合提取物。
(3)取竹荪，以20倍量的水提取2次，第一次2h，第二次1h，合并两次提取液，过滤、浓缩至恒重，得竹荪提取物。
(4)取灵芝，以30倍量的水提取2次，第一次5h，第二次1h，合并两次提取液，过滤、浓缩至恒重，得灵芝提取物。
(5)取生姜根，40℃热处理1h，粉碎，称取粉碎后的样品2g，加入500ml95％乙醇，常温下超声振荡提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，滤液在旋转蒸发器浓缩至40℃质量浓度为20mg/ml，得姜根提取物。
取上述水解贝壳硬蛋白0.01份、百合提取物3份、竹荪提取物5份、灵芝提取物3份、姜根提取物1.5份混合，得到具有美白、淡斑功效的组合物。
实施例2组合物的制备
(1)取珍珠洗净、烘干、粉碎过100目筛，称取200g珍珠粉，加入少量去离子水，在水浴上搅拌成珍珠浆，待温度升高到90℃时，加入430ml乳酸，煮沸，95～100℃反应2.5h，不断搅拌，反应结束后，过滤，滤液单独存放，滤渣加适量去离子水，用Ca(OH)2调节pH值至7.0，加入0.2g中性蛋白酶，在39℃下反应4h；加入0.2g中性蛋白酶，在41℃下反应2h，反应结束后，过滤，合并前后两次滤液，混匀，超速离心机超离后，冻干，即得水解贝壳硬蛋白。
(2)取百合，消毒灭菌，然后切取灭菌后的百合花瓣为外植体，将外植体置于N6固体培养基中诱导培养，得到百合愈伤组织；从愈伤组织中选取形体较好的细胞团，把形态较好的细胞团传代培养，从而获得疏松颗粒状的细胞团；把游离的植物细胞过滤，筛选单个细胞或小数目的细胞团作为活性细胞，移至装有培养液的摇瓶中进行摇瓶培养，得到游离的细胞。然后将游离细胞放到纱布上，用清水冲洗，去除培养液中的杂质，最后分散于甘油中，得到百合提取物。
(3)取竹荪，以20倍量的水提取2次，第一次2h，第二次1h，合并两次提取液，过滤、浓缩至恒重，得竹荪提取物。
(4)取灵芝，以30倍量的水提取2次，第一次5h，第二次1h，合并两次提取液，过滤、浓缩至恒重，得灵芝提取物。
(5)取生姜根，40℃热处理1h，粉碎，称取粉碎后的样品2g，加入500ml95％乙醇，常温下超声振荡提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，滤液在旋转蒸发器浓缩至40℃质量浓度为20mg/ml，得姜根提取物。
取上述水解贝壳硬蛋白0.05份、百合提取物2份、竹荪提取物3份、灵芝提取物5份、姜根提取物2份混合，得到具有美白、淡斑功效的组合物。
实施例3组合物的制备
水解贝壳硬蛋白0.1份、百合提取物0.5份、竹荪提取物1份、灵芝提取物1份，姜根提取物0.2份，制备方法同实施例1，制备得到具有美白、淡斑功效的组合物。
实施例4组合物的制备
水解贝壳硬蛋白0.05份、百合提取物1份、竹荪提取物2份、灵芝提取物2份，姜根提取物1份，制备方法同实施例1，制备得到具有美白、淡斑功效的组合物。
实施例5组合物的制备
水解贝壳硬蛋白1份、百合提取物0.01份、竹荪提取物0.01份、灵芝提取物0.01份，姜根提取物0.01份，制备方法同实施例1，制备得到具有美白、淡斑功效的组合物。
实施例6本发明组合物的功效测试试验
对比例1～5组合物的配方见表1，制备方法同实施例1。其中，各项测试均采用3D皮肤模型。各组UVB辐射处理的剂量为100mJ/cm2，每日1次，连续1d。
表1实验分组
实验项目为：LEF-1表达(美白淡斑功效)、酪氨酸酶及表皮层黑色素(美白淡斑功效)、胶原蛋白I(抗衰老功效)、Laminin332(保湿功效)。
(一)皮肤屏障能力测试
TCF/LEF-1通路通过调控表皮分化及脂肪代谢来调节皮肤的屏障功能。本实施例采用3D皮肤模型对本发明组合物进行增强皮肤屏障能力测试。
按照表1分组进行处理，各处理组加入的组合物的有效成分用量为1％的相应组合物，然后利用免疫组织化学方法对LEF-1进行标记，LEF-1的表达情况如表2所示。
