CN107828846A - 一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法，涉及微藻生产应用。培养雨生红球藻鞭毛细胞；培养雨生红球藻球形细胞；积累雨生红球藻虾青素。充分发挥了雨生红球藻各种形态细胞的生理生化特点，利用不同形态的雨生红球藻细胞的生理生化特征，合理的进行分阶段培养，从而达到提高细胞生物量、细胞存活率以及虾青素含量的目的。由于雨生红球藻鞭毛细胞经过转化之后成为个体更大的球形细胞，因此可通过藻细胞自然沉降的方法对藻液中的藻细胞进行采收，从而降低采收成本。

Description

一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法
技术领域
本发明涉及微藻生产应用，尤其是涉及一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法。
背景技术
虾青素是一种具有超强抗氧化能里的红色酮式类胡萝卜素(Guerin et al.,2003；Goswami et al.,2010)，广泛用于水产饲料、化妆品、食品和保健品等领域(Johnson andAn,1991；Nelis and De,1991；Guerin et al.,2003；Goswami et al.,2010；Tominaga etal.,2012；Higuera,2006)。雨生红球藻是一种能够合成和积累高水平天然虾青素的绿藻，其虾青素含量可达干重的4％～5％(Margalith,1999；Boussiba,2000；Chen,2015)。虾青素市场需求巨大，在2014年，全球虾青素市场约为4.47亿美元，预计到2020年，全球虾青素市场将达到11亿美元的规模，因此，虾青素在食品添加剂、农业、水产养殖、保健，医疗、化妆品等行业的市场前景非常广阔。
目前，工业上利用雨生红球藻生产虾青素的方法主要为“两步法”(Lorenz andCysewski,2000；Li et al.,2011；Panis and Carreon,2016)，即在第一个阶段中，通过提供最优的培养环境和培养条件，包括营养盐充足的培养基、最优的温度、光照以及pH等，以获取大量的具有快速繁殖、生长能力的，健康的“绿色”营养细胞，增加生物量浓度。当“绿色”细胞生物量浓度达到一定程度后，将细胞转移至户外开放池或封闭式光生物反应器中进行第二阶段——“红色”虾青素积累的培养，使“绿色”细胞在诱导的条件下进行虾青素的合成和积累(Fábregas et al.,2001；Orosa et al.,2005；Aflalo et al.,2007；Wang etal.,2013)。值得注意的是，在由“绿色”阶段转到“红色”胁迫环境下的过程中，会有20％～80％的细胞死亡(Harker et al.,1996；Hu et al.,2008；Li et al.,2010；Wang et al.,2013)。这些细胞死亡的原因一般认为是胁迫环境下高光强造成的细胞氧化损伤、光漂白或者营养盐缺失所造成的。雨生红球藻主要存在4种类型的细胞，即鞭毛细胞、绿色球状细胞、中间细胞以及红色的包囊细胞(Wayama et al.,2013；Zhang et al.,2017)。其中，鞭毛细胞***的概率最大，通常有丝***会产生2～16个子细胞，但鞭毛细胞对高光更敏感，更容易死亡，而且球形细胞的抗性更强一些，在胁迫条件下更容易存活(Han etal.,2012，2013)。因此，本发明根据不同形态的雨生红球藻的生理生化特性，提出了一种根据雨生红球藻不同形态细胞的生理生化特性进行分阶段培养的方法，从而避免雨生红球藻在虾青素积累的过程中细胞的大量死亡。在雨生红球藻实际生产中，具有重要的应用价值。
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发明内容
为了解决在利用雨生红球藻生产虾青素的过程中，藻细胞在胁迫诱导阶段存在的细胞死亡率高，虾青素含量低的问题，本发明的目的在于提供一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法。
本发明包括以下步骤：
1)培养雨生红球藻鞭毛细胞；
在步骤1)中，所述培养雨生红球藻鞭毛细胞的阶段中，利用雨生红球藻鞭毛细胞***概率大的特点，为雨生红球藻提供最适的培养环境，所述培养环境包括营养盐充足、适宜的光照和温度等。
2)培养雨生红球藻球形细胞；
在步骤2)中，所述培养雨生红球藻球形细胞的阶段中，通过缺磷的条件，实现鞭毛细胞向球状细胞的转化，以获得更多的球状细胞；由于磷酸盐的缺失，细胞内叶绿素含量降低，碳水化合物、淀粉以及脂质的含量增加，为下一个阶段合成虾青素提供足够的前体和能量，从而避免细胞在高光和胁迫环境下的死亡。
3)积累雨生红球藻虾青素。
在步骤3)中，所述积累雨生红球藻虾青素的阶段中，采用胁迫诱导阶段，通过细胞自然沉降的办法收集第二阶段的藻细胞，加入胁迫培养基并在高光条件下进行胁迫，从而合成积累虾青素。
与现有的“两步法”相比，本发明的突出技术效果如下：
1)本发明充分发挥了雨生红球藻各种形态细胞的生理生化特点，利用不同形态的雨生红球藻细胞的生理生化特征，合理的进行分阶段培养，从而达到提高细胞生物量、细胞存活率以及虾青素含量的目的。
2)由于雨生红球藻鞭毛细胞经过转化之后成为个体更大的球形细胞，因此可通过藻细胞自然沉降的方法对藻液中的藻细胞进行采收，从而降低采收成本。
附图说明
