CN107858403B

CN107858403B - 一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法

Info

Publication number: CN107858403B
Application number: CN201711047656.9A
Authority: CN
Inventors: 翁瑞; 苏昕; 邱静; 喻长远; 钱永忠; 楼圣婷
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology; Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology; Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CN107858403A

Abstract

本发明公开了一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法。所述检测方法包括如下步骤：(1)配制含有目标物的标准溶液；(2)将辅助探针固定于玻片上，加入核酸适配体，辅助探针与核酸适配体杂交；(3)向玻片上加入标准溶液，目标物与核酸适配体结合使其从辅助探针上脱离；(4)向玻片上加入信号探针，信号探针与被释放的辅助探针发生短暂杂交；(5)将玻片置于全内反射荧光显微镜的载物台上进行检测，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，以其为纵坐标，以标准溶液中目标物浓度为横坐标制作标准曲线；(6)将待测样品重复步骤(3)‑(5)，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，根据标准曲线即得待测样品中目标物的浓度。

Description

一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法

技术领域

本发明涉及一种痕量目标物检测方法，具体涉及一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法，属于痕量目标物检测领域。

背景技术

痕量分析是指针对极低浓度目标物的分析方法。药物分析、疾病诊断、环境分析、食品安全分析、公共安全领域都有广泛的痕量分析需求。例如，在一些疾病的发病早期，在血液中会产生一些生物标志物，而这些标志物的浓度通常非常低。

痕量分析是当代分析化学的重要领域，可以用于痕量分析的技术已达百余种。针对小分子化合物和金属离子的痕量检测，较为传统的分析方法是色谱-质谱联用和原子光谱法。这类方法在可靠性、重复性上具有较大的优势，但是需要较长的样品前处理和分析时间且仪器成本较高。由于不同类型的化合物具有不同的光学性质和带电能力，一些化合物的灵敏度也不能满足痕量分析需求。生物传感法作为一种新兴的检测技术，近年来在临床诊断、环境分析、食品分析等领域都有诸多建树。单分子荧光传感是在单分子荧光显微镜上构建分子识别和信号产生基元。由于单分子荧光显微镜可以提供超高的时空分辨率，因此能够在单个分子水平探测和定量目标物，具有超高的灵敏度。单分子显微镜主要包括共聚焦显微镜和全内反射显微镜，后者具有较高的单分子通量，适用于开发检测体系。在全内反射的激发模式下，由于渐逝场的存在，只有靠近界面100nm以内的荧光分子被激发，从而形成单分子层，大大降低溶液荧光背景，但是荧光剂在界面的非特异性吸附经常给单分子检测带来了较强的荧光背景。而通过简单的对照实验扣除背景不但会使灵敏度和特异性降低，而且会影响重复性和可靠性。因此，在单分子荧光检测平台上匹配更为特异性的信号产生和分子识别***是提升单分子荧光传感在痕量分析领域的表现力的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法，所述检测方法能够检出农产品中的多种类型的痕量目标物。

本发明所提供的基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法，包括如下步骤：

(1)配制至少3种含有目标物的标准溶液；

(2)将辅助探针固定于玻片上，并加入核酸适配体，所述辅助探针与所述核酸适配体杂交；

(3)向所述玻片上加入所述标准溶液，所述目标物与所述核酸适配体结合使其从所述辅助探针上脱离；从而释放部分所述辅助探针，使其能够接受信号探针；

(4)向所述玻片上加入信号探针，所述信号探针与步骤(3)中被释放的所述辅助探针发生短暂杂交，从而产生特征性的荧光信号；

(5)将所述玻片置于全内反射荧光显微镜的载物台上进行检测，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，以所述标准溶液中所述目标物的浓度为横坐标，以荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数为纵坐标，制作标准曲线；

(6)将待测样品重复步骤(3)-(5)，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，根据所述标准曲线，即得到所述待测样品中所述目标物的浓度；

所述信号探针与所述辅助探针之间存在的部分互补序列少于所述辅助探针与所述核酸适配体之间存在的部分互补序列，以保证不存在所述目标物时，所述信号探针不会与所述辅助探针结合产生荧光信号。