(二)酪氨酸酶活性测试
酪氨酸酶是黑色素代谢中的限速酶，为黑色素合成过程中最重要的酶。使用酶促动力学发测试酪氨酸酶的活性。按照表1分组进行处理，各处理组加入的组合物的有效成分用量为1％的相应组合物，测试方法如下：
细胞孵育完成后，清除培养基并使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗人黑素细胞后放入1％的Triton X-100(曲拉通X-100)溶液(Sigma,France)中，并孵育10分钟。在10nM处时在不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液加入L-多巴胺(Sigma,France)启动酶促反应。
在37℃的黑暗环境下孵育一小时后，通过使用分光光度计测量在475nm处的吸光度评估酪氨酸酶活性。
(三)皮肤保湿能力测试
Laminin332主要分布于透明层，跨膜半桥粒上的整合素α6β4是层粘连蛋白5的受体。其和Ⅶ型胶原蛋白结合构成锚丝，穿过透明层、致密下层直接***真皮的***层，固定真皮层；而且还与层粘连蛋白6或层粘连蛋白7形成共价复合物，在基底膜中该复合物(Laminin 5～6/7)经巢蛋白可直接与Ⅳ型胶原蛋白反应。因此层粘连蛋白332的存在是稳定表皮-真皮连接稳定性的主要因素。本实施例采用3D皮肤模型对本发明组合物进行增强皮肤屏障能力测试。
按照表1分组进行处理，各处理组加入的组合物的有效成分用量为1％的相应组合物然后利用免疫组织化学方法对Laminin332进行标记，观察处理后Laminin332的表达情况，结果如表2所示。
(四)胶原蛋白I的测试
通过检测胶原蛋白I的表达量来观察组合物抗衰老效果胶原蛋白I是皮肤细胞外基质的主要组成成分，也是皮肤衰老的标志。本实施例采用3D皮肤模型对本发明组合物进行测试。
按照表1分组进行处理，各处理组加入的组合物的有效成分用量相同(1％组合物有效成分)，然后利用免疫组织化学方法对胶原蛋白进行标记，胶原蛋白I的表达情况如表2所示。
表2LEF-1、Laminin332、胶原蛋白I的表达量及酪氨酸酶活性分析
结果显示，与UVB照射组相比，实施例1组合物+UVB照射组、实施例2组合物+UVB照射组、实施例3组合物+UVB照射组、实施例4组合物+UVB，实施例5+UVB照射组合物组每个表皮细胞长度单位LEF-1阳性细胞数(P<0.01)以及酪氨酸酶活性显著降低(P<0.001)；Laminin332及胶原蛋白I阳性细胞数(P<0.01)显著增加。
与对比例1～5组合物处理组相比，实施例1组合物处理后每个表皮细胞长度单位LEF-1阳性细胞数(P<0.01)以及酪氨酸酶活性显著降低(P<0.001)；Laminin332及胶原蛋白I阳性细胞数(P<0.01)显著增加。
以上结果表明，本发明实施例1～5组合物能够显著降低LEF-1、酪氨酸酶活性并提高Laminin332及胶原蛋白I的表达量，保护皮肤免于UVB照射引起的损伤，具有美白淡斑的功效。其中，实施例3的总添加量最少，但是达到与其他实施例类似的结果。因此被认为是最佳添加比例。
实施例7蛋白酶体活性检测
本实施例通过对蛋白酶体进行测试，验证本发明组合物的抗衰老淡斑功效。蛋白酶体是哺乳动物细胞内清除错误折叠蛋白的机制之一，而错误折叠蛋白的积累直接导致了细胞的衰老。
蛋白酶体的提取方法：
(1)从标准老化细胞(捐赠者年龄：62岁)中分离三种蛋白酶体亚基。在4℃的环境下将细胞提取物离心16小时(1000rcf)。将沉淀物溶解在Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中，然后注入已预先用缓冲液(Tris-HCl 25mM,pH 7.5)平衡好的溴化氢琼脂糖(CNBrSepharose柱)(含有能直接纯化蛋白酶体亚基的单克隆抗体)中。接着使用同样的缓冲液冲洗该柱，再使用含有2M氯化钠(NaCl)(pH 8)的Tris-HCl溶液洗脱蛋白酶体，然后在4℃的温度下透析16小时(或者注入凝胶过滤柱(PD10 Sephadex))。
