CN107849539A - 多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及细胞培养用支架材料 - Google Patents

多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及细胞培养用支架材料 Download PDF

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Abstract

多能干细胞的培养方法及其应用。一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序中，使多肽和多能干细胞接触而培养多能干细胞，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合bFGF，通过第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性；一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序中，使直接或间接粘附于培养容器的bFGF和粘附于培养容器并且具有细胞粘附活性的多肽和多能干细胞接触而培养多能干细胞。

Description

多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及 细胞培养用支架材料
技术领域
本发明涉及一种多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及细胞培养用支架材料。
背景技术
认为为了使多能干细胞维持未分化状态并且稳定地生长，需要培养基中存在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor：bFGF)，例如如日本专利第5717311号公报和日本专利第4613069号公报中公开的那样，bFGF被用作培养多能干细胞的液体培养基的补充物。bFGF包含于血清或血清替代物中，通过将血清或血清替代物添加到液体培养基中，也能够被用作培养多能干细胞的液体培养基的补充物。
一直以来，在多能干细胞的培养中，小鼠成纤维细胞被用作饲养细胞。但是，从预防异种动物源性感染等观点考虑，提出了多能干细胞培养用支架以代替小鼠成纤维细胞，例如国际公开第2013/164970号和Biomaterials,2010,Vol.31,No.32,pp.8281-8288中提出了具有人玻连蛋白的部分序列的重组多肽。
发明内容
发明要解决的技术课题
已知bFGF是在液体培养基中稳定性低的物质，会在液体培养基中逐渐分解、变性、失活等。因此，为了使多能干细胞在保持未分化状态下稳定地生长，需要在液体培养基中含有大量的bFGF、频繁地更换含有bFGF的液体培养基以及在培养中将bFGF补充到液体培养基中等。
本发明的实施方式是基于上述状况而完成的。
本发明的实施方式的目的在于，提供一种即使在实质上不含有bFGF的液体培养基中或者bFGF的含量比通常少的液体培养基中，也能够维持多能干细胞的未分化状态并且使多能干细胞稳定地生长的多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及细胞培养用支架材料，并以解决该问题作为课题。
用于解决技术课题的手段
用于解决上述课题的具体方法包括以下方式。
[A1]一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序中，在实质上不含有bFGF的液体培养基中使多肽和多能干细胞接触而培养多能干细胞，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合bFGF，通过第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性。
[A2]根据[A1]所述的多能干细胞的培养方法，其中，第1区域具有负电荷。
[A3]根据[A1]或[A2]所述的多能干细胞的培养方法，其中，第1区域为包含下述序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，第2区域为包含下述序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域。
序列A-1：以序列号2所表示的氨基酸序列。
序列A-2：与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与bFGF的结合能力的氨基酸序列。
序列A-3：相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与bFGF的结合能力的氨基酸序列。
序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列。
序列B-2：与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
序列B-3：相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
[A4]根据[A1]～[A3]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，多肽还具有RGD基序。
[A5]根据[A1]～[A4]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，多肽在分子末端具有第1区域。
[A6]根据[A1]～[A5]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，多肽为以天然人玻连蛋白的氨基酸序列为基础的重组体。
[A7]根据[A1]～[A6]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
[A8]根据[A1]～[A7]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，多肽的GRAVY值为-2.0～-0.95。
[A9]根据[A1]～[A8]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，在培养工序之前包括：粘附工序，使具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽与培养容器接触，并通过第2区域粘附于培养容器；以及结合工序，使含有bFGF的溶液与多肽接触，并在第1区域结合bFGF。
[A10]根据[A9]所述的多能干细胞的培养方法，其中，在培养工序之前还包括去除工序，所述去除工序去除与多肽接触了的溶液。
[A11]根据[A9]或[A10]所述的多能干细胞的培养方法，其中，溶液含有100ng/mL～1000ng/mL的范围的bFGF。
[A12]一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序中，在液体培养基中使直接或间接粘附于培养容器的bFGF和粘附于培养容器并且具有细胞粘附活性的多肽和多能干细胞接触而培养多能干细胞。
[A13]根据[A12]所述的多能干细胞的培养方法，其中，bFGF通过与粘附于培养容器且具有负电荷的材料结合而间接粘附于培养容器。
[A14]根据[A12]所述的多能干细胞的培养方法，其中，bFGF通过与具有负电荷的培养容器结合而直接粘附于培养容器。
[A15]根据[A12]～[A14]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，液体培养基为实质上不含有bFGF的液体培养基。
[A16]根据[A1]～[A15]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，多能干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[B1]一种培养容器的制造方法，其制造具备结合有bFGF且具有细胞粘附活性的多肽的培养容器，所述方法包括：粘附工序，使具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽与培养容器接触，并通过第2区域粘附于培养容器；以及结合工序，使含有bFGF的溶液与多肽接触，并在第1区域结合bFGF。
[B2]根据[B1]所述的培养容器的制造方法，其还包括去除工序，所述去除工序去除与多肽接触了的溶液。
[B3]根据[B1]或[B2]所述的培养容器的制造方法，其中，溶液含有100ng/mL～1000ng/mL的范围的bFGF。
[B4]根据[B1]～[B3]中任一项所述的培养容器的制造方法，其还包括干燥工序，所述干燥工序对粘附于培养容器且结合有bFGF的多肽进行干燥。
[B5]根据[B1]～[B4]中任一项所述的培养容器的制造方法，其还包括浸渗工序，所述浸渗工序使实质上不含有bFGF的液体浸渗到粘附于培养容器且结合有bFGF的多肽中。
[B6]根据[B1]～[B5]中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，第1区域为包含序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，第2区域为包含序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域。
[B7]根据[B1]～[B6]中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，多肽还具有RGD基序。
[B8]根据[B1]～[B7]中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，多肽在分子末端具有第1区域。
[B9]根据[B1]～[B8]中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，多肽为以天然人玻连蛋白的氨基酸序列为基础的重组体。
[B10]根据[B1]～[B9]中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
[B11]根据[B1]～[B10]中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，培养容器用于培养多能干细胞。
[B12]根据[B11]所述的培养容器的制造方法，其中，多能干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[C1]一种培养容器，其具备多肽，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合bFGF，通过第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性。
[C2]根据[C1]所述的培养容器，其中，多肽为干燥状态。
[C3]根据[C1]所述的培养容器，其中，多肽为保持实质上不含有bFGF的液体的湿润状态。
[C4]根据[C1]～[C3]中任一项所述的培养容器，其中，第1区域为包含序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，第2区域为包含序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域。
[C5]根据[C1]～[C4]中任一项所述的培养容器，其中，多肽还具有RGD基序。
[C6]根据[C1]～[C5]中任一项所述的培养容器，其中，多肽在分子末端具有第1区域。
[C7]根据[C1]～[C6]中任一项所述的培养容器，其中，多肽为以天然人玻连蛋白的氨基酸序列为基础的重组体。
[C8]根据[C1]～[C7]中任一项所述的培养容器，其中，多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
[C9]根据[C1]～[C8]中任一项所述的培养容器，其用于培养多能干细胞。
[C10]根据[C9]所述的培养容器，其中，多能干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[D1]一种细胞培养用支架材料，其含有多肽，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合有bFGF且具有细胞粘附活性。
[D2]根据[D1]所述的细胞培养用支架材料，其为干燥状态。
[D3]根据[D1]所述的细胞培养用支架材料，其为保持实质上不含有bFGF的液体的湿润状态。
[D4]根据[D1]～[D3]中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，第1区域为包含序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，第2区域为包含序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域。
[D5]根据[D1]～[D4]中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，多肽还具有RGD基序。
[D6]根据[D1]～[D5]中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，多肽在分子末端具有第1区域。
[D7]根据[D1]～[D6]中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，多肽为以天然人玻连蛋白的氨基酸序列为基础的重组体。
[D8]根据[D1]～[D7]中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
[D9]根据[D1]～[D8]中任一项所述的细胞培养用支架材料，其用于培养多能干细胞。
[D10]根据[D9]所述的细胞培养用支架材料，其中，多能干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
发明效果
