CN107881172B - 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种逆境诱导型启动子序列，包含SEQ ID NO:1的1388bp的DNA核苷酸序列，属于植物基因工程技术领域。本发明还提供了一种逆境诱导型启动子植物表达载体及使植物在低温、干旱和盐诱导下表达目标基因的方法，可将目标基因替换GUS基因***到含有本发明启动子的植物表达载体中，将该重组载体导入目标植物；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为PCR引物，分别包含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，所述引物适用于扩增含SEQ ID NO:1的DNA序列；本发明可用于启动冷、干旱和盐胁迫下外源基因的高效表达，适用于植物遗传育种改良研究。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子表达载体及诱导目标基因表达方法。
背景技术
低温冷害、干旱和土壤盐渍化是限制农业生产、威胁粮食安全的重要灾害，尤其是春秋季节的寒潮和作物生长关键期的干旱能够导致农作物的大面积受损，造成严重的减产。因此，除了加强对低温、干旱和盐害的防御技术研究之外，通过植物基因工程技术手段，使抗逆基因在作物中进行表达，以提高作物对逆境胁迫的抗性，减少低温、干旱和高盐对作物造成的严重伤害，已成为农作物育种的一个重要手段。
目前植物中的基因表达调控主要包含DNA水平调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控以及翻译后水平调控。启动子是位于转录起始位点前的一段DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使其与模板DNA准确结合，从而起始相关基因转录，并且启动子上有许多顺式作用元件，通过与反式作用因子相互作用，可以调控下游靶基因的表达，是转录水平调控中的关键步骤。
研究发现植物启动子主要有组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。其中组成型启动子在植物的整个发育阶段均能稳定启动基因表达，不受外界环境诱导而发生剧烈变化；组织特异型启动子能够在特定的时期、特定的组织中启动基因的表达；诱导型启动子则能够根据不同的环境胁迫或激素刺激等诱导基因的表达，进而增强植物对不利环境条件的防御能力，保护植株的正常生理代谢和生长发育。目前在植物转基因研究中最常使用的是组成型启动子，常见的有花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子、水稻肌动蛋白Actin启动子和玉米泛素Ubiquitin启动子，其中CaMV 35S启动子主要应用于双子叶植物的转基因研究中，Actin和Ubiquitin启动子多用于单子叶植物中，尤其是在水稻和玉米转基因研究中Ubiquitin启动子被广泛用于驱动外源基因表达。虽然组成型启动子在启动外源基因表达时具有稳定、高效和广谱等优点，但是由于在植物整个生长发育过程中高效、持续表达目标基因，容易造成蛋白的过量表达，不仅造成了能量上的浪费，同时也容易影响植物自身的生理平衡，进而可能影响到产量。因此，越来越多的研究者将研究重点转向了在特定条件下诱导表达的诱导型启动子和在特定部位、特定时期表达的组织特异型启动子，以缓解由异源蛋白的过量表达而对植物生长造成的伤害。
目前已有许多关于植物组织特异型启动子的研究报道：例如在叶片中特异表达的拟南芥atslA基因和玉米C4PdK基因启动子；在果实中特异表达的E4、E8、ACC合酶基因启动子；在维管束中特异表达的菜豆PAL、GRP118基因启动子；在根中特异表达的拟南芥Pyk10基因启动子等。关于诱导型启动子的研究报道主要包含非生物逆境胁迫诱导型、生物胁迫诱导型、光诱导型和激素诱导型等。这种诱导型启动子在正常条件下不表达或者表达量很低，当相应诱导条件出现时开始大量表达相关蛋白，从而减少不良环境对植物造成的伤害。研究表明有些诱导型启动子可以同时受多种因素诱导，被称为多元诱导型启动子，例如：拟南芥Cor15a基因启动子具有低温和干旱诱导特性；拟南芥rd29A启动子具有低温、干旱和高盐诱导活性；水稻质膜CaATPase启动子具有干旱、冷、MeJA和ABA诱导特性。
