CN107849538A - 用于制造神经干细胞的方法及其用途 - Google Patents

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CN107849538A CN201680025769.6A CN201680025769A CN107849538A CN 107849538 A CN107849538 A CN 107849538A CN 201680025769 A CN201680025769 A CN 201680025769A CN 107849538 A CN107849538 A CN 107849538A
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Abstract

根据一些实施方案，本文提供一种用于产生诱导的神经干细胞(iNSC)的方法，所述方法可包括以下步骤中的一个或更多个：提供体细胞；将编码Sox2的核酸引入(例如，通过转染或转导)所述体细胞中，借此所述细胞表达Sox2；和然后使所述体细胞转分化(例如，通过使所述细胞在神经祖细胞培养基中生长)，以由此制造所述诱导的神经干细胞。在一些实施方案中，所述转分化进行1至10天、1至5天、1至3天或者12至24或48小时的时间。

Description

用于制造神经干细胞的方法及其用途
相关申请
本申请要求2015年3月4日提交的美国临时专利申请序列号62/128,247的权益，其公开内容通过引用以其全部并入本文。
背景
脑癌仍处在最有挑战性的需***之中。每年超过10,000名患者被诊断患有最常见的原发性脑肿瘤——成胶质细胞瘤(GBM)。通常用外科手术和化学放射疗法来治疗GBM，但不幸的是在当前的治疗选项下该疾病通常是致命的。复发的平均时间仅为6个月，并且GBM患者仅存活平均12-15个月。
神经干细胞(NSC)具有归巢至实体并使GBM沉积物弥漫的独特的固有能力，并且用各种细胞毒性剂工程改造的NSC已显示使GBM异种移植减少70-90％，同时显著延长荷瘤小鼠的存活。然而，脑中天然存在极少数量的NSC，并且NSC存在于皮质内的深处。
细胞重编程的出现已开启了细胞疗法的新途径，但遭受限制。例如，成纤维细胞去分化成诱导的多能干细胞(iPSC)并且然后再分化至所需治疗性细胞类型是费时的过程，iPSC生成的效率低，并且仍有关于由移植iPSC或衍生物形成癌性畸胎瘤的重大安全顾虑。
转分化(TD)是将细胞直接转化成不同谱系的分化体细胞而不经过中间iPSC阶段的方法。通过TD的这种直接转化消除了与iPSC状态相关联的安全顾虑，并且允许更快生成所需的治疗性细胞类型。
已通过TD产生了神经干细胞，其被称为诱导的神经干细胞(iNSC)。在2012年，Matsui等人证实可通过使用四种山中因子(Yamanaka factor)使人成纤维细胞朝向iPSC部分重编程来在20天内实现h-iNSC生成。还通过在成纤维细胞中表达Sox2来实现h-iNSC生成，但这种策略需要在特定的饲养细胞上培养40天以获得用于扩展和传代的h-iNSC。
仍需要可快速提供在基于细胞的疗法中使用的工程改造的NSC的替代方法。
概述
根据一些实施方案，本文提供一种用于产生诱导的神经干细胞(iNSC)的方法，所述方法可包括以下步骤的一个或更多个：提供体细胞；将编码Sox2的核酸引入(例如，通过转染或转导)所述体细胞中，借此所述细胞表达Sox2；和然后使所述体细胞转分化(例如，通过使所述细胞在神经祖细胞培养基中生长)，以由此制造所述诱导的神经干细胞。在一些实施方案中，转分化进行1至10天、1至5天、1至3天或者12至24或48小时的时间。
在一些实施方案中，未使用另一转分化因子来转染或转导细胞。
在一些实施方案中，体细胞是成纤维细胞(例如，皮肤成纤维细胞)。
在一些实施方案中，所述方法包括用包含编码Sox2的所述核酸的慢病毒载体转导所述体细胞。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括用治疗剂或报道分子装载所述诱导的神经干细胞。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将诱导的神经干细胞封装于水凝胶或生物可降解的支架基质中，或者接种在支架上。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述诱导的神经干细胞施用于有需要的受试者(例如，人受试者)。在一些实施方案中，诱导的神经干细胞相对于所述受试者是同种异体的。在一些实施方案中，诱导的神经干细胞相对于所述受试者是同源的。在一些实施方案中，诱导的神经干细胞相对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，受试者需要治疗脑癌。
在一些实施方案中，诱导的神经干细胞相对于所述受试者是自体的并且其中所述施用在所述提供体细胞之后进行1、2、3或4至7、10、14或21天。
进一步提供如本文教导的诱导的神经干细胞用于治疗脑癌的用途。还提供如本文教导的诱导的神经干细胞在制备用于治疗脑癌的药剂中的用途。
附图简述
图1.诊断和治疗性iNSC的生成和表征。(A)用于产生h-iNSC的治疗和诊断性变体的策略的示意性描绘。将人成纤维细胞用Sox2转导并置于NSC诱导性神经祖细胞培养基中。4天后，用光学报道基因或杀肿瘤转基因扩展并转导h-iNSC。(B)人成纤维细胞和作为单层、神经球生长或用抗巢蛋白抗体染色的h-iNSC的白光和荧光显微照片。(C)显示在诱导h-iNSC生成之后不同天数时巢蛋白表达的概要图。(D)揭示NSC标志物巢蛋白的h-iNSC-GFP表达的免疫荧光染色。通过去除有丝***原由h-iNSC-GFP分化GFAP+星形细胞和Tuj1+神经元。相比之下，对于多能性标志物TRA-160或OCT4而言未观察到染色。示出仅二级抗体通道的荧光图像示于底部的行中。(E)在正常人成纤维细胞、h-iNSC和h-iPSC中的巢蛋白、Sox2、Nanog和OCT3/4表达的RT-PCR分析。