上述的检测方法中，步骤(1)中，可根据需要配置多种所述标准溶液，如8种。

上述的检测方法中，所述信号探针与所述辅助探针之间互补的碱基个数为9～10个。

上述的检测方法中，所述核酸适配体与所述辅助探针之间互补的碱基数为13～15个。

上述的检测方法中，所述信号探针的5’端标记Cy3荧光基团。

上述的检测方法中，步骤(2)中，所述辅助探针与所述玻片之间通过生物素-亲和素的相互作用连接；

所述辅助探针上标记生物素；

所述玻片上修饰亲和素。

上述的检测方法中，步骤(2)中，所述杂交的条件如下：

温度为20～27℃，时间为10～30分钟；

所述辅助探针与所述核酸适配体之间为稳定杂交。

上述的检测方法中，步骤(3)中，所述目标物与所述核酸适配体结合的条件如下：

温度为20～27℃，反应时间为60～120min；

通过所述目标物与所述核酸适配体的结合，使所述核酸适配体从所述辅助探针上脱离，从而激活所述辅助探针与所述信号探针的结合部分。

上述的检测方法中，步骤(4)中，所述“短暂杂交”模式指的是双链核酸在其解链温度附近呈现杂交与解链的平衡。两条链处于杂交状态时，荧光标记链会进入全内反射荧光显微镜的激发范围；反之，当两条链解链时，荧光标记链会逃逸出全内反射荧光显微镜的激发范围，在全内反射显微镜上检测反应体系中的荧光值会产生变化。

上述的检测方法中，所述目标物可为烟碱类农药，如啶虫脒和多氯联苯；

所述待测样品可为鲜活农产品；

所述检测方法对于啶虫脒的检测限可以达到30fM(11.9pg/L)，对于多氯联苯(如PCB-77(3,3’,4,4’—四氯联苯))的检测限可以达到50fM(14.6pg/L)。

上述的检测方法中，步骤(5)中，所述检测的时间至少为10min。

上述的检测方法中，步骤(1)中，所述标准溶液中，所述目标物的浓度为0～5000fM。

本发明将DNA短暂杂交引入单分子荧光传感体系，通过合理的设计，使得目标物分子能够激活DNA短暂杂交事件，即激活指纹型信号标签。本发明检测方法能够在单分子水平直接指认目标物，可以大幅度提高单分子荧光传感的灵敏度和特异性。

本发明检测方法可以快速准确地对鲜活农产品中污染物分子进行检测，且对目标物具有高度的选择性和灵敏度。同时，本发明检测方法能够有效地排除背景干扰，可以适用于复杂多样的环境；并且相关配套试剂易于制备，操作简便，重复性高，易于推广到非专业人员操作。

附图说明

图1为本发明基于单分子荧光传感的目标污染物检测方法的示意图。

图2为本发明利用全内反射显微镜检测单分子荧光的示意图。

图3为有/无目标物存在时，单个短荧光DNA探针与修饰有动态核酸探针的基底表面相互作用产生的单分子荧光轨迹。

图4为有/无目标物存在时，输出的单分子荧光轨迹曲线，高-低荧光态变化次数统计图。

图5为本发明实施例1中鸡肉基质中的加标污染物分子浓度与被只认为核酸短暂杂交的单分子荧光点的线性关系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明检测方法为一种以核酸适配体作为识别基元和以核酸短暂杂交为信号基元的污染物分子检测方法，具体地，包括以下步骤：

A、显微镜玻片表面功能化

为了实现核酸探针的固定，首先要对显微镜表面进行修饰。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对玻片表面进行氨基化，进而加入具有琥珀酰亚胺戊酸酯标记的聚乙二醇(mPEG)、琥珀酰亚胺戊酸酯标记和生物素双标记的聚乙二醇(bio-PEG)与氨基反应，将聚乙二醇修饰在玻片表面，用来固定核酸探针；

B、根据目标物设计动态核酸探针和短荧光DNA探针

辅助探针和核酸适配体链为单链DNA序列，辅助探针一般为25～30个碱基，核酸适配体的长度取决于检测目标物。辅助探针能与适配体链上碱基序列部分互补；室温下，辅助探针与核酸适配体稳定杂交，形成“动态核酸探针”；其中辅助探针标记有生物素，其能通过生物素-亲和素(例如，链霉亲和素)相互作用偶联在标记有生物素的聚乙二醇修饰的显微镜玻片上；体系中存在目标物时，核酸适配体会与目标物结合，与辅助探针脱离，辅助探针的碱基全部暴露，从而激活了与短荧光DNA探针杂交的部分(图1)；