(2)用变性上样缓冲液(SDS 0.1％)混合提纯的蛋白酶体样，然后在100℃的温度下孵育5分钟。然后蛋白质会因为丙烯酰胺凝胶(12％)与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)而分离。室温下蛋白质的迁移会经过30分钟80V稳压，与2小时120V稳压内完成。
(3)将最终体积为200μl含有50μg蛋白粗匀浆或3μg提纯蛋白酶体(在Tris-HCl25mM pH 7.5)的混合物与下层在37℃的温度下孵育30分钟。使用100μl酸或者乙醇停止反应。加入2ml蒸馏水后，使用酶标仪测量MCA的荧光，激发光和发射光波长设定为350/440nm。
实验设置底物组、实验组1～5：蛋白酶体+实施例1组合物组、蛋白酶体+实施例2组合物组、蛋白酶体+实施例3组合物、蛋白酶体+实施例4组合物组、蛋白酶体+实施例5组合物组。实验组1～5分别加入的有效成分含量为质量分数为1％的相应组合物。
测试方法：按照测试浓度直接加入细胞培养基中培养24h后，按上述方法提取蛋白酶体，使用酶标仪检测MCA荧光。其中，蛋白酶体活性定义为：总活性及加入20μM蛋白酶体抑制剂后剩余活性的差异。结果见表3所示。
表3蛋白酶体活性检测
注：*表示与底物组相比p＜0.05。
结果显示，本发明实施例1～5组合物处理过的细胞，能恢复自然衰老细胞(捐赠者年龄：62岁)中的蛋白酶体亚基活性，与底物组相比，具有显著性差异(p＜0.05)。其中，实施例3的总添加量最少，但是达到与其他实施例类似的结果。因此被认为是最佳添加比例。对比例1～5与底物组相比，无显著差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有美白、淡斑功效的组合物，其特征在于，以重量份计，包括：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以重量份计，包括：
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括：
4.根据权利要求1～3任意一项所述的组合物，其特征在于，所述水解贝壳硬蛋白的制备方法为：
步骤1:取珍珠粉碎，加水搅拌得到珍珠浆，加入乳酸，于95～100℃反应1.5h～3h，过滤，分别收集滤液和滤渣；
步骤2：取滤渣加水，调节pH值至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，39～41℃酶解反应2.5～4h，过滤，收集滤液；
步骤3：合并步骤1和步骤2的滤液，混匀，离心、冻干，得到水解贝壳硬蛋白。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的组合物，其特征在于，所述百合提取物的制备方法为：
以百合花瓣为外植体，经诱导培养得到百合愈伤组织，依次经传代培养、摇瓶培养，清洗后分散于甘油中，获得百合提取物。
6.根据权利要求1～3任意一项所述的组合物，其特征在于，所述竹荪提取物、灵芝提取物分别由竹荪、灵芝经水提得到。
7.根据权利要求1～3任意一项所述的组合物，其特征在于，所述姜根提取物由生姜根经95％乙醇提取得到。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述提取为超声振荡提取。
9.如权利要求1～8任意一项所述的组合物在制备具有美白、淡斑功效的化妆品中的应用。
10.一种具有美白、淡斑功效的护肤品，其特征在于，由权利要求1～8任一项所述的组合物及化妆品上可接受的辅料制成。
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