CN107857819A - 多功能融合蛋白及其应用 - Google Patents

多功能融合蛋白及其应用 Download PDF

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CN107857819A CN201711016798.9A CN201711016798A CN107857819A CN 107857819 A CN107857819 A CN 107857819A CN 201711016798 A CN201711016798 A CN 201711016798A CN 107857819 A CN107857819 A CN 107857819A
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施炜星
杨春霞
陈瑛
唐涛
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Abstract

本发明涉及多功能融合蛋白及其应用，包含：a.识别CD47阳性肿瘤细胞的功能区：SIRPα的胞外部分，b.识别PD‑L1阳性肿瘤细胞的功能区：PD‑1的胞外部分，c.结合免疫细胞的功能区：高亲和力人IgG1Fc部分，本发明所述的融合蛋白能够满足患者肿瘤免疫治疗的需要，该重组融合蛋白既能识别CD47和PD‑L1阳性的肿瘤细胞，又能结合具有Fc受体的免疫效应细胞；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

Description

多功能融合蛋白及其应用
[技术领域]
本发明涉及融合蛋白技术领域，尤其涉及一种多功能融合蛋白及其在癌症治疗中的应用。
[背景技术]
癌症是常见且威胁人们生命和生活质量的最为严重疾病，当前针对癌症的临床应用药物存在着各种不足，例如化疗药物副作用大，靶向药物容易产生耐药性(Curr PharmDes.2010，16:3-10)，单独应用免疫检查点抑制剂临床疗效低(NEM 2012，366:2443-2454)，嵌合抗原受体T(Car-T)细胞疗法又有细胞因子风暴和复发率高的缺点(Curr OpinPediatr.2017，29:27-33)。因此，发现高效低毒新型治疗癌症的药物，减少死亡率，提高患者的生活质量，是我国乃至世界医疗卫生领域最为迫切的课题和需求。
肿瘤的发生是由于机体细胞***过程中发生基因突变，突变细胞的生长失去调节控制的结果。由于肿瘤细胞通过产生抑制免疫反应的因素来逃避免疫监控，所以即使肿瘤内部与肿瘤周围环境中内存在免疫细胞，肿瘤细胞分泌的抑制因素可以导致免疫细胞失活，不能杀伤与清除肿瘤细胞(J Immunol 2005；175:6169-6176)。阻断肿瘤免疫抑制因素，激活免疫细胞群体，让机体免疫***重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤(Trends Immunol.2015；36:265-276)，最终达到治愈癌症的目的。
CD47是一种多功能蛋白，与其配体共同作用可以产生一系列功能，例如细胞生长，迁移及防止自体免疫(Nat Med 2015；21:1122–3)，与表达在巨噬细胞和抗原递呈细胞表面信号调节蛋白(signal regulatory protein-α，SIRPα)结合可以诱导抑制信号，防止巨噬细胞对CD47阳性细胞的内吞(Trends Cell Biol 2001，11:130–135；Science 2000，288:2051–2054)。外周血中红细胞，血小板，淋巴细胞及干细胞广泛表达CD47，也是这些细胞逃避巨噬细胞吞噬的主要机制(J Exp Med 2001，193:855–862.；Leuk Lymphoma 2004，45:1319–1327；Cell 2009，138:271–285)。肿瘤产生免疫抑制的一种方式是通过CD47与其配体信号通路抑制机针对肿瘤的免疫反应。越来越多的证据表明，CD47在各种实体瘤细胞表面普遍高表达(PNAS 2012，109：6662–6667)，而高表达CD47的实体瘤可以逃避巨噬细胞识别和内吞，是肿瘤逃避免疫监控，进而生长和扩散的机理之一(Trends Immunol 2010，31:212–219)。同时，肿瘤细胞CD47的表达量与患者生存时间成明显负相关性(Trends CellBiol 2001，11:130–135)。现有证据证明，利用抗体阻断CD47与SIRP的相互作用可以增加巨噬细胞对肿瘤细胞的内吞，抑制肿瘤的扩散与转移(J Clin Invest 2016；126:2610–20；PLoS ONE 10(9):e0137345)。但是，由于抗体的亲和力较高，过度的免疫抑制作用会造成表达CD47的红细胞缺少，造成极度贫血现象(eLife 2017；6:e18173)。
肿瘤产生免疫抑制的另一种方式是通过PD-1与其配体信号通路抑制机体针对肿瘤的免疫反应。PD-1受体(CD279)一般在活化的T细胞或衰竭性T细胞表面表达，而其配体PD-L1(B7-H1；CD274)一般在肿瘤细胞表面表达，PD-L1阳性的肿瘤细胞能促进肿瘤表达干细胞信号，促使肿瘤更容易发生扩散与转移(Signal Transduction and TargetedTherapy 2016,1：16030)。此外，肿瘤细胞利用过度表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，传达抑制信号，降低T细胞杀伤性细胞因子的分泌，抑制T细胞的功能，创造肿瘤免疫抑制微环境，使T细胞失去杀伤靶细胞的功能，最终造成肿瘤细胞逃逸(Clin Cancer Res.2012，18:6580)。由于肿瘤侵润性免疫细胞高表达PD-1(Blood.2009，114:1537)，所以表达PD-L1的肿瘤细胞会更容易使肿瘤亲润性免疫细胞失去活性，丧失杀伤肿瘤细胞的功能(CurrOpin Immunol.2012，24:207)。肿瘤细胞高表达PD-L1在各种肿瘤中得到广泛验证，并且其表达量与患者临床生存期有明显的负相关性(PLoS One.2011，6:e17621)。抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻断衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过PD-1抗体Pembrolizumab和Nivolumab与PD-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经表现出前所未有的治疗癌症临床效果，尤其是在部分患者上获得了肿瘤完全消失(NEM 2012，366:2455-2465；NEM 2012，366:2443-2454)。但是，现阶段的单靠阻断信号通路的治疗普遍存在临床效果不理想(NATURE 2014，515:568-571)，而且这种T细胞的恢复持续时间短(Science 2016，354:1160-1165)，患者体内的特异性免疫细胞又会很快回到衰竭状态(Science 2016，354:1165-1169)，限制其临床的治疗效果。