根据本发明的实施方式，提供一种即使在实质上不含有bFGF的液体培养基中或者在bFGF的含量比通常少的液体培养基中，也能够维持多能干细胞的未分化状态并且使多能干细胞稳定地生长的多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及细胞培养用支架材料。
附图说明
图1是表示在实施例3中通过吸光度测定对bFGF量进行了定量的结果的图表。
图2是表示在实施例4中培养的人iPS细胞的光学显微镜图像。
图3是表示在实施例6中对基因表达量进行了相对评价的结果的图表。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。另外，这些说明以及实施例是本发明的例示，并不限制本发明的范围。
本说明书中，用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为下限值和上限值而包含的范围。
本说明书中，“工序”一词不仅包含独立的工序，即使在无法与其他工序明确地进行区分的情况下，只要能够实现该工序的预期目的，则也包含于本术语中。
本说明书中，提到组合物中的各成分的量时，若组合物中存在多种相当于各成分的物质时，除非另有说明，否则表示存在于组合物中的该多种物质的总量。
本说明书中，有时用该技术领域中周知的单字母符号(例如，用“G”表示甘氨酸残基)或三字母符号(例如，用“Gly”表示甘氨酸残基)来标记氨基酸序列中的氨基酸残基。
关于本说明书中的氨基酸序列的“同源性”是指，使用BLAST软件包(参照Ausubel等，1999Short Protocols in Molecular Biology，第4版-第18章)计算出的值。例如，相对于序列号3为同源性80％以上表示BLAST中的Max Identity的值为80以上。
本说明书中，关于氨基酸序列的特定的氨基酸残基使用的“所对应的氨基酸残基”等表达表示，针对进行对比的两个以上的氨基酸序列，利用在该技术领域中周知的方式并考虑到***、缺失以及替换的基础上，以使成为相同的氨基酸残基最多的方式对齐(对准)时，与成为基准的氨基酸序列中的特定的氨基酸残基的位置一致的另一氨基酸序列中的氨基酸残基。
本公开中，液体培养基或液体“实质上不含有bFGF”是表示，bFGF作为液体培养基或液体的成分不含有为了维持多能干细胞的未分化状态并且使多能干细胞稳定地生长所需的最小限度的量以上。具体而言，液体培养基或液体的bFGF浓度优选为小于5ng/ml，更优选为小于1ng/ml，进一步优选为检测极限以下。
本公开中，有时将具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽称为“特定多肽”，并且有时将在第1区域结合有bFGF的特定多肽称为“特定多肽/bFGF复合体”。
本公开中，作为多能干细胞的培养方法，提供第1实施方式和第2实施方式。以下，对这两个实施方式依次进行说明。
＜多能干细胞的培养方法：第1实施方式＞
第1实施方式为一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序中，在实质上不含有bFGF的液体培养基中使多肽和多能干细胞接触而进行培养，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合bFGF，通过第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性。
即，第1实施方式中，使多能干细胞与粘附于培养容器的状态的特定多肽/bFGF复合体接触而进行培养。第1实施方式中，特定多肽/bFGF复合体成为用于使多能干细胞生长的支架。
第1实施方式中，特定多肽结合bFGF，由此抑制bFGF的分解、变性或失活。而且，多能干细胞一边与特定多肽/bFGF复合体接触一边进行培养，因此受到特定多肽/bFGF复合体中的bFGF的作用，维持未分化状态并且稳定地生长。
因此，根据第1实施方式，能够在实质上不含有bFGF的液体培养基中培养多能干细胞，并且，无需以将bFGF补充到培养环境为目的而频繁地更换含有bFGF的液体培养基和/或在培养中向液体培养基添加bFGF。
以下，对第1实施方式的详细内容进行说明。
[特定多肽]
作为特定多肽，只要具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，并且具有细胞粘附活性，则氨基酸序列以及氨基酸残基的数量并没有特别限制。
本公开中，多肽或其氨基酸序列“结合bFGF”以及“具有与bFGF的结合能力”是表示，多肽与bFGF通过蛋白质-蛋白质之间的一般相互作用(氢键、离子键、静电相互作用、疏水性相互作用、通过范德华力键等)进行结合以及能够进行结合。本公开中，通过以下方法来判断多肽是否具有与bFGF的结合能力。
使bFGF以100ng/ml的浓度与多肽接触。例如，将多肽粘附于培养容器之后，将bFGF浓度为100ng/ml的溶液(例如，bFGF水溶液、Essential8培养基)注入到培养容器中。此外，当多肽存在于液体中时，也可以向该多肽液中添加bFGF以使浓度成为100ng/ml。然后，在37℃下静置24小时，并在静置24小时之后使用针对bFGF的抗体进行ELISA(酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay))，从而尝试检测bFGF。当与bFGF浓度为100ng/ml的溶液(例如，bFGF水溶液、Essential8培养基。在这些溶液中bFGF未与其他化合物形成复合体，因此通过在37℃下静置24小时，bFGF变化为无法通过ELISA检测的形态。)相比所检测的bFGF量尤其高时，判断为多肽具有与bFGF的结合能力。
本公开中，多肽或其氨基酸序列“粘附于培养容器”以及“具有对培养容器的粘附能力”是表示，相对于培养容器的细胞培养表面(以下有时称为“培养表面”。)，多肽无需通过化学处理而进行粘附以及能够进行粘附。通过以下方法来判断多肽是否具有对培养容器的培养表面的粘附能力。
向内表面进行了等离子体处理的聚苯乙烯制培养容器中注入含多肽的溶液以成为200pmol/cm2，并在37℃下静置2小时。在静置2小时之后，用磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗两次后，通过在培养表面是否残留有10pmol/cm2以上的多肽来进行判断。残留在培养表面的多肽的量能够通过使用了识别多肽的抗体的ELISA或对所粘附的多肽进行水解并对所生成的氨基酸量进行测定的HPLC(高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography))来进行定量。
本公开中，多肽或其氨基酸序列的细胞粘附活性为针对培养对象细胞的粘附活性，能够通过公知的方法来确认。例如，能够通过在培养表面涂有多肽的培养容器中接种并孵育细胞，并对粘附于培养表面的细胞进行计数来确认。具体的方法例如记载于Methodsin Enzymology 82：803-831,1982(Ruoslahti,E.等)以及Nature 352：438-441,1991(Williams,D.A.等)中。
作为特定多肽，优选第1区域具有负电荷的多肽。当bFGF具有正电荷时，通过使第1区域具有负电荷而使第1区域与bFGF静电结合。另外，多肽或其一部分是否具有正电荷或负电荷依赖于多肽或其一部分所处的pH环境。第1区域“具有负电荷”是表示细胞培养下，例如在pH7.4的液体培养基中具有负电荷。作为在细胞培养下第1区域具有负电荷的实施方式，例如可举出第1区域的等电点为6以下的实施方式，优选第1区域的等电点为1～6的实施方式，更优选为2～5的实施方式。
作为特定多肽，例如可举出玻连蛋白、纤连蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白等天然蛋白质、根据这些天然蛋白质的氨基酸序列设计的重组蛋白质以及它们的混合物。特定多肽可以单独使用1种，也可以同时使用2种以上。
作为玻连蛋白，优选人玻连蛋白，具体而言，优选以序列号1所表示的459氨基酸残基的多肽。已确认到在人体内产生的天然人玻连蛋白是一部分氨基酸与糖链结合的糖蛋白。
序列号1
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
以序列号1所表示的玻连蛋白具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，并且具有与bFGF的结合能力以及对培养容器的粘附能力。以序列号1所表示的玻连蛋白还具有显示细胞粘附活性的区域，并且粘附于培养对象细胞。
作为特定多肽，从混入抗原性物质以及感染源的可能性小的观点考虑，优选根据天然人玻连蛋白(序列号1)的氨基酸序列设计的重组体。以下，有时将该重组体称为“重组玻连蛋白”。
作为特定多肽，优选如下多肽：具有包含下述序列A-1～A-3中的任一序列的区域作为第1区域，并且具有包含下述序列B-1～B-3中的任一序列的区域作为第2区域。
序列A-1：以序列号2所表示的氨基酸序列。
序列A-2：与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与bFGF的结合能力的氨基酸序列。
序列A-3：相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与bFGF的结合能力的氨基酸序列。
序列号2
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQ
序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列。
序列B-2：与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
序列B-3：相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
序列号3
PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN
以序列号2所表示的氨基酸序列为序列号1中的第1个～第42个这42个氨基酸残基，相当于生长调节素B样结构域。本公开中，有时将以序列号2所表示的氨基酸序列以及与其具有同源性的氨基酸序列称为“SMB结构域”。SMB结构域具有与bFGF的结合能力。
以序列号3所表示的氨基酸序列为序列号1中的第342个～第373个这32个氨基酸残基，相当于肝素结合结构域，包含于血液结合素样结构域II的一部分。本公开中，有时将以序列号3所表示的氨基酸序列以及与其具有同源性的氨基酸序列称为“肝素结合结构域”。肝素结合结构域具有对培养容器的粘附能力。肝素结合结构域还发挥保证多肽的亲水性并抑制多肽的疏水凝聚的效果。
序列A-2为与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选为具有85％以上、更优选为具有90％以上、进一步优选为具有95％以上的同源性的氨基酸序列。
序列A-3为相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选为添加、替换或缺失了1个～8个氨基酸、更优选为添加、替换或缺失了1个～4个氨基酸的氨基酸序列。
序列B-2为与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选为具有85％以上、更优选为具有90％以上、进一步优选为具有95％以上的同源性的氨基酸序列。
序列B-3为相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选为添加、替换或缺失了1个～6个氨基酸、更优选为添加、替换或缺失了1个～3个氨基酸的氨基酸序列。
特定多肽优选还具有RGD基序。RGD基序是指由Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)组成，且具有细胞粘附活性的氨基酸序列。天然人玻连蛋白中的RGD基序为序列号1中的第45个～第47个的序列。
从细胞粘附活性的观点考虑，特定多肽优选将RGD基序暴露于分子表面。因此，特定多肽中的紧接于RGD基序之前和之后的氨基酸序列优选根据基于RGD基序且具有细胞粘附活性的天然蛋白质(例如，天然人玻连蛋白)的氨基酸序列来设计。从本观点考虑，特定多肽的一种实施方式中，在紧接于RGD基序之前或之后具有下述(a)或(b)中的至少一者，特定多肽的另一种实施方式中，在紧接于RGD基序之前和之后具有下述(a)和(b)这两者。
(a)序列号1中的第43个～第44个氨基酸序列。
(b)序列号1中的第48个～第55个氨基酸序列。
(a)优选位于紧接在RGD基序之前，(b)优选位于紧接在RGD基序之后。(a)和(b)也可以是在不损害RGD基序的细胞粘附活性的范围内，分别添加、替换或缺失了1个或2个氨基酸的氨基酸序列。
在特定多肽中，第1区域与第2区域的相对位置并没有特别限制。在特定多肽的一种实施方式中，第1区域位于第2区域的N末端侧。
当特定多肽具有RGD基序时，在特定多肽中，RGD基序的位置并没有特别限制。在特定多肽的一种实施方式中，RGD基序位于第1区域与第2区域之间。
从提高与bFGF的结合能力的观点以及将所结合的bFGF暴露于分子表面的观点考虑，特定多肽优选在分子末端具有第1区域。在特定多肽的一种实施方式中，第1区域位于N末端。
作为特定多肽，优选包含第1区域和RGD基序的区域由序列号1中的第1个～第55个氨基酸序列或与其具有同源性的氨基酸序列组成。即，作为特定多肽，优选包含第1区域和RGD基序的区域为由下述序列C-1～C-3中的任一序列组成的区域。
序列C-1：以序列号4所表示的氨基酸序列。
序列C-2：与以序列号4所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与bFGF的结合能力以及RGD基序的氨基酸序列。
序列C-3：相对于以序列号4所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与bFGF的结合能力以及RGD基序的氨基酸序列。
序列号4
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDE
序列C-2为与以序列号4所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，优选为具有85％以上、更优选为具有90％以上、进一步优选为具有95％以上的同源性的氨基酸序列。
