CN107828784B - 从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌dna的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒及方法，属于分子生物学领域。本发明从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，包括：1）偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103；2）样本稀释液；3）样本裂解液；4）核酸清洗液；5）DNA洗脱液6）核酸吸附磁珠。本发明使用偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103特异性结合大肠杆菌继而对大肠杆菌进行纯化，然后将纯化后的大肠杆菌用磁珠法提取DNA。整个过程无需大肠杆菌的分离纯化培养，直接进行DNA提取；简化实验过程，极大的节约了实验时间。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒及方法。
背景技术
大肠埃希菌，又称大肠杆菌（ 革兰氏阴性短杆菌），是人和动物肠道中的常见栖居菌。根据致病性的不同，致泻性大肠埃希菌被分为产肠毒素性大肠埃希菌、肠道侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、肠集聚性黏附性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌5种。
T4噬菌体是一类以大肠杆菌为宿主的病毒，宿主专一性很强。gp37蛋白位于T4类噬菌体长尾丝末端，其C端能够识别宿主菌表面受体，引发噬菌体吸附到大肠杆菌表面的过程，是T4类噬菌体识别受体的关键蛋白。
复杂样本是指食物，粪便，土壤，呕吐物等样本，这些样本一般都含抑制下游PCR或者NGS检测的抑制剂，如复杂多糖，胆酸盐，脂类和尿酸等。传统从复杂样本（食物，粪便，土壤，呕吐物等）中提取大肠杆菌DNA的方法需要先从样本中分离并纯化培养菌株，再从纯化好的菌株中提取核酸，过程比较复杂，所用时间较长。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，解决现有从复杂样本中提取大肠杆菌DNA的方法过程复杂、所需时间长的问题，本发明提供了一种从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒及方法。
本发明的技术方案为：
一种从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，包括：
1）偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103；
2）样本稀释液；
3）样本裂解液；
4）核酸清洗液；
5）DNA洗脱液；
6）核酸吸附磁珠。
作为优选方案， 1）中偶联了gp37蛋白的羧基纳米磁珠Eget103的制备方法为：
a）采用gp37蛋白的大肠杆菌表达***，可溶性表达gp37蛋白并纯化；
b）活化羧基化纳米磁珠；
c）gp37蛋白与羧基化纳米磁珠偶联。
进一步地， c）gp37蛋白与羧基化纳米磁珠偶联的具体过程为：
以含有Tween-20的硼酸盐溶液为偶联缓冲液，用所述偶联缓冲液清洗羧基化纳米磁珠；
将所述羧基化纳米磁珠、纯化后的gp37蛋白以及偶联缓冲液混合，20-30℃下偶联2-6小时；磁性分离去除上清液，加入PBST溶液重悬磁珠，20-30℃反应30-90min封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团；
磁性分离上清液，采用PBS或保存溶液洗涤后，置于保存溶液中，4℃保存。
作为优选方案，所述偶联缓冲液的pH为8.0-9.0。更优选的，所述偶联缓冲液的pH为8.5。
作为优选方案，所述样本稀释液的组成为：NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO44.3mM, KH2PO4 1.4mM, 0.05％Tween-20；
所述样本裂解液的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 5mM, PH=8.0的Tris-HCl 20mM,溶菌酶 3mg/ml。
作为优选方案，所述核酸清洗液的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 0.05mM, PH=8.0的Tris-HCl 20mM，无水乙醇70%。
作为优选方案，所述DNA洗脱液的组成为：EDTA 0.05mM, PH=8.0 的Tris-HCl10mM。
采用所述试剂盒从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的方法，包括步骤：
1）取复杂样本，加入所述样本稀释液，混匀后，离心取上清；
2）加入偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103，36.5-37.5℃下振荡培养10-20min；
3）磁性分离结合了大肠杆菌的磁珠，移去液体，结合了大肠杆菌的磁珠磁珠采用样本稀释液清洗；
4）向结合了大肠杆菌的磁珠中加入样本裂解液，于36.5-37.5℃下温育15-20min，裂解菌体；
5）裂解完毕后，冷却至室温，加入核酸吸附磁珠，室温混匀；
6）吸附有核酸的磁珠采用核酸清洗液清洗；
7）向吸附有核酸的磁珠中加入DNA洗脱液，36.5-37.5℃下温育，然后磁性分离，上清液于-20℃下保存。
作为优选方案，步骤1）中，1g复杂样本中加入8-10 mL样本稀释液；步骤2）中偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103与步骤1）上清液的体积比为1:0.6-1.5。
作为优选方案，步骤4）中，结合了大肠杆菌的磁珠与样本裂解液的体积比为1:3-5；步骤5）中，核酸吸附磁珠与结合了大肠杆菌的磁珠的体积比为2.5-3.5:2；步骤7）中，DNA洗脱液与核酸吸附磁珠的体积比为1:5-7。
本发明的有益效果为：
本发明使用偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103特异性结合大肠杆菌继而对大肠杆菌进行纯化，然后将纯化后的大肠杆菌用磁珠法提取DNA。整个过程无需大肠杆菌的分离纯化培养，直接进行DNA提取；简化实验过程，极大的节约了实验时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为纯化后gp37蛋白的电泳图；