针对抗原的体液反应是机体抵抗肿瘤的主要免疫反应之一，应用单克隆抗体治疗***已经有几十年的历史(Cell 2012；148:1081–4)，其控制肿瘤的作用机理也逐渐变的清晰(Cell 2012；148:1081–4)。其中包括直接结合靶细胞上的抗原，阻碍受体与细胞生长因子的结合，引起靶细胞的凋亡(Clin Oncol2009；27:1122–9)；通过抗体上的Fc与C1q结合，引起间接补体杀伤效应(complement-dependent cytotoxicity，CDC)；通过抗体Fc与NK细胞识别与结合，引起抗体依赖性靶细胞的杀伤(ADCC)(J Hematol Oncol 2013；6:1；Cancer Res 2011；71:5134),通过抗体与巨噬细胞的结合产生抗体依赖性吞噬效应(antibody-dependent cell phagocytosis，ADCP)。但是，ADCP效应受肿瘤细胞表达的CD47和PD-L1抑制(PNAS 2011；108:18342–7；Nature 2017，doi:10.1038/nature22396)。所以，单独依靠抗体的效应，只能达到有限的临床作用(PNAS 2011，108：18347)。
截止目前，临床上还没有一种能针对性阻断多种免疫抑制信号通路的蛋白药物，而针对单一通路的药物又存在疗效低的缺点。
[发明内容]
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种阻断免疫细胞抑制信号通路的融合蛋白，其既阻断CD47与SIRPα抑制性信号通路，又能阻断PD-1与PD-L1抑制性的信号通路，同时增加依赖抗体Fc信号产生的免疫细胞杀伤肿瘤靶细胞的功能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供、一种能识别肿瘤细胞和结合免疫细胞的多功能融合蛋白，包含：
a.识别CD47阳性肿瘤细胞的功能区：SIRPα的胞外部分，
b.识别PD-L1阳性肿瘤细胞的功能区：PD-1的胞外部分，
c.结合免疫细胞的功能区：高亲和力人IgG1Fc部分，
d.连接上述功能区的非功能性氨基酸片段，使各个功能区的蛋白折叠不存在相互干扰，能与肿瘤上CD47和PD-L1结合，同时又能与具有Fc受体的NK细胞和巨噬细胞结合。促进免疫细胞对肿瘤组织的杀伤和清除，发挥融合蛋白的多功能特征。
肿瘤细胞的表面受体包括PD-L1和CD47，具有共抑制性免疫功能的免疫检查点和传达免疫抑制信号的功能，此类受体基因在肿瘤细胞表面的过度表达，导致肿瘤细胞逃避免疫细胞的杀伤与清除。融合蛋白SIRPα片段部分阻断免疫细胞SIRPα与CD47的结合与信号传达，融合蛋白PD-1片段部分阻断免疫细胞PD-1与肿瘤表达的PD-L1结合而导致的免疫抑制，防止肿瘤组织或肿瘤微环境中检查点配体对免疫***产生抑制作用。融合蛋白所述识别肿瘤细胞功能区利用特异性配体识别肿瘤细胞的表面受体，
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
SIRPα的胞外部分为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的31-150位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
PD-1的胞外部分为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的26-147位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述高亲和力人IgG1Fc部分为SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中的1-227位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。融合蛋白中人类抗体IgG1Fc与免疫细胞表面Fc受体结合，同时将功能性免疫细胞携带到靶细胞附近，使杀伤细胞容易发生对靶细胞的杀伤效应，防止单靶点结合容易导致的脱靶效应。
所述非功能性氨基酸片段为SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
所述多功能融合蛋白的完整氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
SEQ ID NO：5的多功能融合蛋白根据如下步骤制备所述多功能融合蛋白：
步骤1)通过基因合成，将人SIRPα的胞外部分的片段和PD-1的胞外部分的片段和IgG1Fc相应氨基酸序列的碱基通过非功能氨基酸相应碱基连接，组成融合蛋白的构造基因；
步骤2)将所述的构造基因转入哺乳动物表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞；
步骤3)将所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，纯化后制得重组融合蛋白。
上述多功能融合蛋白可用于制备治疗表达CD47和PD-L1肿瘤而引起的疾病的药物。
上述融合蛋白可单独应用或与化疗、靶向药物、抗体药物、细胞治疗组成的联合应用，以用于制备治疗表达CD47和PD-L1肿瘤而引起的疾病的药物。所述疾病包括实体瘤与血液瘤癌症。所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌，白血病。
本发明所述的融合蛋白能够满足患者肿瘤免疫治疗的需要，该重组融合蛋白既能识别CD47和PD-L1阳性的肿瘤细胞，又能结合具有Fc受体的免疫效应细胞；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
依据本发明设计生产的融合蛋白，可以克服现有药物的缺点，能对多个免疫抑制信号通路产生阻断作用，提高抗体依赖性的免疫细胞对肿瘤的杀伤，从而可以提高免疫***针对肿瘤的抑制及清除，提高临床应用的疗效。
[附图说明]
图1为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白的凝胶电泳分析图。
图2为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白对结直肠癌患者腹水中肿瘤杀伤试验。
图3为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白促进巨噬细胞对肿瘤细胞体外吞噬试验。
图4为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白促进巨噬细胞对不同肿瘤细胞体外吞噬指数。
[具体实施方式]
本发明提供了一种多功能融合蛋白，包含两个靶向性识别肿瘤细胞的功能区和与免疫细胞Fc受体结合的功能区，功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，通过哺乳动物细胞表达的方式生产与纯化；本发明还提供了上述融合蛋白在治疗癌症中的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