序列C-3为相对于以序列号4所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选为添加、替换或缺失1个～10个氨基酸、更优选为添加、替换或缺失1个～5个氨基酸的氨基酸序列。
在特定多肽的一种实施方式中，由序列C-1～C-3中的任一序列组成的区域位于N末端。从提高与bFGF的结合能力的观点、将所结合的bFGF暴露于分子表面的观点以及将RGD基序暴露于分子表面的观点考虑，优选该实施方式的特定多肽。
特定多肽也可以包含除第1区域、第2区域以及RGD基序以外的其他氨基酸序列，作为其他氨基酸序列，优选天然人玻连蛋白(序列号1)的部分序列。由此，特定多肽能够具有接近人玻连蛋白的性质。
从与bFGF的结合能力、对培养容器的粘附能力、细胞粘附活性或凝聚抑制的观点考虑，特定多肽优选在紧接于第2区域之前或之后包含天然人玻连蛋白(序列号1)的部分序列。作为该部分序列，例如可举出下述序列D-1～D-3、序列E-1～E-3。
序列D-1：以序列号1所表示的氨基酸序列的第269个～第341个氨基酸序列(序列d-1)或其部分氨基酸序列。
序列D-2：与序列d-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
序列D-3：相对于序列d-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
序列E-1：以序列号1所表示的氨基酸序列的第374个～第459个氨基酸序列(序列e-1)或其部分氨基酸序列。
序列E-2：与序列e-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
序列E-3：相对于序列e-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在上述中“部分氨基酸序列”是表示规定范围的氨基酸序列的一部分，并且由连续的3个氨基酸残基以上构成的氨基酸序列。
序列D-2为与序列d-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的序列，例如为具有85％以上、90％以上或95％以上的同源性的氨基酸序列。
序列D-3为相对于序列d-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，例如为添加、替换或缺失1个～20个、1个～10个或1个～5个氨基酸的氨基酸序列。
序列E-2为与序列e-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80％以上的同源性的序列，例如为具有85％以上、90％以上或95％以上的同源性的氨基酸序列。
序列E-3为相对于序列e-1的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，例如为添加、替换或缺失了1个～20个、1个～10个或1个～5个氨基酸的氨基酸序列。
特定多肽为重组玻连蛋白，且包含除第1区域、第2区域以及RGD基序以外的其他氨基酸序列时，其他氨基酸序列也可以在以序列号1所表示的氨基酸序列的半胱氨酸残基的位置上具有除半胱氨酸残基以外的氨基酸残基。由此，能够防止由半胱氨酸残基形成的分子内交联或分子间交联，因此优选。作为替换半胱氨酸残基的其他氨基酸残基，可举出丝氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基等。其中，从与半胱氨酸残基具有类似结构的观点考虑，优选为丝氨酸残基、丙氨酸残基。
当特定多肽为重组玻连蛋白时，以序列号1所表示的氨基酸序列中，也可以不包含第56个～第268个氨基酸残基。认为本区域在本公开中对特定多肽所需性能的贡献较少。
在不损害细胞粘附活性、与bFGF的结合能力以及对培养容器的粘附能力的范围内，特定多肽也可以具有除之前说明的以外的其他额外的氨基酸残基。作为这种氨基酸残基，例如可举出为了通过重组技术制作多肽而附加的附加序列。具体而言，可举出N末端的甲硫氨酸残基、标签序列(tag sequence)(例如，GST标签、FLAG标签、His标签等)、各区域间的连接序列(linker sequence)(例如，由GGS、GGGS、GGGGS等重复的序列)等。
特定多肽优选由80个～500个氨基酸残基组成。若为80个氨基酸残基以上，则可以良好地发挥与bFGF的结合能力、对培养容器的粘附能力、细胞粘附活性以及细胞生长活性。从本观点考虑，特定多肽的氨基酸残基优选为80个以上，更优选为85个以上，进一步优选为90个以上，进一步优选为100个以上。另一方面，若为500个氨基酸残基以下，则不易发生蛋白质彼此的缔合或交联或凝聚。从本观点考虑，特定多肽的氨基酸残基优选为500个以下，更优选为480个以下，进一步优选为460个以下，进一步优选为400个以下，进一步优选为300个以下，进一步优选为250个以下，进一步优选为200个以下，进一步优选为180个以下，进一步优选为150个以下。这些上限值或下限值可以任意组合，特定多肽例如由80个～400个氨基酸残基、80个～300个氨基酸残基、80个～250个氨基酸残基、80个～200个氨基酸残基、80个～150个氨基酸残基或100个～150个氨基酸残基组成。
从对培养容器的粘附能力优异的观点以及防止疏水凝聚的观点考虑，特定多肽的GRAVY(平均疏水性(Grand Average of Hydropathy))值优选为-2.0～-0.95。GRAVY值(Kyte J.,Doolittle R.F.(1982),J.Mol.Biol,157：105-132)的值越大，表示多肽的疏水性越高。若GRAVY值为-0.95以下，则不易发生疏水凝聚。从本观点考虑，特定多肽的GRAVY值优选为-0.95以下，更优选为-0.975以下，进一步优选为-1.0以下，进一步优选为-1.10以下。另一方面，若GRAVY值为-2.0以上，则容易发挥细胞生长活性以及对培养容器的粘附能力，具有随着GRAVY值变大而上述效果良好的倾向。从本观点考虑，特定多肽的GRAVY值优选为-2.0以上，更优选为-1.70以上，进一步优选为-1.60以上。特定多肽的GRAVY值例如能够通过氨基酸序列中的疏水性氨基酸(例如，Trp、Tyr、Phe、Leu、Ile、Val、Met)的比例的增减、氨基酸残基数量的增减等来进行调整。
作为特定多肽，从与bFGF的结合能力、对培养容器的粘附能力、细胞粘附活性、细胞生长活性以及未分化维持性的观点考虑，优选如下多肽：具有下述(1)作为第1区域以及包含RGD基序的区域，具有下述(2)作为第2区域，还具有下述(3)或(4)中的至少一者，并且由80个～500个氨基酸残基组成。
(1)由序列号1中的第1个～第55个氨基酸序列(即，序列C-1：以序列号4所表示的氨基酸序列)或与其具有同源性的氨基酸序列(即，序列C-2或序列C-3)中的任一者组成的区域。
(2)序列号1中的第342个～第373个氨基酸序列(即，序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列)或与其具有同源性的氨基酸序列(即，序列B-2或序列B-3)中的任一者组成的区域。
(3)序列号1中的第269个～第341个氨基酸序列或其部分氨基酸序列(即，序列D-1)或者与它们具有同源性的氨基酸序列(即，序列D-2或序列D-3)中的任一者组成的区域。
(4)序列号1中的第374个～第459个氨基酸序列或其部分氨基酸序列(即，序列E-1)或者与它们具有同源性的氨基酸序列(即，序列E-2或序列E-3)中的任一者组成的区域。
在特定多肽的一种实施方式中，上述(1)～(4)从N末端侧开始以(1)(3)(2)(4)的顺序排列。
表1中举出特定多肽的氨基酸序列的具体例。在氨基酸序列中的SMB结构域、RGD基序以及肝素结合结构域上标注下划线。
表1
作为特定多肽的氨基酸序列的具体例，还可以举出在以序列号5～15所表示的氨基酸序列的N末端附加有甲硫氨酸残基的氨基酸序列。N末端的甲硫氨酸残基例如在通过重组技术制作多肽时被附加。
特定多肽能够通过本领域技术人员公知的基因重组技术来制造，例如，能够依据国际公开第2013/164970号中记载的方法来制造。具体而言，获取对根据天然人玻连蛋白的氨基酸序列来设计的氨基酸序列进行编码的基因，将其并入表达载体而制作重组表达载体，并将其导入适当的宿主而制作转化体。通过将所得的转化体在适当的培养基中进行培养，产生含有重组玻连蛋白的培养物，并通过从培养物回收重组玻连蛋白，得到作为特定多肽的重组玻连蛋白。
[液体培养基]
在第1实施方式中使用的液体培养基只要实质上不含有bFGF，则并没有特别限制。液体培养基可以含有与成为培养对象的多能干细胞的种类对应的成分。作为液体培养基，优选公知的哺乳动物细胞用基本培养基(优选为人细胞用基本培养基，更优选为人干细胞用基本培养基)且不含有bFGF的液体培养基；从公知的哺乳动物细胞用基本培养基(优选为人细胞用基本培养基，更优选为人干细胞用基本培养基)除去了bFGF的液体培养基。作为本公开中能够适用的哺乳动物细胞用基本培养基，可举出DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))、DMEM/F-12(杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium):营养混合物(Nutrient Mixture)F-12)、EMEM(伊格尔极限必需培养基(Eagle's minimal essential medium))、MEMα(极限必需培养基α(Minimum Essential Medium Alpha)、BME(伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle))、RPMI 1640培养基(Roswell Park Memorial Institute 1640Medium)、E8基础培养基(E8base medium)(Nature Protocols 7：2029-2040,2012)、SkBM(骨骼肌细胞基础培养基(Skeletal Muscle Cell Basal Medium))、MCDB104、MCDB153、199、L15、mTeSR1、TeSR2等。
液体培养基中也可以以通常的浓度添加通常添加的各种成分，例如，青霉素、链霉素等抗生素；抗坏血酸、视黄酸等维生素或维生素衍生物；葡萄糖等糖原；氨基酸；***钠、氯化钠等无机盐；转铁蛋白等蛋白质；胰岛素等激素；TGF-β(转化生长因子-β(transforming growth factor-β))、EGF(表皮生长因子(epidermal growth factor))等细胞生长因子；分化抑制因子；2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等抗氧化剂；等。为了在整个培养中将浓度保持在目标范围，上述成分可以在多能干细胞的培养中补充到液体培养基。
从抑制bFGF混入液体培养基的观点以及抑制抗原性物质和感染源等异物混入多能干细胞的观点考虑，液体培养基优选不含有血清以及血清替代物。
液体培养基的pH例如为pH7.0～8.0，优选为pH7.3～7.4。
[培养条件]
第1实施方式中的培养条件可以适用一般的条件。例如，可适用在温度37℃且5％(v/v)CO2浓度的恒温箱内的培养。当传代多能干细胞时，可以适用一般的传代方法。
多能干细胞的接种密度并没有特别限制，可以适用一般的条件。例如，可以设为1×103个/cm2～1×105个/cm2左右的接种密度。并且，也可以将10μm～100μm的细胞团块设为1个/cm2～5个/cm2左右的接种密度。
第1实施方式中，通过特定多肽/bFGF复合体粘附于培养容器，从而在更换液体培养基时，特定多肽/bFGF复合体不易从培养容器丢失。并且，特定多肽/bFGF复合体中的bFGF通过与特定多肽结合而抑制分解、变性或失活。因此，根据第1实施方式，能够一边更换实质上不含有bFGF的液体培养基，一边在同一培养容器内持续培养多能干细胞。
在第1实施方式中，在一系列培养中使用的液体培养基也可以不是相同的组成。第1实施方式中，只要能够将多能干细胞维持成未分化状态，则也可以一边替换成不同组成的液体培养基一边持续进行培养。
第1实施方式中，从抑制抗原性物质和感染源等异物混入多能干细胞的观点考虑，优选不使用饲养细胞。第1实施方式中，粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体作为用于使多能干细胞生长的支架发挥作用，因此不需要饲养细胞。
[多能干细胞]
成为第1实施方式的培养对象的细胞为多能干细胞。多能干细胞是具有能够在保持未分化状态下生长的“自我复制能力”和能够分化成所有三胚层系列的“多分化能力”的未分化细胞。作为多能干细胞，例如可举出诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell：iPS细胞)、胚胎干细胞(embryonic stem cell：ES细胞)、胚胎生殖细胞(embryonicgerm cell：EG细胞)、胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cell：EC细胞)、多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cell：MAP细胞)、成体多能干细胞(adult pluripotentstem cell：APS细胞)、多系分化持续应激细胞(multi-lineage differentiating stressenduring cell)等。作为成为本公开的培养对象的多能干细胞，优选人iPS细胞或人ES细胞。iPS细胞中包含Nature448：313-317(2007)以及Cell 126：663-676(2006)中所记载的细胞或与其类似的细胞。
多能干细胞是否维持未分化状态能够通过公知的方法来确认。例如，能够通过流式细胞术或免疫染色来确认未分化标记的表达的方法、在注射到免疫缺陷小鼠的皮下时确认畸胎瘤形成等来确认。
多能干细胞可以是饲养细胞依赖性细胞，但优选非饲养细胞依赖性细胞。非饲养细胞依赖性细胞例如能够通过使用后述的本公开的培养容器，在不存在饲养细胞的条件下进行数次传代操作来挑选。
[培养容器]