图2.归巢至GBM的工程改造的h-iNSC。(A)将h-iNSC-GFPFL接种于远离表达mCherry的人GBM细胞500μm处并且置于荧光孵化器显微镜中。每10分钟捕获延时荧光图像，持续24小时，并且用于构建揭示实时iNSC迁移的影片。(B)显示在平板接种之后0小时和24小时时h-iNSC-GFPFL或亲本人成纤维细胞朝向U87-mCFL迁移的概要图像。(C)描绘在24小时期间h-iNSC-GFPFL朝向GBM定向迁移的路径的单细胞示踪。额外的图像示出亲本人成纤维细胞的受限迁移。虚线指示GBM接种的部位。(D-F)显示由实时运动分析测定的h-iNSC或成纤维细胞朝向GBM细胞迁移的方向性(D)、距离(E)和速度(F)的概要图。(G-H)为评估h-iNSC至实体GBM的迁移，在3D悬浮***中与h-iNSC一起共培养U87GBM球状体(G)。荧光成像显示出h-iNSC-GFPFL迁移进入U87球状体中并且随着时间推移它们朝向肿瘤球状体的核心穿透(H)。
图3.移植于小鼠脑中的iNSC的体内表征。(A)展现未修饰的h-iNSC和被工程改造以表达mCherry-FLuc的h-iNSC的增殖的概要图。(B-C)将h-iNSC植入小鼠的额叶中并且使用连续生物发光成像来监测其在3周内的持续性。概要图展现h-iNSC在25天内存留于脑中，尽管它们被逐渐清除(B)。对植入脑中后14天的h-iNSC进行的免疫荧光分析显示Nestin+和Tuj+细胞，但未观察到h-iNSC与多能性标志物Oct-4和TRA-160之间的共定位(C)。
图4.用于实体GBM的h-iNSC介导的TRAIL疗法。(A-B)描绘被工程改造以分泌促凋亡剂TRAIL并且在单层(A)中或作为漂浮神经球(B)生长的h-iNSC的生长的代表性荧光显微照片。(C)显示与治疗性h-iNSC-sTR或对照细胞以1:2或1:2的比率混合的mCherry+人U87GBM球状体的活力的3D悬浮培养物的图像和总结数据。处理后48小时通过荧光素酶成像来测定GBM球状体活力。(D)通过将h-iNSC-sTR和U87GBM细胞的混合物异种移植到SCID小鼠的实质中来进行用于实体GBM的h-iNSC-sTR疗法。(E-F)展现与对照处理小鼠相比通过h-iNSC-sTR疗法抑制了所售U87GBM进展的代表性BLI图像(E)和总结数据(F)。(G)展现与h-iNSC对照相比在h-iNSC-sTR处理动物中存活延长的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线。(H)展现在治疗之后h-iNSC-sTR中细胞毒性、分化和多能性标志物的表达的代表性图像。在治疗之后14天处死一亚组动物，并且用抗巢蛋白、TRAIL、GFAP、Tuj-1、Oct-4或TRA-160的抗体对脑切片进行染色，并且可见染色与GFP+h-iNSC-sTR之间的共定位。
图5.用于人患者来源的GBM的h-iNSC前药/酶疗法。(A-D)在两个不同的3D培养模型中测定h-iNSC-TK疗法的抗肿瘤效果。将h-iNSC-TK与GFP+GBM4患者来源的GBM细胞混合(A,B)或者相邻于已建立的GBM4球状体接种(C,D)，并且添加GCV来引发肿瘤杀伤。连续荧光图像显示通过h-iNSC-TK/GCV疗法，GBM4球状体体积呈时间依赖性地减小。(E)展现在7天内通过h-iNSC-TK/GCV疗法，GBM4球状体体积减小的概要图。(F-J)通过将h-iNSC-TK细胞注射到在小鼠的脑中已提前10天建立的GBM4肿瘤中来体内评估h-iNSC-TK疗法(F)。连续BLI显示通过h-iNSC-TK/GCV疗法显著抑制了GBM4肿瘤的进展(G)。展现用h-iNSC-TK/GCV疗法或对照h-iNSC处理的荷载GBM4肿瘤的小鼠的存活的卡普兰-迈耶存活曲线(H)。(I-J)显示在将h-iNSC对照(I)或h-iNSC-TK(J)递送到已建立的GBM4肿瘤中之后21天GBM4体积和h-iNSC-TK分布的代表性全脑和高倍放大图像。在对照处理的动物中存在大的GBM4肿瘤，并且在h-iNSC-TK处理的脑中仅检测到小的GBM4病灶。
图6.用于手术切除的弥漫性GBM的腔内h-iNSC-TK疗法。(A-C)使用3D悬浮培养物来测定合成胞外基质(sECM)封装的h-iNSC-TK针对患者来源的GBM8球状体的迁移和抗肿瘤效力(A)。发现封装于sECM中的h-iNSC-TK从基质迁移并且在接种之后3天定殖GBM8球状体(B)。代表性图像和总结数据展现与对照处理的球状体相比，封装于sECM中的h-iNSC-TK使GBM8球状体的体积显著减小(C)。(D)为模拟用于手术切除GBM的临床h-iNSC疗法，将h-iNSC-TK封装于sECM中并且在表达mCherry-FLuc的弥漫性患者来源的GBM8肿瘤的切除之后移植到外科手术腔中。(E)展现在用于术后最小GBM8肿瘤的腔内h-iNSC-TK疗法之后肿瘤复发被显著抑制的连续成像的代表性图像和总结数据。(F)经受用封装于sECM中的对照h-iNSC或h-iNSC-TK处理并移植到外科手术腔中的弥漫性GBM8患者来源的肿瘤细胞的手术切除的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。
详述
本文中引用的所有专利参考文献的公开内容以它们与本文中所阐述公开内容一致的程度通过引用特此并入。如本文中所使用，在本发明的说明书和随附权利要求书中，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a,an)”和“所述(the)”意图也包括复数形式。
如本文中所使用的“神经干细胞”指的是能够分化成诸如神经元、星形细胞和/或少突细胞的中枢神经***细胞的多能细胞。
“转分化(transdifferentiation或transdifferentiating)”是将分化体细胞直接转化成不同谱系的分化或多能体细胞而不经过中间多能干细胞(iPSC)阶段的方法。可通过将细胞暴露于一种或更多种转分化因子和/或使细胞在促进转分化成所需细胞类型的培养基中生长来进行转分化。可使用本领域已知的方法来进行转分化的监测，诸如监测指示分化体细胞和/或干细胞的标志物表达。
可从任何可及来源收集分化体细胞，所述来源诸如组织、体液(例如血液、尿液)等。在一些实施方案中，体细胞是成纤维细胞，诸如皮肤成纤维细胞。例如，可例如在伴随的外科手术期间从手术切口的边缘收集皮肤细胞，或使用作为独立手术的传统皮肤打孔收集皮肤细胞。可从任何区域，包括但不限于从头皮或前臂收集来收集皮肤。