在实施例中，表达CD47与PD-L1肿瘤细胞指实体肿瘤或血液肿瘤细胞。表达Fc受体的免疫细胞指NK细胞或巨噬细胞或单核细胞。
SIRPα完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：1(GenBank:BC038510.2)所示序列，PD-1完整的氨基酸序列为SEQ ID NO：2(GenBank:L27440.1)所示序列。所述融合蛋白中人类抗体IgG1Fc完整的氨基酸序列依据GenBank:AAC82527.1，包括列于SEQ ID NO：3所示序列。，所述连接融合蛋白功能区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4所示序列。
利用SEQ ID NO：1的胞外功能区(AA31-150)，SEQ ID NO：2的胞外功能区(AA26-147)，SEQ ID NO：3(AA103-329)与SEQ ID NO：4组成的融合完整蛋白氨基酸序列为SEQ IDNO：5所示序列。
实施例1
本实施例为重组融合蛋白的基因构建和生产纯化。
根据人SIRPα，IgG1Fc和PD-1的功能区碱基，通过基因合成与非功能氨基酸灵活片段碱基连接成多功能融合蛋白(SEQ ID NO：5)基因，然后转入真核动物表达载体pcDNA3.1。通过基因酶切和进一步克隆，将多功能融合蛋白基因转入真核动物表达载体。最后将融合蛋白的载体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。转染的细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，72小时后取上清液，进一步通过ProteinA亲和层析纯化，最后纯化的蛋白为多功能重组融合蛋白。纯化的蛋白经过电泳检测确认分子量，证明依据本发明设计的重组融合蛋白可以通过CHO细胞生产。最后用分光光度计测试蛋白浓度，稀释保存在PBS中，用作进一步体内外的活性测试及功能研究。图1中利用凝胶电泳测试蛋白的结果表明，融合蛋白分子量符合设计的预期。
实施例2
本实施例为多功能重组融合蛋白对结直肠癌患者腹水中肿瘤细胞杀伤验。
取含有肿瘤细胞和免疫细胞的结直肠癌患者腹水，分成两组每孔1ml置于24孔板，对照组加人PBS，实验组加入融合蛋白至最终浓度为1μg/ml。混匀后置于37℃、5％CO2孵箱中培养48小时。细胞收集后用PBS洗涤一次，然后用针对免疫细胞(CD45)和肿瘤细胞(EpCAM)的流式抗体染色20分钟，洗涤后用流式细胞仪进行测定和数据分析。图2中显示，与未加融合蛋白的患者腹水相比，融合蛋白处理能够明显降低腹水中肿瘤细胞的比例(0.23％vs 0.064％)，同时没有改变淋巴细胞的比例(7.25％vs.32％)，证明融合蛋白可以选择性地杀伤肿瘤细胞，具有临床治疗癌症的推广应用价值。
实施例3
本实施例为多功能重组融合蛋白促进巨噬细胞对肿瘤细胞体外吞噬作用。
将稀释在100μl DMEM培养基中1x105巨噬细胞转移到96孔板中，放置于37℃、5％CO2孵箱中2小时，然后加入在100μl DMEM培养基中由CFSE标记的2x105肿瘤细胞。加入融合蛋白至终浓度为5μg/ml作为融合蛋白组，未有融合蛋白的孔作为对照组。继续培养2小时后收集所有细胞，离心后加入抗CD14流失抗体，染色20分钟，洗涤后用流式细胞仪进行分析。图3中表示加入融合蛋白对H358肿瘤细胞吞噬作用的促进，与对照组相比，含有CFSE肿瘤的CD14细胞的比例由对照组的32％提高到融合蛋白组的90.9％。
通过以上方法测试巨噬细胞对不同肿瘤细胞体外吞噬作用，包括肾细胞癌(170213)、黑色素瘤(M14)、淋巴瘤(Raji)、结直肠癌(HCT116)，肝癌(HepG2)、软巢癌(SKOV3)、头颈部鳞癌(t2013)、膀胱癌(EJ)、肺癌(A549)，白血病(K562)。吞噬效率由吞噬指数来表达，其计算公式为：吞噬指数＝100％xCFSE阳性CD14细胞/CD14阳性细胞。各种肿瘤细胞测试结果如图4所示，融合蛋白对以上肿瘤有促进被吞噬作用。
本实施例为多功能重组融合蛋白在治疗因肿瘤免疫抑制而引起癌症的应用。上述多功能重组融合蛋白可单独应用或与化疗，靶向药物，抗体药物，细胞治疗组成联合应用。
由上述实施例可知，本发明所述的恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，既能识别抗原阳性的肿瘤细胞，又能结合免疫细胞，增加免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能。由于肿瘤的发生与扩散是肿瘤细胞通过表达CD47与PD-L1而产生的免疫逃逸的结果，而融合蛋白既可以阻断肿瘤的免疫抑制通路，又可以促使免疫细胞对肿瘤的杀伤。因此，上述融合蛋白的临床应用可以增强抑制肿瘤生长，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 江苏西迪尔生物技术有限公司
<120> 多功能融合蛋白及其应用
<150> 2017105314579
<151> 2017-07-03
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 503
<212> PRT
<213> SIRPα
<400> 1
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 499
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
260 265 270
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
370 375 380
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
385 390 395 400
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
405 410 415
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
420 425 430
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
435 440 445
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
450 455 460
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
465 470 475 480
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
485 490 495
Thr Glu Arg