在第1实施方式中，培养容器至少在进行细胞培养的培养表面具备粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体作为用于使细胞生长的支架。
作为第1实施方式中使用的培养容器的主体，可举出在该技术领域中作为细胞培养用而公知的所有培养容器。材质并没有特别限制，例如可举出树脂(例如，聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂)、玻璃、多孔过滤器、中空纤维、陶瓷等。形状也没有特别限制，可举出多孔板、培养皿、微阵列用板、管、烧瓶、滚筒瓶、袋等。作为培养容器的主体，从特定多肽以及特定多肽/bFGF复合体的粘附性的观点考虑，优选在培养表面实施了通过等离子体放电等进行的电荷处理的聚苯乙烯制培养容器。本说明书中，将通过等离子体放电进行的电荷处理称为“等离子体处理”。
第1实施方式中，可以使用预先准备的培养容器来进行培养工序。第1实施方式中使用的培养容器能够通过后述的本公开的培养容器的制造方法来制造。
第1实施方式中，也可以在培养工序之前包括通过下述粘附工序以及结合工序来制备培养容器的培养表面的工序。根据该实施方式，连续地依次进行培养容器的准备和多能干细胞的培养。从抑制bFGF混入液体培养基的观点考虑，该实施方式优选还包括下述去除工序。
粘附工序：使具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽(特定多肽)与培养容器接触，并通过第2区域粘附于培养容器的工序。
结合工序：使含有bFGF的溶液与特定多肽接触，并在第1区域结合bFGF的工序。
去除工序：去除与特定多肽接触且含有bFGF的溶液的工序。
粘附工序、结合工序以及去除工序的定义与＜培养容器的制造方法＞一项中说明的各工序相同，优选方式也相同。
＜多能干细胞的培养方法：第2实施方式＞
第2实施方式为多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序中，在液体培养基中使直接或间接粘附于培养容器的bFGF和粘附于培养容器并且具有细胞粘附活性的多肽和多能干细胞接触而培养多能干细胞。
在第2实施方式中，bFGF直接或间接地粘附于培养容器，另一方面，具有细胞粘附活性的多肽不与bFGF形成复合体而粘附于培养容器。
在第2实施方式中，bFGF通过直接粘附于培养容器或者通过经由其他材料粘附于培养容器来抑制其分解、变性或失活。而且，多能干细胞作为用于使粘附于培养容器且具有细胞粘附活性的多肽生长的支架，一边与bFGF接触一边进行培养，因此会维持未分化状态并且稳定地生长。
因此，根据第2实施方式，在实质上不含有bFGF的液体培养基中或者bFGF的含量比通常少的液体培养基中也能够进行多能干细胞的培养，并且，无需以将bFGF补充到培养环境为目的而频繁地更换含有bFGF的液体培养基和/或在培养中向液体培养基添加bFGF。
以下，对第2实施方式的详细内容进行说明。
[多肽]
第2实施方式中的多肽只要具有对培养容器的粘附能力和细胞粘附活性，则并没有特别限制。作为第2实施方式中的多肽，可举出作为公知的多能干细胞培养用支架材料的多肽，例如玻连蛋白、玻连蛋白衍生的多肽、层粘连蛋白、层粘连蛋白衍生的多肽等。这些多肽可以单独使用1种，也可以同时使用2种以上。
作为玻连蛋白衍生的多肽的一例，可举出由人玻连蛋白的氨基酸序列(序列号1)中缺失了第1个～第44个氨基酸序列的一部分或全部或者缺失了第379个～第449个氨基酸序列的一部分或全部中的至少一方的氨基酸序列组成的多肽。作为玻连蛋白衍生的多肽的一例，更优选由人玻连蛋白的氨基酸序列中缺失了第1个～第44个氨基酸序列的一部分或全部以及缺失了第379个～第449个氨基酸序列的一部分或全部的氨基酸序列组成的多肽，进一步优选由人玻连蛋白的氨基酸序列中缺失了第1个～第44个氨基酸序列的一部分以及缺失了第379个～第449个氨基酸序列的一部分的氨基酸序列组成的多肽。
作为玻连蛋白衍生的多肽的另一例，优选下述多肽。
·由人玻连蛋白的氨基酸序列(序列号1)中的第62个～第478个氨基酸序列组成的多肽。
·与人玻连蛋白的氨基酸序列(序列号1)中的第62个～第478个氨基酸序列具有80％以上(即80％～100％。优选为90％～100％)的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力以及细胞粘附活性的多肽。
·相对于人玻连蛋白的氨基酸序列(序列号1)中的第62个～第478个氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个(优选为1个～10个，更优选为1个～5个)的氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力以及细胞粘附活性的多肽。
作为玻连蛋白衍生的多肽的又一例，可举出市售的重组型玻连蛋白即VTN-N(LifeTechnologies,Inc.制造)，能够优选使用于第2实施方式。
作为层粘连蛋白衍生的多肽，优选具有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段的多肽。人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段表示相当于小鼠层粘连蛋白α1β1γ1的E8片段的人层粘连蛋白α5β1γ1的片段，人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段表示相当于小鼠层粘连蛋白111E8的人层粘连蛋白α3β3γ2的片段。作为层粘连蛋白衍生的多肽的具体例，可举出iMatrix-511(Nippi.Inc.制)，能够优选使用于第2实施方式。
[粘附于培养容器的bFGF]
在第2实施方式中，bFGF直接或间接地粘附于培养容器。第2实施方式优选(A)bFGF通过与粘附于培养容器且具有负电荷的材料静电结合来间接地粘附于培养容器，或者(B)bFGF通过与具有负电荷的培养容器静电结合来直接粘附于培养容器中的任意一种。
-实施方式(A)-
作为使bFGF间接地粘附于培养容器、具有负电荷且具有对培养容器的粘附能力的材料，例如可举出碱处理明胶。另外，材料是否具有正电荷或负电荷依赖于材料所处的pH环境。材料“具有负电荷”是表示在细胞培养下，例如在pH7.4的液体培养基中具有负电荷。并且，材料“粘附于培养容器”以及“具有对培养容器的粘附能力”是表示相对于培养容器的细胞培养表面，无需通过化学处理而进行粘附以及能够进行粘附。
实施方式(A)中使用的培养容器例如能够通过将含有bFGF、具有负电荷且具有对培养容器的粘附能力的材料以及具有对培养容器的粘附能力和细胞粘附活性的多肽的溶液注入培养容器中，并通过孵育来制备。上述培养容器的主体与第1实施方式中的培养容器的主体相同。
实施方式(A)例如在通过上述方法制备的培养容器中容纳bFGF的含量比通常少的液体培养基或实质上不含有bFGF的液体培养基来实施。
实施方式(A)也可以是如下培养方法，该方法包括使用粘附有具有负电荷的材料和具有细胞粘附活性的多肽的培养容器、以及含有bFGF的液体培养基，开始进行多能干细胞的培养。该情况下，培养开始时的液体培养基中所含的bFGF经由上述材料而粘附于培养容器，液体培养基成为bFGF的含量比通常少的液体培养基或实质上不含有bFGF的液体培养基。
-实施方式(B)-
作为在进行细胞培养的培养表面具有负电荷的培养容器，例如可举出用磺基进行了表面改性的聚苯乙烯制培养容器、用羧基进行了表面改性的聚苯乙烯制培养容器。
实施方式(B)中使用的培养容器例如能够通过将含有bFGF以及具有对培养容器的粘附能力和细胞粘附活性的多肽的溶液注入在培养表面具有负电荷的培养容器中，并通过孵育来制备。
实施方式(B)例如在通过上述方法制备的培养容器中容纳bFGF的含量比通常少的液体培养基或实质上不含有bFGF的液体培养基来实施。
实施方式(B)也可以是如下培养方法，该方法包括使用粘附有具有细胞粘附活性的多肽且在培养表面具有负电荷的培养容器、以及含有bFGF的液体培养基，开始进行多能干细胞的培养。该情况下，培养开始时的液体培养基中所含的bFGF粘附于培养容器，液体培养基成为bFGF的含量比通常少的液体培养基或实质上不含有bFGF的液体培养基。
除了以上说明以外，关于第2实施方式中的[液体培养基]、[培养条件]以及[多能干细胞]，与第1实施方式中记载的事项相同。但是，在第2实施方式中，液体培养基的bFGF含量并没有特别限制。作为第2实施方式中的液体培养基，优选bFGF的含量比通常少的液体培养基，优选实质上不含有bFGF的液体培养基。
＜培养容器的制造方法＞
本公开的培养容器的制造方法包括下述粘附工序以及结合工序。通过经由下述粘附工序以及结合工序，结合有bFGF且具有细胞粘附活性的多肽配置于培养容器中。即，根据本公开的培养容器的制造方法，提供一种具备特定多肽/bFGF复合体作为用于使细胞生长的支架的培养容器。
粘附工序：使具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽(特定多肽)与培养容器接触，并通过第2区域粘附于培养容器的工序。
结合工序：使含有bFGF的溶液与特定多肽接触，并在第1区域结合bFGF的工序。
从抑制bFGF混入培养细胞时使用的液体培养基的观点考虑，本公开的培养容器的制造方法优选还包括下述去除工序。
去除工序：去除与特定多肽接触且含有bFGF的溶液的工序。
粘附工序例如包括将含有特定多肽的液体(特定多肽含有液)注入培养容器或涂布于培养容器的表面，并在温度25℃～40℃下静置30分钟～24小时。特定多肽含有液通过使特定多肽溶解或分散于磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水、水等中来制备即可。特定多肽含有液的特定多肽浓度例如为10μg/mL～1000μg/mL。特定多肽能够经由第2区域而粘附于培养容器，因此无需通过化学处理来进行对培养容器的固定处理。
特定多肽优选以1pmol/cm2～1000pmol/cm2的范围粘附于培养容器的表面，更优选以100pmol/cm2～300pmol/cm2的范围粘附。
结合工序例如包括使含有bFGF的溶液(bFGF含有溶液)与特定多肽接触，并在温度25℃～40℃下静置30分钟～24小时。
结合工序中使用的bFGF含有溶液通过使bFGF溶解或分散于磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水、注射用水、离子交换水等中来制备即可。并且，也可以将含有bFGF的液体培养基用作bFGF含有溶液。bFGF含有溶液的bFGF浓度例如为1ng/mL～10000ng/mL，优选为10ng/mL～1000ng/mL，更优选为100ng/mL～1000ng/mL。
结合工序中的bFGF含有溶液的使用量优选每100分子的特定多肽中，bFGF成为1分子～10分子的量。作为容积，优选浸没特定多肽整体的程度以上的量。
粘附工序和结合工序可以先进行任一工序，也可以一同进行。例如，可以先进行粘附工序，将特定多肽粘附于培养容器之后，向培养容器中注入bFGF含有溶液并静置后进行结合工序。此外，例如也可以使特定多肽溶解或分散于bFGF含有溶液来制备混合液，静置该混合液并进行结合工序之后，将该混合液注入培养容器并静置后进行粘附工序。此外，例如也可以将特定多肽溶解或分散于bFGF含有溶液来制备的混合液注入培养容器并静置，并且在培养容器的表面一同进行粘附工序和结合工序。
去除工序例如包括使用玻璃器皿抽吸在结合工序中使用的bFGF含有溶液。在去除bFGF含有溶液之后，也可以用磷酸盐缓冲液等来清洗特定多肽/bFGF复合体。
本公开的培养容器的制造方法也可以包括对粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体进行干燥的干燥工序。通过进行干燥工序，可以得到具备干燥状态的特定多肽/bFGF复合体的培养容器。
干燥工序也可以是与去除工序一同进行的工序。即，充分去除bFGF含有溶液的去除工序还兼备干燥工序，经由本工序，可以得到具备干燥状态的特定多肽/bFGF复合体的培养容器。此外，干燥工序例如也可以是进行低湿度环境下的静置、送风干燥、冷冻干燥等干燥处理的工序。这些干燥处理可以在进行粘附工序和结合工序之后继续进行，也可以在进行去除工序后进行。
本公开的培养容器的制造方法也可以包括使实质上不含有bFGF的液体浸渗到粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体中的浸渗工序。通过进行浸渗工序，可以得到具备保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的特定多肽/bFGF复合体的培养容器。浸渗工序可以在进行粘附工序和结合工序之后继续进行，也可以在进行去除工序之后进行，也可以在进行干燥工序之后进行。
作为上述实质上不含有bFGF的液体，例如可举出磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水；哺乳动物细胞用基本培养基并且不含有bFGF的液体培养基；从哺乳动物细胞用基本培养基除去了bFGF的液体培养基；等。
浸渗工序并非是为了得到具备保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的特定多肽/bFGF复合体的培养容器而必需的工序。例如，在结合工序中与特定多肽接触的bFGF含有溶液中的bFGF与特定多肽结合，并且与特定多肽接触的溶液变成实质上不含有bFGF时，可以得到具备保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的特定多肽/bFGF复合体的培养容器。
根据本公开的培养容器的制造方法，可以得到以下说明的培养容器。
＜培养容器＞
本公开的培养容器具备多肽，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合bFGF，通过第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性。即，本公开的培养容器具备粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体作为用于使细胞生长的支架。