在如本文教导的一些实施方案中，转分化进行1、2或3至8、9或10天，1、2或4至5、6或7天，1或2至3天，或12至24、48或72小时的时间。
本文中所使用的“转分化因子”是促进一种体细胞类型直接转化成另一种的诸如转录因子的蛋白质。实例包括但不限于Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Ascl1、Brn2、Myt1l、Olig2、Zic1等。在一些实施方案中，转分化方法是单因子转分化，因为仅使用一种转分化因子。
“Sox2”是转录因子的Sox家族的成员，并且在神经管中的发育细胞中以及在中枢神经***的增殖祖细胞中表达。在一些实施方案中，在所教导的方法中使用Sox2作为转分化因子。在一些实施方案中，使用Sox2进行单因子转分化。
“巢蛋白”在中枢神经***的干细胞中显著表达，并且其表达通常在分化的中枢神经细胞中缺失。“GFAP”或“胶质原纤维酸性蛋白”是由包括星形细胞的中枢神经***细胞表达的中间丝蛋白。“Tuj-1”或“βIII微管蛋白”是神经标志物。
“Nanog”和“OCT3/4”是已知的干细胞标志物。
在如本文教导的一些实施方案中，在不使用饲养细胞的情况下，例如在神经祖细胞培养基中进行转分化。如本领域已知的，饲养细胞是在同一培养皿或容器中，常以层形式(例如，培养皿上的小鼠成纤维细胞层)生长以支撑细胞生长的额外的细胞。
如本文中所使用的“神经祖细胞培养基”是促进体细胞转分化(TD)成神经干细胞(“诱导的”神经干细胞)的一种或更多种培养基。在一些实施方案中，神经祖细胞培养基包括选自以下的一种或更多种成分：细胞培养基，其含有促生长因子和/或营养混合物(例如，DMEM/F12、MEM/D-缬氨酸、神经基础培养基等，包括它们的混合物)；培养基补充物，其含有激素、蛋白质、维生素和/或氨基酸(例如，N2补充物、B27补充物、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、Glutamax、BSA、胰岛素、全反式视黄酸等，包括它们的混合物)；以及任选的小分子抑制剂(例如，SB431542(BMP抑制剂)、LDN193189(TGF-β1抑制剂)、CHIR99021(GSK3β抑制剂)等，包括它们的混合物)。成分还可包括β-巯基乙醇、转铁蛋白、***钠和cAMP中的一种或更多种。这些成分中的每一种的合适的浓度是本领域技术人员已知的和/或可凭经验确定的。各成分的示例性浓度还提供于下方实施例2中。在一些实施方案中，神经祖细胞培养基是预制培养基，诸如STEMdiffTM神经诱导培养基(STEMCELLTM Techologies,Vancouver,British Columbia,加拿大)。
在一些实施方案中，将神经干细胞用TERT(端粒酶逆转录酶)装载以提升其寿命和/或增强其通过细胞培养而扩展的能力。在一些实施方案中，TERT是人端粒酶逆转录酶(“hTERT”)。
如本文中所使用的“治疗(treat或treatment)”指的是赋予患者益处的任何类型的治疗，所述患者罹患诸如癌症、神经变性病症或神经创伤的疾病或病症，所述益处包括改善患者的病状(例如，一种或更多种症状)、延迟疾病的进展、延迟疾病的发作或复发等。
本发明主要涉及人受试者的治疗，但本发明还可对动物受试者进行，特别是对诸如小鼠、大鼠、狗、猫、家畜和马的哺乳动物受试者进行以用于兽医目的，以及用于药物筛选和/或药物开发目的。受试者可属于任何年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方案中，诱导的神经干细胞相对于受试者是同种异体或自体的。
待治疗的癌症包括脑癌，其可为原发性或继发性脑癌。“原发性脑癌”是中枢神经***细胞的颅内癌症。脑癌的类型包括但不限于神经胶质瘤(例如，成胶质细胞瘤或多形性成胶质细胞瘤(GBM))、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、垂体腺瘤和神经鞘肿瘤。“继发性脑癌”是位于中枢神经***中的癌症，其包括转移自身体的其它区域的细胞，例如乳腺癌、黑素瘤、肺癌、***癌等。
在一些实施方案中，如本文教导的神经干细胞装载有(即，含有)治疗剂、报道分子和/或能够表达上述者的核酸。在一些实施方案中，治疗剂是蛋白毒素(例如，细菌内毒素或外毒素)、溶瘤病毒(例如，条件复制型溶瘤腺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、单纯性疱疹病毒(例如，HSV1716)、新城病病毒、牛痘病毒等)，或促凋亡剂(例如，可分泌型肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导性配体(S-TRAIL))。参见，例如Weiss等人的WO 19940/16718；Shah等人的WO 2014/018113；Martuza等人的WO 2009/148488；Subbiah等人的US 2009/0175826。
在一些实施方案中，治疗剂是促炎蛋白，诸如白细胞介素、细胞因子或抗体。
在一些实施方案中，治疗剂是可用于酶/前药疗法的酶(例如，胸苷激酶(例如，更昔洛韦前药的情况)、羧酸酯酶(例如，CTP-11的情况)、胞嘧啶脱氨酶等)。
在一些实施方案中，治疗剂是RNAi分子，诸如miRNA或siRNA。
在一些实施方案中，神经干细胞装载有纳米颗粒/药物缀合物。
报道分子是本领域已知的并且包括但不限于绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。参见，例如Pomper等人的US 2013/0263296。
神经干细胞的装载可使用本领域已知的方法来实现，诸如用能够产生治疗性或报告蛋白的核酸转染细胞、用病毒载体转导细胞、用治疗剂和/或报道分子基于脂质或聚合地装载细胞等。
“转染”是通常通过使用载体(即，用作媒介携带外源遗传物质到另一细胞中的分子)将异源性遗传物质转移到细胞中。转染真核细胞的方法是已知的，并且可包括但不限于电穿孔、使用基于阳离子脂质体的试剂、纳米颗粒聚合物脂质体等。