利用诱导性启动子在特定条件下驱动抗逆基因的高效表达，增强植物对不良环境条件的抗性，近年来逐渐成为了研究的热点。然而能够广泛应用于转基因研究的诱导型启动子目前仍然比较少，特别是多元诱导型启动子。
发明内容
本发明要解决的技术问题（一）是：提出一种能够在低温、干旱和盐胁迫下诱导外源基因表达的逆境诱导型启动子序列。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种逆境诱导型启动子，所述逆境诱导型启动子包含SEQ ID NO:1的1388bp的DNA核苷酸序列。
进一步的，所述逆境诱导型启动子的序列来自二穗短柄草AP2/EREBP家族基因BdDREB-47。
本发明要解决的技术问题（二）是：提出一种能够应用于遗传转化的植物逆境诱导型启动子植物表达载体。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：所述植物表达载体包含上述的逆境诱导型启动子序列。
本发明要解决的技术问题（三）是：提出一种使植物在低温、干旱和盐胁迫下诱导表达目标基因的方法。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：先将目标基因***到含有上述启动子的植物重组载体中，再将该重组载体导入目标植物中，并在低温、干旱和盐胁迫条件下诱导目标基因在植物中进行表达。
本发明的有益效果是：
本发明提供的诱导型启动子属于多元诱导型启动子，能够在冷、干旱和盐胁迫条件下启动外源基因的表达。按照本发明提供的技术方案，将外源基因替换GUS基因***到本发明的逆境诱导型启动子植物表达载体中，能够通过人为的控制环境条件（温度、湿度和盐含量），控制外源基因的表达，避免了因持续表达目标基因造成的能量浪费和可能性伤害。另外，将抗逆基因作为外源基因，利用本发明提供的诱导型启动子，可以在冷、干旱、盐胁迫下高效启动抗逆基因表达，增强植物的抗性。
附图说明
图1是本发明中启动子PCR扩增电泳图，其中M为 DL2000 Marker，条带大小至上而下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1为本发明启动子pBdDREB-47。
图2是pCAMBIA1381-GUS载体和本发明启动子连接T载体后经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳图，其中M为DNA Marker Ⅲ，条带大小至上而下为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；1为pBdDREB-47-T质粒； 2为pCAMBIA1381-GUS质粒。
图3是启动子连接pCAMBIA1381-GUS植物表达载体后菌液PCR电泳图，其中M为DL2000 Marker；1-10为单克隆。
图4是启动子连接pCAMBIA1381-GUS植物表达载体后EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定电泳图，其中M为DNA Marker Ⅲ；1为pC1381-pBdDREB-47-GUS质粒。
图5是农杆菌菌液PCR检测电泳图，其中M为DL2000 Marker；1-3为农杆菌单克隆；4为阴性；5为pC1381-pBdDREB-47-GUS质粒。
图6是部分T0代转基因烟草阳性检测电泳图，其中M为DL2000 Marker；1-7为转基因烟草T0代单株；8为野生型烟草；9为pC1381-pBdDREB-47-GUS质粒。
图7是本发明启动子植物表达载体构建示意图。
图8是冷、干旱和盐胁迫处理前后转基因烟草GUS染色图。
具体实施方式
实施例一
本实施例是关于二穗短柄草BdDREB-47基因启动子的克隆。
1.1二穗短柄草基因组DNA的制备
利用CTAB法提取正常生长的二穗短柄草的叶片，通过超微量核酸蛋白测定仪Q5000检测所提取的DNA的浓度与质量，将DNA浓度稀释至100ng/μl备用。
1.2启动子的克隆
以上述提取的二穗短柄草DNA为模板，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3引物，进行PCR扩增得到SEQ ID NO:1序列。
PCR反应体系如下：
| 试剂 | 体积（μl） |
| ddH<sub>2</sub>O | 5.8 |
| 2×Prime Star GC Buffer | 10 |
| dNTP mix（2.5mM） | 2 |
| 上游引物（10μM） | 0.5 |