Claims (8)

1.一种能识别肿瘤细胞和结合免疫细胞的多功能融合蛋白，其特征在于，包含
a.识别CD47阳性肿瘤细胞的功能区：SIRPα的胞外部分，
b.识别PD-L1阳性肿瘤细胞的功能区：PD-1的胞外部分，
c.结合免疫细胞的功能区：高亲和力人IgG1Fc部分，
d.连接上述功能区的非功能性氨基酸片段，使各个功能区的蛋白折叠不存在相互干扰，能与肿瘤上CD47和PD-L1结合，同时又能与具有Fc受体的NK细胞和巨噬细胞结合。
2.根据权利要求1所述的的多功能融合蛋白，其特征在于SIRPα的胞外部分为SEQ IDNO：1所示氨基酸序列中的31-150位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
3.据权利要求1所述的的多功能融合蛋白，其特征在于PD-1的胞外部分为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的26-147位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
4.根据权利要求1所述的一种多功能融合蛋白，其特征在于所述高亲和力人IgG1Fc部分为SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中的1-227位点，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
5.根据权利要求1所述多功能融合蛋白，其特征在于，所述非功能性氨基酸片段为SEQID NO：4所示氨基酸序列，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
6.根据权利要求1所述的多功能融合蛋白，其特征在于所述多功能融合蛋白的完整氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体。
7.根据权利要求6所述的多功能融合蛋白，其特征在于，根据如下步骤制备所述多功能融合蛋白：
步骤1)通过基因合成，将人SIRPα的胞外部分的片段和PD-1的胞外部分的片段和IgG1Fc相应氨基酸序列的碱基通过非功能氨基酸相应碱基连接，组成融合蛋白的构造基因；
步骤2)将所述的构造基因转入哺乳动物表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞；
步骤3)将所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，纯化后制得重组融合蛋白。
8.一种如权利要求1～7中任一项所述的多功能融合蛋白在制备治疗表达CD47和PD-L1肿瘤而引起的疾病的药物中的应用。
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