“转导”是借助病毒将异源性遗传物质转移到细胞中。此类病毒载体是已知的并且可包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体等。
可使用本领域已知的方法来进行神经干细胞的施用。例如，可进行细胞的颅内施用来治疗脑癌，优选在手术移除至少一部分脑肿瘤之后进行的瘤内施用或腔内施用。
在一些实施方案中，将细胞用诸如水凝胶基质(例如，合成胞外基质)的基质封装和/或接种到可随后被例如颅内地施用或植入的支架上。参见，例如Shah的PCT专利申请公开WO 2014/035474；Shah的US 2014/0086907，其各自通过引用并入本文。
在以下非限制性实施例中更详细地解释本发明。
实施例
实施例1：人皮肤细胞的快速转分化
从人皮肤快速生成h-iNSC的能力可使患者特异性疗法能够治疗癌症。iNSC生成的效率显著高于其它细胞重编程策略，表明可从少量皮肤生成大量h-iNSC。患者特异性来源可避免免疫排斥以使肿瘤杀伤和用于治疗耐久性最大程度化。
必须快速生成基于细胞的药物载体以便治疗患有迅速进展的癌症的患者，并且h-iNSC可在数周内产生。此外，不同于iPSC，h-iNSC在移植之后不形成畸胎瘤。
在此研究中，TD衍生的h-iNSC疗法的潜能作为用于人患者的自体GBM疗法被研究。这些方法能够比先前方法快6倍地将人皮肤转化成h-iNSC，这是重要的，因为时间是GBM患者疗法要优先考虑的事。使用这种策略来产生用细胞毒性剂和光学报道基因工程改造的第一h-iNSC。使用实时分子成像、3-D细胞培养和多种人GBM异种移植模型的组合来研究h-iNSC疗法对抗实体和手术切除GBM的命运(fate)、肿瘤特异性归巢和效力。
材料和方法
细胞系：使U87、GBM8、GBM4、293T和人成纤维细胞(CCD-1099Sk，其它者)如先前所述生长(Hingtgen等人，Stem Cells 28，832-841，2010；Wakimoto等人，Cancer Res 69，3472-3481，2009)。编码hTERT和Sox2的慢病毒载体(LV)购自Addgene(Cambridge.MA,USA)。所有cDNA在四环素启动子的控制下。
遵循单因子Sox2和无饲养物方法来生成人iNSC(h-iNSC)。简言之，将200,000个人成纤维细胞接种于6孔板中并且在含有硫酸鱼精蛋白(5μg/ml,Sigma)的培养基中用含有hTERT和Sox2的LV混合物(cocktail)转导。在感染之后两天，将培养基换成含有强力霉素(10μg/ml,Sigma,St.Louis,MO,USA)的STEMdiffTM神经诱导培养基(STEMCELLTechnologies,温哥华,加拿大)。每3天换培养基。通过在低粘附烧瓶中培养来诱导神经球形成。
慢病毒载体：除重编程载体以外，在此研究中使用以下慢病毒载体：LV-GFP-FL、LV-GFP-RLuc、LV-mC-FL、LV-sTR、LV-diTR和LV-mRFP-hRLuc-ttk。通过分别使用载体荧光素酶-pcDNA3和pAC-hRluc(Addgene)扩增编码海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶的cDNA来构建GFP-RLuc和GFP-FL。将限制性位点掺合在引物中，所得片段被BglII和SalI消化，并且在BglII/SalI消化的pEGFP-C1(Clontech,Mountain View,CA,USA)中框内连接。将GFP-FL或GFP-RLuc片段用AgeI(钝性)和SalI消化，并且连接至被BamHI(平端的)和XhoI消化的pTK402(由UNC基因疗法中心的Tal Kafri博士提供)中，以产生LV-GFPFL或LV-GFP-RLuc。类似地，通过从荧光素酶-pcDNA3扩增编码萤火虫荧光素酶的cDNA，连接到BglII/SalI消化的mCherry-C1(Clontech)中，并且使用平端/XhoI位点将mC-FL片段连接到pTK402LV骨架中来产生mCFL。为了产生LV-sTR和LV-diTR，使用定制合成的寡核苷酸模板(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)来PCR扩增编码sTR或diTR的cDNA序列。将限制性位点掺合到引物中，将所得片段用BamH1和XhoI消化并且框内连接至BamH1/XhoI消化的pLVX质粒中。LV-sTR和LV-diTR均具有骨架中的IRES-GFP(内部核糖体进入位点-绿色荧光蛋白)元件以及CMV驱动的嘌呤霉素元件。使用如前述的无辅助病毒包装***将所有LV构建物作为LV载体包装在293T细胞中(Sena-Esteves等人，Journal of virological methods 122，131-139，2004)。通过在含有5g/ml硫酸鱼精蛋白(Sigma)的培养基中孵育病毒粒子在变化的感染复数(MOI)下用LV转导h-iNSC和GBM细胞，并且通过荧光显微术使细胞的荧光蛋白表达可见。
细胞活力和传代数：为了评估修饰和未修饰的h-iNSC的增殖和传代数，将表达GFP-FL、sTR的h-iNSC或未修饰细胞接种于96孔板中。使用CellTiter-发光细胞活力试剂盒(Promega)在接种之后第2、3、4、5、8和10天评估细胞活力。通过监测在形态、生长速率或转导效率不变更的情况下iNSC、iNSC-sTR或WT-NSC传代培养的次数来评估最大传代数。
免疫组织化学和体外分化：为了测定LV修饰对h-iNSC分化的影响，用LV-GFP-FL或LV-sTR转导h-iNSC。将工程改造的或未修饰的细胞固定、透化，并且用抗巢蛋白多克隆抗体(Millipore,MAB353,1:500,Billerica,MA,USA)孵育1h。将细胞清洗并且用适当的二级抗体(Biotium,Hayward,CA,USA)孵育1小时。然后将细胞清洗、固定，并且使用荧光共聚焦显微术成像。对于分化而言，将工程改造的或未转导的h-iNSC在耗尽强力霉素、EGF和FGF的N3培养基中培养12天。然后将细胞用抗巢蛋白的抗体、抗胶质原纤维酸性蛋白的抗体(GFAP；Millipore,MAB3405,1:250)或抗Tuj-1的抗体(Sigma,T8578,1:1000)染色并且用适当的二级抗体(Biotium)检测。用Hoechst 33342复染核并且使用FV 1200激光共聚焦显微镜(Olympus,Center Valley,PA)分析结果。