图1为雨生红球藻绿色鞭毛细胞阶段干重随时间变化曲线图。
图2为绿色鞭毛培养阶段培养第9天的细胞状态图。
图3为球形细胞转化阶段干重随时间变化曲线图。
图4为球形细胞转化阶段第9天的细胞状态图。
图5为胁迫诱导阶段干重随时间变化曲线图。
图6为胁迫诱导阶段第9天细胞直径对比图。
图7为胁迫诱导阶段虾青素含量随时间变化图。
图8为胁迫诱导第9天Motile cell类型细胞的镜检图。在图8中，标尺为50μm。
图9为胁迫诱导第9天Coccoie cell类型细胞的镜检图。在图9中，标尺为50μm。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
1.绿色鞭毛细胞培养阶段培养效果
藻种由BBM培养基培养。接种初始OD680为0.5。培养周期为9天。培养温度25±1℃，培养光强为25μmol·m-2·s-1，连续光照，光源为LED植物培养灯，白光。BBM培养试剂药品：NaNO3、MgSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、CaCl2、ZnSO4·7H2O、MnCl2·7H2O、MoO3、CuSO4·5H2O、CoNO3·6H2O、H3BO3、EDTA、KOH、FeSO4·7H2O，BBM培养基组分如表1所示。
表1 单位：mmol/L
经过9天的培养，细胞干重随时间的增加而增加，如图1所示，最高达到1.15g/L。培养9天后，鞭毛细胞占细胞总数的91％，球形细胞占比为6％，死细胞为3％，雨生红球藻绿色鞭毛阶段各类型细胞所占百分比见表2，细胞生长状态良好，图2为鞭毛细胞培养阶段第9天的细胞镜检图。
表2
2.球形细胞转化阶段的培养效果
收集第一阶段的鞭毛细胞，接入新鲜的BG11缺磷培养基进行细胞转化培养，培养温度25±1℃，培养光强为25μmol·m-2·s-1，连续光照，光源为LED植物培养灯，白光。培养周期9天，培养过程中通入含有1.5％的CO2混合气体鼓泡。BG11缺磷培养基试剂药品：CaCl2·2H2O或CaCl2、C6H8O7·H2O、柠檬酸铁铵、Na2EDTA、MgSO4·7H2O、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O，BG11缺磷培养基配方如表3所示。
表3 单位：g/L
经过9天的细胞转化培养，干重随时间的增加而增加，如图3所示，干重最高达到1.33g/L。转化培养9天后，鞭毛细胞占细胞总数的4％，球形细胞占比为89％，死细胞为7％。雨生红球藻球形细胞转化阶段各类型细胞所占百分比如表4所示，细胞生长状态良好，图4为球形细胞转化阶段第9天的细胞镜检图。
表4
3.细胞诱导阶段的培养效果
分两组进行实验，鞭毛细胞组(Motile cell)和球形细胞组(Coccoid cell)。实验初始接种量为0.5×106cell mL-1。培养基采用新鲜的BBM缺氮缺磷培养基进行细胞胁迫诱导，培养温度25±1℃，培养光强为80μmol·m-2·s-1，连续光照，光源为LED植物培养灯，白光。诱导周期9天，培养过程中通入含有1.5％的CO2混合气体鼓泡。
经过9天的细胞胁迫诱导，干重随时间的增加而增加，如图5所示，其中鞭毛细胞组的干重最高达到1.21g/L，球形细胞组的干重最高达1.32g/L。胁迫诱导9天后，鞭毛细胞组细胞存活率为77.8％，而球形细胞组细胞存活率为90.4％，雨生红球藻胁迫诱导阶段两种类型细胞的存活率见表5。此外，还发现球形细胞组细胞的直径大于鞭毛细胞组，如图6所示。从图7中可知，球形细胞组虾青素含量高于鞭毛细胞组。图8和9为胁迫诱导第9天两种类型细胞的镜检图。
表5
以上实验结果表明：本发明所采用的“三步法”可有效提高细胞存活率，增加细胞尺寸，提高细胞干重和虾青素的含量，具有重要的应用价值。

Claims (5)

1.一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)培养雨生红球藻鞭毛细胞；
2)培养雨生红球藻球形细胞；
3)积累雨生红球藻虾青素。
2.如权利要求1所述一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养雨生红球藻鞭毛细胞的阶段中，利用雨生红球藻鞭毛细胞***概率大的特点，为雨生红球藻提供最适的培养环境。
3.如权利要求2所述一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于所述培养环境包括营养盐充足、光照和温度。
4.如权利要求1所述一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养雨生红球藻球形细胞的阶段中，通过缺磷的条件，实现鞭毛细胞向球状细胞的转化，以获得更多的球状细胞；由于磷酸盐的缺失，细胞内叶绿素含量降低，碳水化合物、淀粉以及脂质的含量增加，为下一个阶段合成虾青素提供足够的前体和能量，从而避免细胞在高光和胁迫环境下的死亡。
5.如权利要求1所述一种利用富含虾青素的雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于在步骤3)中，所述积累雨生红球藻虾青素的阶段中，采用胁迫诱导阶段，通过细胞自然沉降的办法收集第二阶段的藻细胞，加入胁迫培养基并在高光条件下进行胁迫，从而合成积累虾青素。
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