| 下游引物（10μM） | 0.5 |
| Takara Prime Star Taq 酶 | 0.2 |
| DNA模板 | 1 |
| 总体系 | 20 |
PCR反应程序：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃退火20s（每个循环退火温度增加0.5℃），72℃延伸90s，扩增20个循环；98℃变性30s，65℃退火20s，72℃延伸90s，扩增15个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
将以上PCR产物吸取10μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，具体结果见图1，其中Marker为DL2000，目标条带大小为1388bp。
将上述剩余PCR产物连接T载体，本发明使用的是Takara Prime Star Taq 高保真酶，扩增产物为平末端，T载体为pEASY-Blunt Cloning Vector（购置北京全式金生物技术有限公司），按照试剂盒说明书进行操作，连接体系为5μl（4μl PCR产物+1μl T载体）。
上述连接产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞Trans-T1（购置北京全式金生物技术有限公司），具体操作方法见试剂盒说明书。挑取单克隆进行菌落PCR检测，选取阳性克隆进行测序，测序结果显示扩增序列与SEQ ID NO:1完全吻合。
将测序正确的克隆进行扩繁，并用质粒小提试剂盒（购于天根生化科技有限公司）提取质粒，通过超微量核酸蛋白测定仪Q5000检测所提质粒浓度。
实施例二
本实施例是关于逆境诱导型启动子（pBdDREB-47）植物表达载体构建。
用EcoRⅠ和HindⅢ（购于NEB公司）双酶切重组质粒pBdDREB-47-T和载体pCAMBIA1381-GUS，酶切结果见图2，分别回收目的片段（1388bp）和pCAMBIA1381-GUS载体片段，并用T4 DNA 连接酶（购于NEB公司）连接，通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞Trans-T1中，挑取单克隆进行阳性检测后结果见图3，扩繁提取质粒，将阳性质粒进一步酶切鉴定（ EcoRⅠ和HindⅢ双酶切）结果见图4，并且经测序结果正确，表明植物重组表达载体pC1381-pBdDREB-47-GUS构建成功，可进一步通过热激法将pC1381-pBdDREB-47-GUS重组质粒转入农杆菌感受态细胞EHA105（购置于上海士锋生物科技有限公司），阳性检测，结果如图5所示，正确后可用于后续植物转基因。
构建含pBdDREB-47启动子的植物表达载体示意图如图7所示，其中35S Pro和pBdDREB-47为启动子，35S Ter和Nos Ter为终止子，选择标记为潮霉素抗性，GUS基因为报告基因，可通过GUS基因的表达情况来判断pBdDREB-47启动子的活性。
实施例三
本实施例是关于pC1381-pBdDREB-47-GUS重组质粒通过农杆菌介导法转化烟草。
3.1转基因受体材料的准备
野生型烟草的种子撒播于花盆中，放于25度培养室（12h光照/12h黑暗），同时覆盖保鲜膜保湿，待幼苗出土后逐步去掉保鲜膜。两周后进行移栽，待烟草长至2个月大时叶片可用于转基因实验。
3.2烟草叶片消毒与预培养
选取生长状况较好的烟草，将其嫩叶片用剪刀剪下，于超净工作台上先用75%乙醇浸泡消毒烟草叶片50s。再用2.5%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，期间不断晃动以便充分消毒，最后将烟草叶片用无菌水清洗5次。
将消毒好的烟草叶片放在无菌滤纸上充分吸干表面水分，用无菌刀片将烟草叶片切成约0.5×0.5 cm2的小块（注意避开叶脉），切好的叶片平铺于烟草共培养培养基（MS+6-BA（2 mg/L）+ NAA（0.2 mg/L）+ Agar（8 g/L）+蔗糖（30g/L）pH5.8）上， 25℃黑暗条件下预培养3 天。
3.3农杆菌菌液的准备
将含有pC1381-pBdDREB-47-GUS重组质粒的农杆菌菌液在含有50mg/L kan的LB固体平板上进行划线，28℃暗培养1天后，重悬于50ml MS液体培养基中，28℃摇床200r/min震荡培养30min，并立即进行下一步实验。
3.4农杆菌侵染