三维组织培养。使用Bio-Assembler试剂盒(Nano3D Biosciences,Houston,TX)进行三维悬浮细胞培养。用磁性纳米颗粒组件(8μl cm-2的细胞培养表面面积或50μl ml-1培养基，纳米梭(NS)，Nano3D Biosciences)过夜孵育处理具有GBM或h-iNSC的融合6孔板来允许细胞结合至纳米颗粒。通过混合氧化铁和与聚l-赖氨酸交联的金纳米颗粒来制造NS以促进细胞摄取(Souza,G.R.等人，Three-dimensional tissue culture based on magneticcell levitation.Nat Nanotechnol 5，291，2010)。然后将经处理的GBM和h-iNSC用胰蛋白酶分离、在具有2ml培养基的超低附着6孔板中再悬浮并且以不同比率(1:1和1:0.5)混合。将针对6孔板设计的具有50G场强的6个钕磁铁的磁性驱动器以及塑料盖插件置于孔板顶上来将细胞悬浮至空气-液体界面。将含有4μg/ml GCV的培养基添加至GBM与表达ttk的h-iNSC的共培养物中。随着时间推移拍摄荧光图像，以追踪两个群体(先前用不同荧光标记)的细胞活力。对于3D细胞培养的BLI而言，将100μl/孔的Fluc底物储备试剂添加至培养基并且使用IVIS动态光学***(PerkinElmer)以5分钟采集时间成像。处理图像并且使用LivingImage软件(PerkinElmer)量化光子发射。
实时成像和运动分析：在新颖的二维和三维培养***中评估迁移。
二维迁移：将表达RFP的h-iNSC接种于使用2室细胞培养插件(ibidi,Verona,WI,USA)的玻璃底微孔皿(MatTek,Ashland,MA,USA)中的微培养插件中。将表达GFP的U87神经胶质瘤细胞平板接种到相邻的孔(0.5mm间距)中或者孔被留空。在平板接种之后24小时，将细胞置于VivaView活细胞成像***(Olympus)中并且使细胞平衡。去除插件，并且在三个独立实验中，在每个孔6个位置(以监测充足的细胞数)中，以10倍放大每20分钟对细胞进行成像，持续36小时。然后使用NIH Image来生成影片并且测定迁移速度、迁移总距离和迁移的方向性三者。
三维迁移：通过使用如上述的悬浮培养产生h-iNSC和GBM球状体，在3-D培养***中评估h-iNSC至GBM球状体的迁移。在悬浮***中共培养h-iNSC和GBM球状体。进行实时成像来使悬浮液中h-iNSC对GBM球状体的穿透可见。
共培养活力测定：将表达sTR或对照GFP-RL的mNSC(5×103个)接种于96孔板中。24小时后，将U87-mC-FL、LN18-mC-FL或GBM8-mC-FL人GBM细胞(5×103个)接种于孔中并且在24小时后通过定量体外生物发光成像来测量GBM细胞活力。还在18小时时利用笼式半胱天冬酶3/7-可激活DEVD-氨基荧光素(Caspase-Glo 3/7,Promega,Madison,WI,USA)评估GBM细胞的半胱天冬酶-3/7活性。
体内h-iNSC存活和命运：为了测定体内h-iNSC的存活，将表达mCherry-FL的h-iNSC(每只小鼠7.5×106个细胞)悬浮于PBS中并且立体定向地植入至小鼠(n＝7)的右额叶中。通过持续20天进行的连续生物发光成像来测定h-iNSC存活。为了测定细胞分辨率下h-iNSC的命运，在植入后21天时处死动物，将脑提取切片。将组织切片用抗巢蛋白、GFAP、Tuj-1、Oct-4和TRA-160的抗体染色，并且使用标记有CFTM488的二级抗体使其可见。
共培养活力测定法：在三个单独的体外细胞毒性研究中使用3-D悬浮培养。使用表达两种不同细胞毒性剂的h-iNSC处理一种已建立的GBM细胞系(U87)和两种患者来源的GBM系(GBM4、GBM8)。1)为了测定TRAIL疗法的细胞毒性，将h-iNSC-sTR或h-iNSC-mCherry球状体在悬浮液中以1:2或1:1的iNSC:GBM比率与U87-GFP-FLuc球状体共培养。48小时后通过FLuc成像来测定GBM球状体活力。2)为了测定前药酶疗法对患者来源的GBM的细胞毒性，将h-iNSC-TK球状体在悬浮液中与患者来源的GBM4-GFP-FLuc球状体共培养或者在球体形成之前与GBM细胞混合。使用或不使用更昔洛韦(GCV)培养球状体，并且在添加前药之后第0、2、4或7天通过FLuc成像来测定GBM球状体活力。3)为了测定sECM封装的iNSC前药/酶疗法的细胞毒性，将h-iNSC-TK封装于sECM中并且悬浮放置与患者来源的GBM8-GFP-FLuc球状体一起培养。通过FLuc成像来测定活力。
h-iNSC疗法的体内抗GBM效力：进行三个不同的异种移植研究来评估h-iNSC疗法的抗GBM效果。针对实体(U87)、弥漫的患者来源的(GBM8)和手术切除的患者来源的(GBM4)异种移植模型测试h-iNSC-sTR和h-iNSC-TK疗法。
1)为了测定h-iNSC-TRAIL抗实体人U87肿瘤的治疗效力，将h-iNSC-TRAIL或iNSC-GFP-RLuc的组合(每只小鼠7.5×105个细胞)与U87-mC-FL细胞(每只小鼠1×106个细胞)一起立体定向植入至小鼠(n＝7)的右额叶中。然后通过利用如前述的FL生物发光成像跟踪肿瘤体积来测定治疗响应。简言之，给予小鼠腹膜内注射D-荧光素(于150μl盐水中每只小鼠4.5mg)，并且5分钟后使用IVIS动态光学***(PerkinElmer)以5分钟采集时间测定光子发射。处理图像并且使用LivingImage软件(PerkinElmer)量化光子发射。另外，随着时间推移跟踪小鼠的存活。