本公开的培养容器作为一种实施方式而使用于本公开的培养方法的第1实施方式中。即，容纳实质上不含有bFGF的液体培养基而用于培养多能干细胞。该情况下，本公开的培养容器所具备的特定多肽/bFGF复合体成为用于使多能干细胞生长的支架。另外，本公开的培养容器的用途并不限定于多能干细胞的培养用途，也可以使用于培养成体干细胞、构成生物体的体细胞、体细胞的前体细胞等。
在本公开的培养容器中，特定多肽结合bFGF，由此抑制bFGF的分解、变性或失活。而且，多能干细胞一边与特定多肽/bFGF复合体接触一边进行培养，因此受到特定多肽/bFGF复合体中的bFGF的作用而维持未分化状态并且稳定地生长。因此，根据本公开的培养容器，能够在实质上不含有bFGF的液体培养基中培养多能干细胞，并且，无需以将bFGF补充到培养环境为目的而频繁地更换含有bFGF的液体培养基和/或在培养中向液体培养基添加bFGF。
在本公开的培养容器中，通过特定多肽/bFGF复合体粘附于培养容器，从而在更换液体培养基时，特定多肽/bFGF复合体不易从培养容器丢失。并且，特定多肽/bFGF复合体中的bFGF通过与特定多肽结合而抑制分解、变性或失活。因此，根据本公开的培养容器，能够一边更换实质上不含有bFGF的液体培养基，一边在相同的培养容器内持续地培养多能干细胞。
在本公开的培养容器中，用于使细胞生长的支架(还简称为“支架”。)也可以含有特定多肽/bFGF复合体以外的其他成分。作为其他成分，可举出特定多肽本身(未结合bFGF状态的特定多肽)；层粘连蛋白、明胶等公知的细胞外基质；附着于这些细胞外基质的细胞生长因子；等。
本公开的培养容器的一种实施方式中，粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体即支架为干燥状态。该实施方式的培养容器中支架为干燥状态，因此从抑制支架所含的bFGF的分解、变性或失活的观点考虑为优选。
本公开的培养容器的一种实施方式中，粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体即支架为保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态。该实施方式的培养容器中支架保持液体，因此从容易维持特定多肽与bFGF的结合(即，通过蛋白质-蛋白质之间的一般相互作用进行的结合)的观点考虑为优选。
作为上述实质上不含有bFGF的液体，例如可举出磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水；哺乳动物细胞用基本培养基并且不含有bFGF的液体培养基；从哺乳动物细胞用基本培养基除去了bFGF的液体培养基；等。
本公开中，关于用于使细胞生长的支架以及细胞培养用支架材料，“干燥状态”并不限定于完全不存在液体成分的状态，还表示在进行结合工序之后，在通过抽吸处理进行的去除工序中能够实现的程度以下的液体成分被丢失的状态，表示具有液体吸收性能的状态。本公开中，关于用于使细胞生长的支架以及细胞培养用支架材料，“湿润状态”是表示并非“干燥状态”的状态，表示充分吸收了液体的状态。
＜细胞培养用支架材料＞
根据本公开，还提供一种细胞培养用支架材料(还简称为“支架材料”。)。本公开的支架材料含有多肽，所述多肽具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在第1区域结合有bFGF并且具有细胞粘附活性。即，本公开的支架材料为含有特定多肽/bFGF复合体的支架材料。
本公开的支架材料使用于在培养容器中设置用于使细胞生长的支架。通过本公开的支架材料设置在培养容器的支架作为维持多能干细胞的未分化状态并且使多能干细胞稳定地生长的支架而发挥作用。另外，本公开的支架材料的用途并不限定于多能干细胞的培养用途，也可以使用于培养成体干细胞、构成生物体的体细胞、体细胞的前体细胞等。
如果使用本公开的支架材料来培养多能干细胞，则能够在实质上不含有bFGF的液体培养基中使其维持未分化状态并且稳定地生长。
本公开的支架材料也可以含有特定多肽/bFGF复合体以外的其他成分。作为其他成分，可举出特定多肽本身(未结合bFGF状态的特定多肽)；层粘连蛋白、明胶等公知的细胞外基质；附着于这些细胞外基质的细胞生长因子；等。
本公开的支架材料的一种实施方式为干燥状态的支架材料。该实施方式的支架材料为干燥状态，因此从抑制支架材料所含的bFGF的分解、变性或失活的观点考虑为优选。作为该实施方式的支架材料的使用方式，可举出将支架材料溶解或分散于液体(例如，磷酸盐缓冲液)之后注入或涂布于培养容器。由此，含有粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体的支架形成在培养容器的培养表面。
本公开的支架材料的一种实施方式为保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的支架材料。该实施方式的支架材料保持液体，因此从容易维持特定多肽与bFGF的结合(即，通过蛋白质-蛋白质之间的一般相互作用进行的结合)的观点考虑为优选。作为该实施方式的支架材料的使用方式，例如可举出将支架材料薄薄地载置或涂布于培养容器的培养表面。由此，含有粘附于培养容器的特定多肽/bFGF复合体的支架形成在培养容器的培养表面。
作为上述实质上不含有bFGF的液体，例如可举出磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水；哺乳动物细胞用基本培养基并且不含有bFGF的液体培养基；从哺乳动物细胞用基本培养基除去了bFGF的液体培养基；等。
本公开的支架材料能够通过使含有bFGF的溶液(bFGF含有溶液)与具有结合bFGF的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽(特定多肽)接触，并在第1区域结合bFGF的结合工序来制造。本工序例如包括使bFGF含有溶液与特定多肽接触，并在温度25℃～40℃下静置30分钟～24小时。
结合工序中使用的bFGF含有溶液将bFGF溶解或分散于磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水、注射用水、离子交换水等来制备即可。并且，也可以将含有bFGF的液体培养基用作bFGF含有溶液。bFGF含有溶液的bFGF浓度例如为1ng/mL～10000ng/mL，优选为10ng/mL～1000ng/mL，更优选为100ng/mL～1000ng/mL。
结合工序中的bFGF含有溶液的使用量优选每100分子的特定多肽，bFGF成为1分子～10分子的量。作为容积，优选浸没特定多肽整体的程度以上的量。
从抑制bFGF混入在培养细胞时使用的液体培养基的观点考虑，上述制造方法优选还包括去除与特定多肽接触的bFGF含有溶液的去除工序。本工序例如包括使用玻璃器皿抽吸bFGF含有溶液。也可以在去除bFGF含有溶液之后，用磷酸盐缓冲液等来清洗特定多肽/bFGF复合体。
上述制造方法也可以包括对特定多肽/bFGF复合体进行干燥的干燥工序。通过进行本工序，可以得到干燥状态的支架材料。
干燥工序也可以是与去除工序一同进行的工序。即，充分去除bFGF含有溶液的去除工序还兼备干燥工序，经由本工序，可以得到干燥状态的支架材料。此外，干燥工序例如也可以是进行低湿度环境下的静置、送风干燥、冷冻干燥等干燥处理的工序。这些干燥处理可以在进行结合工序之后继续进行，也可以在进行去除工序之后进行。
上述制造方法也可以包括使实质上不含有bFGF的液体浸渗于特定多肽/bFGF复合体中的浸渗工序。通过进行本工序，可以得到保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的支架材料。浸渗工序可以在进行结合工序之后继续进行，也可以在进行去除工序之后进行，也可以在进行干燥工序之后进行。
作为上述实质上不含有bFGF的液体，例如可举出磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、生理盐水；哺乳动物细胞用基本培养基并且不含有bFGF的液体培养基；从哺乳动物细胞用基本培养基除去了bFGF的液体培养基；等。
浸渗工序并是非为了得到保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的支架材料而必需的工序。例如，在结合工序中与特定多肽接触的bFGF含有溶液中的bFGF与特定多肽结合，并且与特定多肽接触的溶液变成实质上不含有bFGF时，可以得到保持了实质上不含有bFGF的液体的湿润状态的支架材料。
实施例
以下，通过实施例对发明的实施方式进行详细说明，但发明的实施方式并不限定于这些实施例。
下述中，关于物质浓度，“M”表示摩尔浓度，1M＝1mol/L。并且，关于培养基的物质浓度，除非另有说明，否则“％”为“v/v％”。
下述中，“PBS”表示磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(phosphate bufferedsaline))，“EDTA”表示乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)。
在下述各实施例中，作为bFGF，使用了重组型bFGF(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)。
＜实施例1：特定多肽的制备＞
通过利用了PCR(聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction))的常规方法，扩增了对序列号16所示的氨基酸序列进行编码的DNA。以下，将由序列号16所示的氨基酸序列组成的多肽称为RCP-1。RCP-1的氨基酸序列对应于序列号1所示的氨基酸序列的第1个～第55个、第270个～第277个以及第295个～第373个，第274个半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基，N末端附加有通过重组技术制作多肽时附加的甲硫氨酸残基(参照表2。在SMB结构域、RGD基序以及肝素结合结构域上标注下划线。)。即，RCP-1的氨基酸序列为在序列号9所示的氨基酸序列的N末端附加了甲硫氨酸残基的序列。RCP-1的GRAVY值为-1.072。
表2
※“.”表示将多肽与序列号1对准时没有所对应的氨基酸残基。
在利用预先用限制酶NcoI(TAKARA BIO INC.)进行了切断处理的载体pET-28b(+)中，使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.，“In-Fusion”为注册商标)***上述DNA，从而构建了RCP-1的表达载体。通过序列分析确认了表达载体的序列。
通过常规方法将所制作的RCP-1表达载体导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS(Novagen公司)中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，并在37℃下孵育了16小时。通过菌落直接PCR法确认载体的导入之后，添加1mM的异丙基-β-硫代半乳糖苷(Wako PureChemical Industries,Ltd.)，在37℃下振荡培养5小时，从而诱导了多肽的表达。
通过离心处理回收菌体，将菌体重悬于清洗用缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH7.6)中。通过超声波破坏菌体后，在4℃下以15000rpm离心30分钟，并回收了不溶性成分。用含有0.5％Triton X100的清洗用缓冲液清洗后，将其重悬于低浓度尿素缓冲液(低尿素缓冲液(Low UreaBuffer)：20mM Tris，150mM NaCl，2M尿素，pH7.6)中，并施加了超声波。通过离心处理回收不溶性成分之后，添加高浓度尿素缓冲液(高尿素缓冲液(High UreaBuffer)：20mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，pH7.6)，并施加超声波而溶解了不溶性成分。
使用AKTA Explorer100(GE Healthcare公司)以及HiTrap Heparin HP 5mL(GEHealthcare公司，“HiTrap”为注册商标)，对含有通过上述方法得到的RCP-1的溶液进行了纯化。使用高浓度尿素缓冲液作为结合用缓冲液，使用高盐浓度调节缓冲液(20mM Tris，1MNaCl，8M尿素，pH7.6)作为洗脱用缓冲液来进行逐步洗脱，从而对RCP-1进行了纯化。
使用一次性透析盒Slide-A-Lyzer(分级分子量3.5K)(Pierce公司，“Slide-A-Lyzer”为注册商标)透析了纯化后的RCP-1溶液。对于透析外液，将透析用缓冲液(PBS，1.5MNaCl，0.5M L-精氨酸，1mM EDTA，pH7.4)作为基本缓冲液，并通过阶段透析去除了尿素。使用分光光度计NanoDrop(注册商标，Thremo Fisher Scientific公司)测定最终透析产物的吸光度(波长280nm)，并对RCP-1浓度进行了定量。
以下实施例中使用了上述最终透析产物。在以下实施例中，在试样制备中使用的RCP-1表示上述最终透析产物。
＜实施例2：RCP-1与bFGF的结合性的评价(1)＞
将Essential8培养基(含有100ng/mL的bFGF，Life Technologies,Inc.)和RCP-1混合成RCP-1浓度成为表3所示的浓度，并在37℃下静置了24小时。24小时后，对于混合物整体使用人bFGF ELISA试剂盒(RayBiotech公司)对bFGF进行了定量。将结果示于表3。
使用肝素、葡聚糖硫酸钠或市售的重组型玻连蛋白即VTN-N(Life Technologies,Inc.)来代替RCP-1进行了与上述相同的试验。已知肝素和葡聚糖硫酸钠与bFGF结合而使bFGF变得稳定。VTN-N的氨基酸序列对应于序列号1所示的氨基酸序列的第43个～第459个。
表3
向Essential8培养基中不添加任何物质时，24小时后约9成的bFGF变为无法通过ELISA法检测到的形态(认为被分解、变性或失活。)，但通过添加肝素或葡聚糖硫酸钠，bFGF的上述变化几乎完全得到抑制。
将VTN-N添加到Essential8培养基中时，24小时后的bFGF量为与不添加任何物质时相同程度或其以下。该结果表示VTN-N无法与bFGF结合，无法使bFGF变得稳定。