将预培养3天后的烟草叶片放于充分震荡的农杆菌菌液中，浸泡10分钟，期间不断晃动。侵染完成后将叶片放于无菌滤纸上，以便充分吸干叶片上残留的菌液，再将浸染后的叶片分散放于铺有无菌滤纸的共培养基上，25℃暗培养3天。
3.5烟草叶片的分化与生根
将暗培养3天后的烟草叶片转移到分化培养基（MS+ 6-BA（2 mg/L）+ NAA（0.2 mg/L）+Cb（500 mg/L）+ Kan （100 mg/L）+ Agar（8 g/L）+蔗糖（30 g/L）pH5.8）上，在25℃、12h光照/12h黑暗条件下培养，直至分化出芽。
当小芽长到2~3 cm时，将芽体切下，插到生根培养基（1/2MS+ Kan（100 mg/L）+Cef（250 mg/L）+ Agar（8 g/L）+蔗糖（30 g/L）pH5.8）上，在25℃、12h光照/12h黑暗条件下培养。一般两周后外植体可生根，待其根系生长较发达时移栽到花盆中，在温室中继续培养。提取转基因T0待烟草的基因组DNA，用GUS基因引物进行阳性检测，部分植株的检测结果见图6，SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:5 为GUS基因PCR检测引物。
实施例四
本实施例是关于逆境诱导型启动子的活性鉴定
本发明主要是通过对T1代转基因烟草幼苗进行冷（4℃）、干旱和盐（300mM NaCl）胁迫处理，再通过GUS染色来检测GUS报告基因的表达情况，鉴定本发明的启动子具有冷、干旱和盐诱导特性。
4.1实验材料的准备
分别取适量野生型和转基因烟草T0代的种子于2ml离心管中，加水浸泡1-2h，使种子全部沉于管底，洗涤2-3次以去除种子中的杂质。于超净台上将浸泡后种子转移至无菌2ml离心管中，加入无菌水洗涤两次，再用70%乙醇消毒50s，1%次氯酸钠溶液消毒8-10min，最后用无菌水洗涤3-5次（整个消毒及洗涤过程中不断晃动离心管）。将消毒后的T0代种子播种于含50mg/L潮霉素的MS培养基上，野生型烟草种子播种于MS培养基上，放于25℃、12h光照/12h黑暗的条件下生长，约5-7天后种子发芽，两周后将幼苗移栽至小钵中备用。
4.2冷、干旱和盐胁迫处理下启动子活性鉴定
将1个月大的野生型和转基因T1代烟草幼苗放入4℃人工气候箱中，分别剪取冷处理0h、12h和24h的叶片于10ml离心管中，加入适量非扩散型GUS染液（购于北京奥博来科技有限责任公司），GUS染液的量要充分浸没叶片，抽真空10min使GUS染液充分渗透叶片，37℃避光染色12h，无水乙醇脱色。干旱胁迫和盐胁迫处理分别是对1个月大的野生型和转基因T1代烟草幼苗进行控水干旱和每天浇300mM的NaCl溶液一次，在处理的0d和6d进行取样进行GUS染色。黑色部位为GUS基因的表达部位，黑色越深表达量越高。如图8所示，在冷处理前（0h）转基因烟草叶片中GUS基因表达量非常低（黑色很微弱），冷处理12h和24h后GUS基因表达量显著升高（叶片黑色加深），充分说明了在正常温度下本发明所述启动子基本上不启动GUS基因表达或者表达量很低，一旦遇到低温胁迫则迅速启动目标基因表达。同时干旱胁迫和盐胁迫处理，处理前GUS表达量很低，在处理6d后GUS表达量显著增加。因此本发明所提供的启动子具有高效的冷、干旱和盐诱导活性，可用于植物遗传育种改良研究中。
本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法
<160> 5
<170> PatentIn Version 2.1
<210> 1
<211> 1388
<212> DNA
<213> 二穗短柄草
<400> 1
tttgttgaac ttgactgtgg aagcaaaact ttgtatgtgc tgtaattgcc actatgctca 60
gcatgaatcc atgatagatg ttaggacttg catacggcac ggccgtccgc cggctagtct 120
tatgcattta ttcaaggagc tggcttcttg tgttgaagtg agttgccatg aaatgcgcgg 180
tcattagtta tttgcatgct tgcactaaga gacaaaatga ttaggttgtt gatatgcttt 240
gtaaataccc tttgtaaaac agtagtaatt tcaaaatgtt ttaaatctca aaccacgtgc 300
ctttaattac ctccggattg attcgacaag atcttcaaag ctaatgggta tgtttcgatt 360