2)为了研究h-iNSC前药/酶疗法抗侵入性患者来源的GBM的效力，用表达mC-FL的GBM8细胞立体定向地植入小鼠的右额叶中(每只小鼠1.5×105个细胞)。三天后，将h-iNSC-TK(n＝7，每只小鼠7.5×105个细胞)或h-iNSC-mRFP-hRLuc(n＝7，每只小鼠7.5×105个细胞)植入至肿瘤植入部位中。在两周期间以100mg/kg的剂量每日腹膜内注射GCV。通过如上述的FLuc成像评估肿瘤体积的变化并且随着时间推移跟踪小鼠的存活。
3)为了测定h-iNSC疗法抗手术后最小GBM的效力，根据我们先前报告的策略在小鼠中进行图像引导的GBM切除。将患者来源的GBM8-GFP-FLuc在80％融合下收获并且立体定向地植入(5×105个细胞)右额叶中：前囟外侧2mm并且离硬膜0.5mm。在固定于立体定向框架上之后，将小鼠置于Olympus MVX-10显微镜下。在整个手术期间使用Hamamatsu ORCA03G CCD(高分辨率)照相机和软件(Olympus)捕获手术中的显微镜白光、GFP和RFP图像。在颅骨上方的皮肤中制造中线切口，从而暴露小鼠的颅。使用GFP荧光识别颅内异种移植物。使用骨钻和钳子以外科手术方式去除覆盖肿瘤的小部分颅骨，并且从皮质表面轻轻地剥离上覆硬膜以暴露肿瘤。在GFP荧光下，使用外科解剖和抽吸的组合手术切除GBM8-GFPFL肿瘤，并且连续捕获GFP的图像以评估GFP引导的手术切除的准确度。在肿瘤去除之后，所得切除腔被充分冲洗并且用7-0Vicryl缝线闭合皮肤。未观察到手术相关的死亡。所有实验规程由北卡罗来纳大学教堂山分校(University of North Carolina at Chapel Hill)的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准，并且小鼠的护理是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals、USDA法规和美国兽医协会(American Veterinary MedicalAssociation)所阐述的标准。在手术切除之后，将h-iNSC-TK或h-iNSC-mC-FL(5×105个细胞)封装于透明质酸sECM水凝胶(Sigma)中并且移植到术后GBM腔中。通过如上述的FLuc成像使GBM复发可见并且跟踪小鼠的存活。
组织处理：在最后的成像期之后立即将小鼠处死、用***灌注并且提取脑。将组织立即浸于***中。使用振动切片机(Fisher,Waltham,MA,USA)生成30μm冠状切片。对于巢蛋白、GFAP和Tuj-1染色而言，将切片在室温下在封闭溶液(0.3％BSA、8％山羊血清和0.3％Triton X-100)中孵育1小时，接着在4℃下用稀释于封闭溶液中的以下一级抗体孵育过夜：(1)抗人巢蛋白(Millipore)、(2)抗GFAP(Millipore)、(3)抗TRAIL(ProSci,Poway,CA)和(4)抗Tuj-1(Sigma)。将切片用PBS清洗三次，在适当的二级抗体中孵育，并使用共聚焦显微镜(Olympus)使其可见。
结果
人成纤维细胞快速转分化成h-iNSC。h-iNSC疗法的快速和有效生成对于治疗患有侵袭性癌症的患者是必要的。作为新的策略，将人成纤维细胞用Sox2转导并且不利用饲养细胞来进行h-iNSC生成。然后，生成了表达光学报道基因的诊断性h-iNSC或表达不同细胞毒性剂的治疗性h-iNSC(图1A)。首先估计使用无饲养物/Sox2策略生成h-iNSC的动力学。将人成纤维细胞用Sox2转导并且在NSC诱导性培养基中培养(图1B)。在激活Sox2表达的48小时内观察到细胞形态学变化。另外，检测到广泛分布的巢蛋白表达并且h-iNSC可形成神经球形成物。定量显示在h-iNSC中的巢蛋白表达从第2天至第10天保持恒定(图1C)。当被诱导分化时，h-iNSC表达星形细胞标志物GFAP和神经标志物Tuj-1。染色揭示细胞不表达多能性标志物TRA-160或OCT4(图1D)。通过RT-PCR分析证实了这些发现(图1E)。h-iNSC显示出在亲本成纤维细胞或人iPSC(h-iPSC)中不存在的高水平巢蛋白表达。在h-iNSC和h-iPSC中Sox2表达都是高的，因为使用了Sox2过表达来生成两种细胞系。不同于h-iPSC，h-iNSC不表达高水平的多能性标志物Nanog或OCT3/4。这些数据合起来展现出使用单因子Sox2表达在48小时内产生多能h-iNSC的能力。
h-iNSC选择性迁移至GBM。归巢至实体和侵入性GBM沉积物的能力是基于NSC的癌症疗法的最有益特性中的一种。为研究h-iNSC的亲肿瘤性质，我们使用了与人GBM细胞共培养的h-iNSC的实时运动分析(概述于图2A中)。为了参考，将h-iNSC迁移与h-iNSC所起源的亲本人成纤维细胞对比。发现h-iNSC朝向共培养的GBM细胞快速迁移，在22小时内覆盖了500μm间隙(图2B)。单细胞迁移路径分析显示存在GBM细胞诱导的h-iNSC朝向共培养GBM细胞选择性迁移(图2C)。相比之下，人成纤维细胞表明极少迁移(图2B)。对人成纤维细胞的单细胞迁移分析证实具有朝向共培养GBM细胞的极小位移的随机迁移模式(图2C)。通过计算欧几里德距离与总体累积距离的比率来分析h-iNSC迁移的方向性，其中完全的单方向移动产生1.0的比率，而完全非定向的移动产生0.0的比率。使用这种分析，我们计算出h-iNSC的平均方向性比率(0.65)显著高于人成纤维细胞(0.28)(图2D)。对单细胞迁移模式的进一步分析表明，与人成纤维细胞(200μm)相比，h-iNSC迁移的平均欧几里德距离(340μm)显著增加(图2E)。h-iNSC的平均细胞速度与人成纤维细胞相比更低(0.4vs 0.62)(图2F)。最后，我们进行了3-D迁移测定来模拟h-iNSC体内迁移至GBM病灶中。将mCherry+ h-iNSC球状体与GFP+ GBM球状体共培养，并且使用磁力来悬浮两种细胞类型(图2G)。我们发现，在接种的数小时内h-iNSC开始穿透GBM球状体。h-iNSC球状体继续穿透GBM球状体，在8天内广泛地共定位。这些观测合起来支持h-iNSC具有亲肿瘤性质并且归巢至GBM细胞的结论。