将RCP-1添加到Essential8培养基中时，24小时后的bFGF量为初始值的约3成～4成，而且RCP-1的浓度越高，24小时后的bFGF量越多。该结果表示RCP-1与bFGF结合而使bFGF稳定。
＜实施例3：RCP-1与bFGF的结合性的评价(2)＞
向透析用缓冲液中添加RCP-1，从而制备了RCP-1浓度为25μg/mL的RCP-1溶液。另外向注射用水中添加bFGF，从而制备了bFGF浓度为100ng/mL的bFGF水溶液，此外，用注射用水制备了阶段稀释2倍的bFGF水溶液、稀释10倍的bFGF水溶液以及稀释100倍的bFGF水溶液。
向已进行等离子体处理的聚苯乙烯制Falcon96孔板(Corning Incorporated，“Falcon”为注册商标)的各孔中各加入64μL的RCP-1溶液，在37℃下静置2小时，由此将RCP-1粘附于各孔的内表面。从静置2小时后的各孔抽吸去除上清液，向各孔中添加200μL的bFGF水溶液，并在37℃下静置了24小时。
静置24小时后，从各孔抽吸去除上清液，向各孔中添加用离子交换水稀释成20％的IMMUNOBLOCK(阻断剂，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)300μL，在25℃下静置了30分钟。之后，从各孔抽吸去除上清液，用PBS-T(掺合0.5％Tween-20的PBS)清洗3次后，使用人bFGFELISA试剂盒(RayBiotech公司)测定了吸光度(波长450nm)。将结果示于图1。
使用重组型玻连蛋白VTN-N(Life Technologies,Inc.)来代替RCP-1进行了与上述相同的试验。
如图1所示，使bFGF水溶液与各孔内的VTN-N接触时，未能确认吸光度的上升。另一方面，使bFGF水溶液与各孔内的RCP-1接触时，吸光度随着bFGF水溶液的浓度而上升。该结果表示bFGF与粘附于各孔的内表面的RCP-1结合。
＜实施例4：与bFGF结合的RCP-1对iPS细胞带来的作用的评价(1)＞
作为多能干细胞，使用了从iPS PORTAL,Inc.(Kyoto Mikuruma,448-5Kajii-cho,Imadegawa-Sagaru,Kawaramachi-dori,Kamigyo-ku,Kyoto,Japan)分售的人iPS细胞201B7。
使用TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司，“TeSR”为注册商标)作为液体培养基，使用以重组型玻连蛋白VTN-N(Life Technologies,Inc.)涂布的培养容器，在温度37℃/CO2浓度5％(v/v，以下相同)的恒温箱中进行了人iPS细胞的维持培养。除了接种iPS细胞后的第二天，每天更换了液体培养基。使用胰蛋白酶替代物TrypLE Select(InvitrogenCorporation)在37℃下处理5分钟，并分离成单细胞来进行了传代操作。向分离成单细胞时的液体培养基中添加了最终浓度为10μM的Y-27362((R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-环己烷甲酰胺·2HCl·H2O((R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide·2HCl·H2O)，Rho结合激酶抑制剂，Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)。
将进行维持培养的人iPS细胞分离成单细胞，使其悬浮于Essential8培养基(含有100ng/mL的bFGF)或Essential7培养基(除了不含有bFGF以外，为与Essential8相同的组成)，从而制备了细胞悬浮液。
向透析用缓冲液中添加RCP-1，从而制备了RCP-1浓度为25μg/mL的RCP-1溶液。向已进行等离子体处理的聚苯乙烯制Falcon6孔板(Corning Incorporated，“Falcon”为注册商标)的各孔中各加入1mL的RCP-1溶液，在37℃下静置2小时，由此使RCP-1粘附于各孔的内表面。
通过上述处理，得到在内表面具备RCP-1的孔。此外，在一部分孔中抽吸去除上清液之后添加Essential8培养基2mL，在37℃下静置24小时，并使bFGF与各孔内表面的RCP-1结合。以下，将具备RCP-1的孔称为“RCP-1孔”，而且将进行了bFGF处理的孔称为“bFGF处理RCP-1孔”。
在RCP-1孔以及bFGF处理RCP-1孔中抽吸去除上清液之后，接种了前述细胞悬浮液，以使细胞数成为50000个/孔。之后，除了接种后的第二天，一边每天更换液体培养基(Essential8培养基或Essential7培养基)一边培养了人iPS细胞。将接种5天后的细胞数示于表4。并且，将接种5天后的细胞的光学显微镜图像示于图2。
使用重组型玻连蛋白VTN-N(Life Technologies,Inc.)来代替RCP-1进行了与上述相同的试验。以下，将具备VTN-N的孔称为“VTN-N孔”，而且将进行了bFGF处理的孔称为“bFGF处理VTN-N孔”。
表4
如表4所示，无论是在使用了RCP-1孔的情况下还是在使用了VTN-N孔的情况下，若在含有bFGF的液体培养基(Essential8培养基)中培养人iPS细胞，则会稳定地生长，细胞数分别生长为2.4×105、2.5×105。相对于此，无论是在使用了RCP-1孔的情况下还是在使用了VTN-N孔的情况下，若在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养人iPS细胞，则细胞生长被抑制，细胞数分别止于8.5×104(约35％)、7.2×104(约29％)。
在使用了bFGF处理VTN-N孔的情况下，若在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养人iPS细胞，则细胞生长进一步被抑制，细胞数止于5.7×104(约23％)。另一方面，在使用了bFGF处理RCP-1孔的情况下，即使在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养人iPS细胞，也会稳定地生长，细胞数为2.6×105(约108％)。
以上结果表示粘附于培养容器的内表面的RCP-1与bFGF结合而使bFGF变得稳定，以及通过来自与RCP-1结合的bFGF的信号促进iPS细胞的生长。
从图2可知，当使用bFGF处理RCP-1孔并在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养人iPS细胞时，人iPS细胞上具有特征性形态(核的占有比例高且细胞的边界不明确)，维持了未分化状态。
＜实施例5：与bFGF结合的RCP-1对iPS细胞带来的作用的评价(2)＞
向Essential7培养基中添加bFGF，从而制备了bFGF浓度为1000ng/mL或100ng/mL的液体培养基。
通过与实施例4相同的方法，准备在内表面具备RCP-1的孔(RCP-1孔)，向各孔中添加上述液体培养基2mL，在37℃下静置24小时，并使bFGF与各孔内表面的RCP-1结合。抽吸去除上清液之后，在各孔中接种了将人iPS细胞悬浮于Essential7培养基而成的细胞悬浮液，以使细胞数成为50000个/孔。之后，除了接种后的第二天，一边每天更换液体培养基(Essential7培养基)一边培养了人iPS细胞。将接种5天后的细胞数示于表5。
表5
如表5所示，通过使用具备结合有bFGF的RCP-1的孔，即使液体培养基不含有bFGF，人iPS细胞也得到稳定地生长。
＜实施例6：与bFGF结合的RCP-1对iPS细胞带来的作用的评价(3)＞
剥离回收在实施例4中培养的人iPS细胞，并使用RNA纯化试剂盒NucleoSpin RNA(TAKARA BIO INC.)纯化了mRNA。使用逆转录反应用试剂PrimeScript RT Master Mix(TAKARA BIO INC.，“PrimeScript”为注册商标)将所得的mRNA逆转录成cDNA，使用实时PCR***TaqMan人干细胞的全能性面板阵列(Array Human Stem Cell Pluripotency Panel)(Life Technologies,Inc.，“TaqMan”为注册商标)，通过循环比较法(ΔΔCT法)对90种基因的表达量进行了相对评价。将结果示于图3。
如图3所示，使用RCP-1孔并在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养的人iPS细胞与使用RCP-1孔并在含有bFGF的液体培养基(Essential8培养基)中培养的人iPS细胞的基因表达模式不同，该结果表示在不存在bFGF的条件下进行了人iPS细胞的分化。
相对于此，使用bFGF处理RCP-1孔并在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养的人iPS细胞显示出与使用RCP-1孔并在含有bFGF的液体培养基(Essential8培养基)中培养的人iPS细胞同等的基因表达模式。该结果表示，bFGF处理RCP-1孔具有与含有bFGF的液体培养基(Essential8培养基)相同程度地维持人iPS细胞的性质的能力。
＜实施例7：培养过程的液体培养基中所含的bFGF量的评价＞
通过与实施例4相同的方法，准备了具备RCP-1的孔(RCP-1孔)和还进行了bFGF处理的孔(bFGF处理RCP-1孔)。
将进行维持培养的人iPS细胞分离成单细胞，使其悬浮于Essential8培养基或Essential7培养基，从而制备了细胞悬浮液。
在RCP-1孔以及bFGF处理RCP-1孔中接种了上述细胞悬浮液，以使细胞数成为50000个/孔。回收接种1、2、3天后的培养上清液，使用人bFGF ELISA试剂盒(RayBiotech公司)测定各培养上清液的吸光度(波长450nm)，并对各培养上清液中的bFGF量进行了定量。将结果示于表6。
表6
如表6所示，当使用bFGF处理RCP-1孔并在不含bFGF的液体培养基(Essential7培养基)中培养了人iPS细胞时，培养上清液中未检测到bFGF。该结果表示与RCP-1结合的bFGF在细胞培养过程中不转移到液体培养基中。
于2015年8月13日申请的日本专利申请2015-159967号的公开，其全部内容通过参照收入本说明书中。
本说明书中所记载的所有文献、专利申请以及技术标准，以与具体且个别记载了通过参照收入个别文献、专利申请以及技术标准的情况相同程度地，通过参照收入本说明书中。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 多能干细胞的培养方法、培养容器的制造方法、培养容器以及细胞培养用支架材料
<130> FS-F06376-00
<150> JP 2015-159967
<151> 2015-08-13
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Tyr Thr Val Tyr Asp Asp Gly Glu Glu
50 55 60
Lys Asn Asn Ala Thr Val His Glu Gln Val Gly Gly Pro Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ser Asp Leu Gln Ala Gln Ser Lys Gly Asn Pro Glu Gln Thr Pro Val
85 90 95
Leu Lys Pro Glu Glu Glu Ala Pro Ala Pro Glu Val Gly Ala Ser Lys
100 105 110
Pro Glu Gly Ile Asp Ser Arg Pro Glu Thr Leu His Pro Gly Arg Pro
115 120 125
Gln Pro Pro Ala Glu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Lys Pro Phe Asp Ala
130 135 140
Phe Thr Asp Leu Lys Asn Gly Ser Leu Phe Ala Phe Arg Gly Gln Tyr
145 150 155 160
Cys Tyr Glu Leu Asp Glu Lys Ala Val Arg Pro Gly Tyr Pro Lys Leu
165 170 175
Ile Arg Asp Val Trp Gly Ile Glu Gly Pro Ile Asp Ala Ala Phe Thr
180 185 190
Arg Ile Asn Cys Gln Gly Lys Thr Tyr Leu Phe Lys Gly Ser Gln Tyr
195 200 205
Trp Arg Phe Glu Asp Gly Val Leu Asp Pro Asp Tyr Pro Arg Asn Ile
210 215 220
Ser Asp Gly Phe Asp Gly Ile Pro Asp Asn Val Asp Ala Ala Leu Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala His Ser Tyr Ser Gly Arg Glu Arg Val Tyr Phe Phe Lys
245 250 255
Gly Lys Gln Tyr Trp Glu Tyr Gln Phe Gln His Gln Pro Ser Gln Glu
260 265 270
Glu Cys Glu Gly Ser Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met
275 280 285
Met Gln Arg Asp Ser Trp Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly
290 295 300
Arg Thr Ser Ala Gly Thr Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp
305 310 315 320
His Gly Val Pro Gly Gln Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr
325 330 335
Ile Ser Gly Met Ala Pro Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe
340 345 350
Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg
355 360 365
Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser
370 375 380
Leu Phe Ser Ser Glu Glu Ser Asn Leu Gly Ala Asn Asn Tyr Asp Asp
385 390 395 400
Tyr Arg Met Asp Trp Leu Val Pro Ala Thr Cys Glu Pro Ile Gln Ser
405 410 415
Val Phe Phe Phe Ser Gly Asp Lys Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Arg Thr
420 425 430
Arg Arg Val Asp Thr Val Asp Pro Pro Tyr Pro Arg Ser Ile Ala Gln
435 440 445
Tyr Trp Leu Gly Cys Pro Ala Pro Gly His Leu
450 455
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMB domain
<400> 2
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln
35 40
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heparin Binding Domain
<400> 3
Pro Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg
1 5 10 15
Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
20 25 30
<210> 4
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMB domain and RGD motif
<400> 4
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu
50 55
<210> 5
<211> 87
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.5
<400> 5
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Pro Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln
50 55 60
Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His
65 70 75 80
Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
85
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.6
<400> 6
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Gly Val Pro Gly Gln Val Asp Ala Ala
50 55 60
Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro Arg Pro Ser Leu
65 70 75 80
Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser
85 90 95
Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.7
<400> 7
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp
50 55 60
His Gly Val Pro Gly Gln Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr
65 70 75 80
Ile Ser Gly Met Ala Pro Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe
85 90 95
Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg
100 105 110
Gly Arg Asn Gln Asn
115
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.8
<400> 8
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
50 55 60
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
65 70 75 80
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
85 90 95
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
100 105 110
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
115 120 125
<210> 9
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.9
<400> 9
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser Glu
50 55 60
Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr Arg
65 70 75 80
Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln Val
85 90 95
Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro Arg
100 105 110
Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly
115 120 125
Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
130 135 140
<210> 10
<211> 159
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.10
<400> 10
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser Ser
50 55 60
Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
100 105 110
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
115 120 125
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
130 135 140
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
145 150 155
<210> 11
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.11
<400> 11
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser Ser
50 55 60
Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
100 105 110
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
115 120 125
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
130 135 140
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser
145 150 155 160
Arg Arg Pro Ser Arg
165
<210> 12
<211> 175
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.12
<400> 12
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser Ser
50 55 60
Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
100 105 110
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
115 120 125
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
130 135 140
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser
145 150 155 160
Arg Arg Pro Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser Leu Phe Ser Ser Glu
165 170 175
<210> 13
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.13
<400> 13
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser Ser
50 55 60
Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
100 105 110
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
115 120 125
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
130 135 140
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser
145 150 155 160
Arg Arg Pro Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser Leu Phe Ser Ser Glu Glu
165 170 175
Ser Asn Leu Gly Ala Asn Asn Tyr Asp
180 185
<210> 14
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.14
<400> 14
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser Ser
50 55 60
Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
100 105 110
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
115 120 125
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
130 135 140
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser
145 150 155 160
Arg Arg Pro Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser Leu Phe Ser Ser Glu Glu
165 170 175
Ser Asn Leu Gly Ala Asn Asn Tyr Asp Asp Tyr Arg Met Asp Trp Leu
180 185 190
Val Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ile Gln Ser Val Phe Phe Phe Ser Gly
195 200 205
Asp Lys Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Arg Thr Arg Arg Val Asp Thr Val
210 215 220
Asp Pro Pro Tyr Pro Arg Ser Ile Ala Gln Tyr Trp Leu Gly Ser Pro
225 230 235 240
Ala Pro Gly His Leu
245
<210> 15
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> No.15
<400> 15
Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val Asp
1 5 10 15
Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys Cys
20 25 30
Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val