信号探针为一段5’端带有Cy3标记的核苷酸序列，与捕获探针形成短暂杂交；一般，信号探针与辅助探针互补的碱基个数为9～11个，少于辅助探针与适配体结合的碱基数，保证了在不存在目标物时，短荧光DNA探针不会与辅助探针结合产生信号；

C、将辅助探针与核酸适配体形成的双链核酸固定在修饰好的显微镜玻片上；

D、加入目标物，目标物会与辅助探针上的核酸适配体结合，并使它从辅助探针上脱离；从而释放辅助探针，使其能够接受信号探针；

E、再加入信号探针，信号探针会与被释放的辅助探针形成短暂杂交平衡。由于全内反射显微镜的激发角度，在玻片表面形成渐逝场，仅有靠近玻片表面100nm内的分子才能被激发。因此，当信号探针与辅助探针结合时，荧光增强；当信号探针与辅助探针解离时，荧光减弱。利用电子增强型CCD(EMCCD)可以记录大量单个分子荧光点(图2)，并且可以得到一段时间内每个单分子点的荧光变化曲线。

根据本发明，若荧光值呈现规律性的变化，则该点单分子为被认为是目标物(目标物以啶虫脒为例)释放出来的辅助探针(图3(A))，若未成现规律性变化，则被认为是短荧光DNA探针与表面的非特异性相互作用引起的荧光变化(图3(B))。将具有不同荧光态变化次数的分子进行统计，绘制直方图，若存在目标物，由于核酸短暂杂交被激活，则大部分分子具有多次荧光态变化(图4(A))，若不存在目标物，则大部分分子不具有多次荧光态变化(图4(B))。荧光态变化超过15次的分子被认为是核酸短暂杂交单分子荧光点，进而被确认为目标物。

根据本发明，被认定为信号探针与辅助探针短暂杂交的单分子荧光点(荧光态交换超过15次)的数量与被测目标物存在线性关系。

实施例1：运用单分子荧光传感检测啶虫脒和PCB-77

(1)显微镜片表面修饰

将一次性载玻片在1M的KOH溶液中超声20分钟，用水清洗。在14％的双氧水/氨水中煮沸20分钟以上，用水清洗，然后在甲醇中超声15分钟，用丙酮清洗。在空枪头盒底放入一定的去离子水，保持湿润环境。将上述吹干的玻片放在枪头盒的架子上。

配制0.1M的碳酸氢钠溶液，作为PEG缓冲液。用此缓冲液配制含有250mg/ml mPEG，25mg/ml biotin-PEG的溶液，立即滴在载玻片上，每片120μL，用另一片载玻片盖好，不要有气泡。在室温下反应3小时，用水清洗并且用氮气吹干，被修饰的表面朝上放在枪头盒的架子上。配制1M的碳酸氢钠溶液，作为DST缓冲液。配制28.6mg/ml的DST溶液，立即滴在载玻片上，每片120μL，用另一片载玻片盖好，不要有气泡。在室温下反应半小时。用水清洗载玻片和盖玻片并且用氮气吹干。将200μL的Eppendorf枪头顶部切下，放置在修饰好的盖玻片表面，然后用Epoxy胶小心涂在枪头与表面的接合处，使其固定。

(2)探针固定与目标物捕获

用移液枪吸取100μL的T₅₀缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl和1mM EDTA，pH＝8)，滴加在表面覆盖有生物素-PEG的玻片上，润洗玻片后吸去。

用移液枪吸取50μL的1mg/mL的亲和素(pH＝8)，滴加在润洗后的玻片上，孵育10min后吸去，并用50μL的1×PBS清洗玻片两次。

在包覆亲和素的玻片上，滴加100μL浓度为1pM生物素标记的捕获探针，孵育10min后吸去，并用50μL的1×PBS清洗玻片两次。

用移液枪吸取100μL浓度为5pM的核酸适配体链，滴加在偶联捕获探针的玻片上，孵育10min后吸去，并用100μL的1×PBS清洗玻片两次。

取5g切碎的新鲜有机鸡肉(不含目标物)，加入50mL含有1μM目标物的乙腈溶液，充分混匀5min。离心取上清，将其用2×PBS稀释成含有5pM、2pM、1pM、0.5pM、0.2pM、0.1pM、0.05pM和0.03pM目标物的溶液。