h-iNSC持续性和体内命运。接下来我们利用工程改造的h-iNSC来研究这些细胞在脑中的体内存活和命运。在用GFPFL和mCFL工程改造的h-iNSC之后体外增殖的先前研究未显示与非工程改造的h-iNSC的显著差异(图3A)。对于体内研究而言，将用mCFL工程改造的h-iNSC立体定向地植入小鼠的脑中，并且使用实时非侵入成像来监测随着时间推移的细胞存活。通过周期性地捕获图像，我们发现，在植入后h-iNSC存活超过20天(图3B)。死后IHC揭示，大约一半的h-iNSC-mCFL表达NSC标志物巢蛋白(图3D)，并且另一半对于神经元标志物Tuj-1是阳性的(图3D)。未观察到星形细胞标志物GFAP。另外的IHC证实移植的h-iNSC不表达多能性标志物Oct-4和TDR-160。
使用杀肿瘤iNSC有效治疗恶性和侵入性GBM。为了研究基于h-iNSC的GBM治疗的治疗效力，我们首先工程改造h-iNSC来与Gaussia荧光素酶同框和在IRES-GFP元件的上游表达促凋亡分子TNFα相关凋亡诱导性配体(TRAIL；diTR)的分泌变体(iNSC-diTR)。先前已确立了当从工程改造的细胞载体递送时TRAIL的抗癌效果；因此TRAIL是用于表征新的h-iNSC递送媒介的理想的杀肿瘤分子。在h-iNSC的转导之后检测GFP报道基因的稳健表达(图4A)。我们观察到当在悬浮液中培养时h-iNSC-diTR有效形成神经球(图4B)，并且展示出等同于未修饰细胞的增殖能力和传代数(数据未示出)。巢蛋白表达和分化能力与在先前工程改造和未工程改造的h-iNSC中观察到的相同，表明使用TRAIL修饰h-iNSC不干扰其作为干细胞的性质。
为了评估工程化h-iNSC的抗GBM效力，将h-iNSC-diTR或对照iNSC-GFPRL以不同比率与表达mCherry和萤火虫荧光素酶(mC-FL)的人GBM细胞共培养。为了模拟体内特性，在三维悬浮***中将GBM和h-iNSC混合并培养48小时。荧光和BLI揭示，与h-iNSC-sTR共培养的GBM活力显著降低。如果使用更高的h-iNSC:GBM比率则这种降低明显更大(图4C)。
促凋亡剂的h-iNSC分泌减少实体GBM。为了测试基于h-iNSC-sTR的疗法的体内效力，我们测定了h-iNSC-sTR治疗对孤立人GBM的影响。将表达mC-FL的人U87GBM细胞与iNSC-sTR或对照iNSC-GFP一起颅内植入(图D)，并且使用连续生物发光成像跟踪肿瘤体积。我们发现，h-iNSC-sTR治疗至第3天诱导了统计学显著的肿瘤生长降低，并且至第24天使GBM体积减小至1/50(图4F)。另外，h-iNSC-sTR处理的动物存活超过51天，而对照动物仅在25天内死于GBM生长(图4G)。小鼠脑的IHC检查显示在两周之后通过h-iNSC-sTR稳健表达TRAIL。GBM中的h-iNSC-sTR对于巢蛋白和Tuj-1的表达是阳性的，而对于GFAP以及多能性标志物Oct-4和TRD-160是阴性的(图4H)。
使用杀肿瘤iNSC有效治疗恶性和侵入性GBM CD133+。为了测定h-iNSC前药/酶疗法对于患者来源的CD133+人GBM起源细胞的效力，我们将表达GFP和萤火虫荧光素酶的GBM4细胞(GBM4-GFPFL)与表达包括Rluc、RFP和胸苷激酶(TK)活性的三功能嵌合报道基因以生成h-iNSC-TK的h-iNSC共培养。在第一细胞***基因疗法原理验证中使用由单纯性疱疹病毒编码的胸苷激酶(HSV-TK)并且仍是临床和实验应用中最广泛使用的***之一。在三维悬浮***中以两种不同的模型共培养GBM4-GFPFL和h-iNSC-TK。第一个模型(图5A)混合两种细胞类型并且通过荧光监测随着时间推移的细胞存活(图5B)。第二个模型，并列式培养两种细胞类型以模拟对已建立的GBM的治疗(图5C)。通过荧光监测随着时间推移的细胞存活(图5D)。在两种情况下，观察到GBM存活随着时间推移显著减少，在混合模型中更显著(图5E)。
接下来我们通过将GBM4-GFPFL癌细胞植入小鼠的实质中来测定体内h-iNSC-TK疗法对已建立的GBM4的效力。三天后，将h-iNSC-TK或对照细胞直接施用于已建立的肿瘤中(图5F)。连续生物发光成像显示h-iNSC-TK治疗减弱了GBM4肿瘤的进展，在注射之后28天与对照相比使肿瘤负荷减少至1/9(图5G)。h-iNSC-TK疗法还导致存活的显著延长，如与对照处理小鼠中仅37天相比，h-iNSC-TK处理的动物存活平均为67天(图5H)。死后IHC证实通过h-iNSC-TK注射显著减小了肿瘤体积(图5I-5J)。这些结果合起来显示，h-iNSC-TK疗法针对恶性和侵入性GBM具有显著治疗效果并且显著延长荷瘤小鼠的存活。
腔内h-iNSC-TK疗法抑制手术切除GBM复发。手术切除是用于GBM患者的护理的临床标准的部分。我们先前发现干细胞的封装是腔内疗法有效阻遏GBM复发所需的。为测定封装于合成胞外基质(sECM)中的h-iNSC疗法的效力，我们将GBM-8GFPFL(患者来源的CD133+人GBM起源细胞)与嵌入HLA水凝胶中的h-iNSC-TK共培养(图6A)。我们发现mCherry+h-iNSC从sECM基质迁移并且在3天内定殖GFP+GBM8球状体。另外，sECM/h-iNSC-TK疗法在3天内显著降低GBM8球状体的活力。
为了模拟用于手术切除的人GBM患者的h-iNSC疗法，我们在GBM切除的小鼠模型中测试了针对高度弥漫性患者来源的GBM8细胞的h-iNSC-TK疗法(图6D)。在GBM减瘤之后将嵌入HLA中的h-iNSC-TK移植到手术切除腔中。连续生物发光成像显示h-iNSC-TK疗法减弱GBM8肿瘤的复发，在植入之后14天与对照相比使肿瘤负荷减少350％(图6E)。h-iNSC-TK疗法还导致存活的显著延长，如与对照处理小鼠中的46天相比，h-iNSC-TK处理的动物存活平均为59天(图6E)。
实施例2：用于人皮肤细胞快速转分化的替代培养基
如上文实施例1中进行人皮肤细胞的转分化，但代替STEMdiffTM神经祖细胞基础培养基的是如下的N-2培养基和B-27培养基的1:1混合物。如所示，化学品购自(Invitrogen Corporation,Carlsbad,California)、Sigma(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)或Selleck Chemicals(Houston,Texas)。