35 40 45
Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Pro Ser Gln Glu Glu Cys Glu Gly Ser
50 55 60
Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser
65 70 75 80
Trp Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly
85 90 95
Thr Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly
100 105 110
Gln Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala
115 120 125
Pro Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg
130 135 140
Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
145 150 155 160
Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser Leu Phe Ser Ser Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Leu Gly Ala Asn Asn Tyr Asp Asp Tyr Arg Met Asp Trp
180 185 190
Leu Val Pro Ala Thr Cys Glu Pro Ile Gln Ser Val Phe Phe Phe Ser
195 200 205
Gly Asp Lys Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Arg Thr Arg Arg Val Asp Thr
210 215 220
Val Asp Pro Pro Tyr Pro Arg Ser Ile Ala Gln Tyr Trp Leu Gly Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Gly His Leu
245
<210> 16
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RCP-1
<400> 16
Met Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe Asn Val
1 5 10 15
Asp Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln Ser Cys
20 25 30
Cys Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp
35 40 45
Val Phe Thr Met Pro Glu Asp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Glu Gly Ser
50 55 60
Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr
65 70 75 80
Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln
85 90 95
Val Asp Ala Ala Met Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro
100 105 110
Arg Pro Ser Leu Ala Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys
115 120 125
Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn
130 135 140

Claims (31)

1.一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，
所述培养工序中，在实质上不含有碱性成纤维细胞生长因子的液体培养基中，使多肽和多能干细胞接触而培养所述多能干细胞，所述多肽具有结合碱性成纤维细胞生长因子的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在所述第1区域结合碱性成纤维细胞生长因子，通过所述第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性。
2.根据权利要求1所述的多能干细胞的培养方法，其中，
所述第1区域具有负电荷。
3.根据权利要求1或2所述的多能干细胞的培养方法，其中，
所述第1区域为包含下述序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，所述第2区域为包含下述序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域，
序列A-1：以序列号2所表示的氨基酸序列，
序列A-2：与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列A-3：相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列，
序列B-2：与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列，
序列B-3：相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，
所述多肽还具有RGD基序。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，
所述多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其在所述培养工序之前包括：
粘附工序，使具有结合碱性成纤维细胞生长因子的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽与培养容器接触，并通过所述第2区域粘附于所述培养容器；以及
结合工序，使含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液与所述多肽接触，并在所述第1区域结合碱性成纤维细胞生长因子。
7.根据权利要求6所述的多能干细胞的培养方法，其在所述培养工序之前还包括去除工序，
所述去除工序去除与所述多肽接触了的所述溶液。
8.一种多能干细胞的培养方法，其包括培养工序，
所述培养工序中，在液体培养基中，使直接或间接地粘附于培养容器的碱性成纤维细胞生长因子和粘附于培养容器且具有细胞粘附活性的多肽和多能干细胞接触而培养所述多能干细胞。
9.根据权利要求8所述的多能干细胞的培养方法，其中，
碱性成纤维细胞生长因子通过与粘附于所述培养容器且具有负电荷的材料结合，从而间接地粘附于所述培养容器。
10.根据权利要求8所述的多能干细胞的培养方法，其中，
碱性成纤维细胞生长因子通过与具有负电荷的所述培养容器结合，从而直接粘附于所述培养容器。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，
所述液体培养基为实质上不含有碱性成纤维细胞生长因子的液体培养基。
12.一种培养容器的制造方法，其制造具备结合有碱性成纤维细胞生长因子且具有细胞粘附活性的多肽的培养容器，所述制造方法包括：
粘附工序，使具有结合碱性成纤维细胞生长因子的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域并且具有细胞粘附活性的多肽与培养容器接触，并通过所述第2区域粘附于所述培养容器，以及
结合工序，使含有碱性成纤维细胞生长因子的溶液与所述多肽接触，并在所述第1区域结合碱性成纤维细胞生长因子。
13.根据权利要求12所述的培养容器的制造方法，其还包括去除工序，
所述去除工序去除与所述多肽接触了的所述溶液。
14.根据权利要求12或13所述的培养容器的制造方法，其中，
所述溶液含有100ng/mL～1000ng/mL的范围的碱性成纤维细胞生长因子。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的培养容器的制造方法，其还包括干燥工序，
所述干燥工序对粘附于所述培养容器且结合有碱性成纤维细胞生长因子的所述多肽进行干燥。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的培养容器的制造方法，其还包括浸渗工序，
所述浸渗工序使实质上不含有碱性成纤维细胞生长因子的液体浸渗到粘附于所述培养容器且结合有碱性成纤维细胞生长因子的所述多肽中。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，
所述第1区域为包含下述序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，所述第2区域为包含下述序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域，
序列A-1：以序列号2所表示的氨基酸序列，
序列A-2：与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列A-3：相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列，
序列B-2：与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列，
序列B-3：相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，
所述多肽还具有RGD基序。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的培养容器的制造方法，其中，
所述多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
20.一种培养容器，其具备多肽，
所述多肽具有结合碱性成纤维细胞生长因子的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在所述第1区域结合碱性成纤维细胞生长因子，通过所述第2区域粘附于培养容器，并且所述多肽具有细胞粘附活性。
21.根据权利要求20所述的培养容器，其中，
所述多肽为干燥状态。
22.根据权利要求20所述的培养容器，其中，
所述多肽为保持了实质上不含有碱性成纤维细胞生长因子的液体的湿润状态。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的培养容器，其中，
所述第1区域为包含下述序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，所述第2区域为包含下述序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域，
序列A-1：以序列号2所表示的氨基酸序列，
序列A-2：与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列A-3：相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列，
序列B-2：与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列，
序列B-3：相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的培养容器，其中，
所述多肽还具有RGD基序。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的培养容器，其中，
所述多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
26.一种细胞培养用支架材料，其含有多肽，
所述多肽具有结合碱性成纤维细胞生长因子的第1区域以及粘附于培养容器的第2区域，在所述第1区域结合有碱性成纤维细胞生长因子，并且所述多肽具有细胞粘附活性。
27.根据权利要求26所述的细胞培养用支架材料，其为干燥状态。
28.根据权利要求26所述的细胞培养用支架材料，其为保持了实质上不含有碱性成纤维细胞生长因子的液体的湿润状态。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，
所述第1区域为包含下述序列A-1、序列A-2或序列A-3中的任一序列的区域，所述第2区域为包含下述序列B-1、序列B-2或序列B-3中的任一序列的区域，
序列A-1：以序列号2所表示的氨基酸序列，
序列A-2：与以序列号2所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列A-3：相对于以序列号2所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有与碱性成纤维细胞生长因子的结合能力的氨基酸序列，
序列B-1：以序列号3所表示的氨基酸序列，
序列B-2：与以序列号3所表示的氨基酸序列具有80％以上的同源性，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列，
序列B-3：相对于以序列号3所表示的氨基酸序列，添加、替换或缺失了1个或多个氨基酸残基，并且具有对培养容器的粘附能力的氨基酸序列。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，
所述多肽还具有RGD基序。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，
所述多肽由80个～500个氨基酸残基组成。
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