用移液枪分别吸取100μL上述含有各浓度的啶虫脒或PCB-77目标物的2×PBS溶液以及空白溶液，滴加在玻片上，25℃孵育60min后吸去，并用100μL的1×PBS清洗玻片两次。

(3)单分子荧光传感与数据分析

用移液枪吸取100μL含有1nM的信号探针、2.5mM 3,4-二羟基苯甲酸甲酯、25nM原儿茶多加氧酶，1mM水溶性维生素E(抗荧光染料光漂白)的4×PBS滴加在玻片上。

将玻片置于全内反射显微镜载物台上。

信号探针激发波长为520nm，发射波长为593nm，物镜为放大倍数100倍的TIRF物镜。

拍摄记录玻片上荧光闪烁点，曝光时间为500ms，记录10min。并用MATLAB、QuB软件分析筛选荧光点的个数，用于定量。

统计10min内荧光态变化次数大于15次的单分子数(如表1和表2中所示)，以肌肉基质中目标物的浓度为横坐标，以荧光态变化次数大于15次的单分子数(荧光点数)为纵坐标，制作标准曲线，如图5所示，可以看出，对于啶虫脒实验组，在5pM啶虫脒存在下，找到确认的核酸短暂杂交荧光点558个，对于PCB-77实验组，在5pM的PCB-77的存在下，找到确认的核酸短暂杂交荧光点364个。

表1不同浓度啶虫脒时的荧光态变化次数大于15次的单分子数

浓度(fM)	单分子数
		30	3
50	5
		100	9
200	25
		500	71
1000	123
		2000	230
5000	558

表2不同浓度PCB-77时的荧光态变化次数大于15次的单分子数

浓度(fM)	单分子数
		30	0
50	3
		100	8
200	17
		500	38
1000	66
		2000	170
5000	364

本实施例中所采用的核酸的序列如表3所示。

表3各核酸序列

Claims

1.一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法，包括如下步骤：

（1）配制至少3种含有目标物的标准溶液；

所述标准溶液中，所述目标物的浓度为0~5000 fM；

（2）将辅助探针固定于玻片上，并加入核酸适配体，所述辅助探针与所述核酸适配体杂交；

所述核酸适配体与所述辅助探针之间互补的碱基数为13~15个；

所述杂交的条件如下：

温度为20~27℃，时间为10~30分钟；

所述辅助探针与所述玻片之间通过生物素-亲和素的相互作用连接；

所述辅助探针上标记生物素；

所述玻片上修饰亲和素；

（3）向所述玻片上加入所述标准溶液，所述目标物与所述核酸适配体结合使其从所述辅助探针上脱离；

所述目标物与所述核酸适配体结合的条件如下：

温度为20~27℃，反应时间为60~120min；

（4）向所述玻片上加入信号探针，所述信号探针与步骤（3）中被释放的所述辅助探针发生短暂杂交；

所述信号探针与所述辅助探针之间互补的碱基个数为9~10个；

所述信号探针的5’端标记Cy3荧光基团；

（5）将所述玻片置于全内反射荧光显微镜的载物台上进行检测，记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，以所述标准溶液中所述目标物的浓度为横坐标，以荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数为纵坐标，制作标准曲线；

所述检测的时间至少为10min；

（6）将待测样品重复步骤（3）-（5），记录荧光态变化次数大于15次的单分子荧光点数，根据所述标准曲线，即得到所述待测样品中所述目标物的浓度；

所述信号探针与所述辅助探针之间存在的部分互补序列少于所述辅助探针与所述核酸适配体之间存在的部分互补序列；

所述待测样品为鲜活农产品；

所述目标物为啶虫脒时，所述辅助探针的序列为：5’-Biotin-TTTTTTTTTTTCTTCATAATATGGTG-3’，所述核酸适配体的序列为：5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’，所述信号探针的序列为：5’-Cy3-ATTATGAAGA-3’；

所述目标物为多氯联苯时，所述辅助探针的序列为：5’-Biotin-TTTTTTTTTTCTTCGTAGCCCCGCC-3’，所述核酸适配体的序列为：5’-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3’，所述号探针的序列为：5’-Cy3-GGGCTACGAA-3’。