N-2培养基：
DMEM/F12
1×N2补充物
5μg/ml胰岛素(Sigma)
1mM L-谷氨酰胺
1mM Glutamax
100μM MEM非必需氨基酸(NEAA)
100Mβ-巯基乙醇(bME)
B-27培养基：
神经基础培养基
1×B-27补充物
200mM L-谷氨酰胺
向1:1混合物添加牛血清白蛋白(BSA,Sigma)，以达到5μg/ml的终浓度。
该培养基补充有以下物质：终浓度达10μM的SB431542(Selleck Chemicals)；终浓度达100nM的LDN193189(Selleck Chemicals)；终浓度达10μM的全反式视黄酸(Sigma)；和终浓度达3μM的CHIR99021(Selleck Chemicals)。
使用该培养基，当与Sox2转导一起使用时生成巢蛋白+iNSC。
培养基还可被制成包括胰岛素(25μg/ml)、转铁蛋白(100μg/ml)、***钠(30nM)和/或cAMP(100ng/ml)。
实施例3：在治疗脑癌中使用iNSC
一患者被诊断患有脑癌(例如，成胶质细胞瘤)，并且此后不久(例如，在一周、两周或三周内)安排外科手术以去除肿瘤。对患者进行皮肤打孔以获得皮肤成纤维细胞。如本文教导将细胞转分化成诱导的神经干细胞并且还用治疗剂和/或报道分子装载。在手术期间和肿瘤去除之后，将经装载的iNSC施用到已去除肿瘤的所得腔中。iNSC朝向残余癌细胞迁移并且递送其治疗剂/报道分子有效载荷。
前文是本发明的例示，并且不应解释为限制本发明。本发明由以下权利要求书和其中所包括的权利要求的等价物来限定。

Claims (24)

1.一种用于制备诱导的神经干细胞的方法，其包括：
提供体细胞；
用编码Sox2的核酸转染或转导所述体细胞，借此所述体细胞表达Sox2；和然后
转分化所述体细胞，其中通过在神经祖细胞培养基中生长所述体细胞进行所述转分化，
以由此制备所述诱导的神经干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述转分化进行1至10天的时间。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述转分化进行1至5天的时间。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述转分化进行1至3天的时间。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述体细胞是皮肤成纤维细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述诱导的神经干细胞表达巢蛋白和/或不表达Nanog或OCT3/4。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述诱导的神经干细胞能够分化成神经/星形细胞。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括用包含所述编码Sox2的核酸的慢病毒载体转导所述体细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中不使用饲养细胞进行所述转分化。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述神经祖细胞培养基包含选自以下的一种或更多种成分：DMEM/F12、N2补充物、胰岛素、神经基础培养基、B27补充物、非必需氨基酸、bME、L-谷氨酰胺、Glutamax、SB431542、LDN193189、视黄酸、BSA、CHIR99021、转铁蛋白、***钠、和cAMP。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用编码TERT(例如，hTERT)的核酸转染或转导所述体细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用治疗剂和/或报道分子装载所述诱导的神经干细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述装载包括使用能够产生治疗剂的核酸转染或转导所述诱导的神经干细胞，并且其中所述治疗剂是蛋白毒素、溶瘤病毒、促凋亡剂或可用于酶/前药疗法的酶。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述能够产生治疗剂的核酸和所述编码Sox2的核酸在同一载体上提供。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括扩展所述诱导的神经干细胞以形成诱导的神经干细胞的群体。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述诱导的神经干细胞封装于水凝胶中或将所述诱导的神经干细胞接种在支架上。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述诱导的神经干细胞施用于有需要的受试者。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述诱导的神经干细胞相对于所述受试者是同种异体、同源或自体的。
20.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述受试者需要治疗脑癌。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述脑癌是成胶质细胞瘤。
23.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述施用在手术去除至少一部分的脑肿瘤之后通过腔内施用进行。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述诱导的神经干细胞相对于所述受试者是自体的并且其中在所述提供所述体细胞之后进行1至14或21天的所述施用。
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