ctttcttgcc ttaaaagttt cttcatcttt ctagatatac aaggctaaat tggagggaaa 420
tagggcccaa tgatcttcat atttcgttga tactgtatat tattggggtg agaaatgaga 480
attgctgacc ggatccgtct cgtcccttgg cttgcaagga cgagctcatg gccgcttcca 540
accacgcacg agctccttcg aggttggaag gatgcaaacg agctcctcgc aagcctggat 600
ctcacttggc ggcagcggag ggcacggagc cacgaaggag aaggacatgg ctgcggtgcg 660
cgccaccgcc gagcccgaag aaacggcgat gatatttcac cggcgagctt gccggcaacg 720
tgatgaccca cgtggacaga tacggtaaca gaaatagaaa cgtgagtgca atacatagag 780
tacgatttta cttgaacagg tggcagcagc tggttgggag atggggctcg gcaatacata 840
gagtacgatt ttactagagc cggcgatcgt tgccggtata caaaccattg aagcaaacgc 900
ggcaaaaaaa tatctaatcg ttgggcctcg tgggctagta gcagctagct agtggagccc 960
aatcccctct cttgggcaga ggaagctgcc cattcgttgg gcctccatga gctagcagct 1020
agctagtgga gcccaatccc ccccccgctc ttcggcagag gaagctgcct tttttttttc 1080
tttccttaac gctgcaacct cacgccgtca cgcgtcgttc actcgtttgc cagttgccac 1140
cagcttatgc tggccaacgg gtacctggcg ttccggcagc gcgccacgtg tcaactcttc 1200
agcgcgtcac cgaaaactat aaaaagagct gccgcaaacc agactgactt actgaaccct 1260
ctccacaagc ccaatcctct catctcacac ttccgacaca ccagactgag ctactaatct 1320
gaaatccagc agcaagctcc agcagcagca ctgcagcagc cagcagcaag caagctacta 1380
gcgagcaa 1388
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggaattctt tgttgaactt gactgtggaa 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccaagcttt tgctcgctag tagcttgct 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaggcagtt ttaacgatca gttcgc 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagtgaagat ccctttcttg ttacc 25
Claims (3)
1.一种逆境诱导型启动子，其特征在于：所述逆境诱导型启动子是SEQ ID NO:1的1388bp的DNA核苷酸序列；
所述逆境诱导型启动子的序列来自二穗短柄草AP2/EREBP家族基因BdDREB-47。
2.一种逆境诱导型启动子植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体包含权利要求1所述的逆境诱导型启动子序列。
3.一种诱导目标基因表达方法，其特征在于：先将目标基因***到含有权利要求1所述启动子的植物重组载体中，再将该重组载体导入目标植物中，并在低温、干旱或盐胁迫条件下诱导目标基因在所述目标植物中进行表达，所述目标植物为烟草。
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