图2为羧基化纳米磁珠的活化时间对gp37蛋白偶联量影响情况图；
图3为偶联缓冲液的pH对gp37蛋白偶联量影响情况图；
图4为偶联时间对gp37蛋白偶联量的影响情况图；
图5为本发明方法PCR核酸提取的效果图。
具体实施方式
实施例1
一种从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，包括：
1）偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103；
2）样本稀释液（试剂A）；
3）样本裂解液（试剂B）；
4）核酸清洗液（试剂C）；
5）DNA洗脱液（试剂D）；
6）核酸吸附磁珠；
其中，
试剂A的组成为：NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM,0.05％Tween-20。
试剂B的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 5mM, PH=8.0的Tris-HCl 20mM, 溶菌酶3mg/ml。
试剂C的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 0.05mM, PH=8.0 的Tris-HCl 20mM，无水乙醇70%。
试剂D的组成为：EDTA 0.05mM, PH=8.0 的Tris-HCl 10mM。
偶联了gp37蛋白的羧基纳米磁珠Eget103的制备方法为：
a）采用gp37蛋白的大肠杆菌表达***，可溶性表达gp37蛋白并纯化；纯化后的gp37蛋白的蛋白电泳图如图1所示。
b）活化羧基化纳米磁珠；
羧基化纳米磁珠采用商品化的纳米磁珠（苏州海狸生物医学工程有限公司MagCOOH），混匀磁珠后，取100 uL Mag COOH磁珠到1.5 mL离心管中，磁性分离去除上清液，用200 uL MEST溶液（100 mM MES (2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物），pH 5.0，0.05% Tween20）进行磁性分离洗涤2次，然后移除上清液；
迅速加入新鲜配制的 100 μL EDC（二氯乙烷）溶液（10 mg/mL，以上述MEST溶液作分散剂）和100 μL NHS（10 mg/mL，以上述MEST溶液作分散剂）溶液到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30 min，该期间保持磁珠的悬浮状态，利用垂直混合仪进行颠倒混匀；经过上述步骤之后，磁珠表面的羧基已经活化，可以与带有伯氨基的生物配体进行共价偶联。
羧基化纳米磁珠的活化时间对蛋白偶联量影响比较显著，如图2所示，磁珠活化时间最佳为30min，活化时间过长或过短都会影响gp37蛋白偶联量。
c）gp37蛋白与羧基化纳米磁珠偶联。
步骤c）gp37蛋白与羧基化纳米磁珠偶联的具体过程为：
A.磁性分离去除上清液，以1mmol/L的硼酸盐溶液含0.05g/dL的Tween-20（简称BST）作为偶联缓冲液，先用BST清洗磁珠2次，再加入适量BST和150ug纯化后的gp37,体积定容至300uL；其中，偶联缓冲液的pH为8.0-9.0，最优选为8.5。偶联缓冲液的pH对gp37蛋白偶联量影响显著，如图3所示，当偶联缓冲液pH为8.5时，gp37蛋白偶联量最大。
B.25℃偶联4 h，利用垂直混合仪进行颠倒混匀；
偶联时间对gp37蛋白偶联量也有较大影响，如图4所示，偶联时间为4小时，gp37蛋白偶联量最大。
C.离心管置于磁性分离架上磁性分离去除上清液，加入300 uL PBST溶液（pH7.2，且含1%BSA）重悬磁珠，25℃反应1 h封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，该期间保持磁珠的悬浮状态。
D.离心管置于磁性分离器上磁性分离去除上清液，每次用200 uL PBS溶液（pH7.2）或保存溶液洗涤3次后， 重新悬浮于保存溶液（含0.02g/dLNaN3的BST-BSA）中，获得偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103，保存于4℃。
采用试剂盒从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的方法，包括步骤：
1）取1g复杂样本，加入9mL试剂A于50mL的离心管中，充分混匀后，离心，取200μL上清液于1.5mL的离心管中；
2）加入200μL偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103，37℃，100rpm振荡培养15min；
3）置于磁力架磁性分离结合了大肠杆菌的磁珠，移去液体，结合了大肠杆菌的磁珠磁珠采用400μL试剂A清洗至少3遍；
4）向结合了大肠杆菌的磁珠中加入800μL试剂B，于37℃下温育15-20min，裂解菌体；
5）裂解完毕后，将离心管从温育设备中取出，冷却至室温，加入核酸吸附磁珠（购自BioMag 货号：BMQ300) 300μL，室温混匀；将离心管置于磁力架上磁力分离，移除废液并吸净管盖及管底残夜；
6）吸附有核酸的磁珠采用1mL试剂C清洗，磁力分离，吸净管盖及管底残夜；重复上述步骤两次，室温下开盖并干燥；
7）向吸附有核酸的磁珠中加入50μL试剂D，防止于水浴锅中温育后磁力分离，吸取上清液于新的EP管中，-20℃下保存。
图5为利用本发明方法进行核酸提取的效果图，由图5可知，本发明可以有效的提取大肠杆菌的核酸，且提取过程不需要分离纯化样本，可以有效的节约从各种复杂样本中提取核酸的时间。
Claims (7)
1.一种从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，包括：
1）偶联了T4类噬菌体的gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103；
2）样本稀释液；所述样本稀释液的组成为：NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM,KH2PO4 1.4mM, 0.05％Tween-20；
3）样本裂解液；所述样本裂解液的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 5mM, PH=8.0的Tris-HCl 20mM, 溶菌酶 3mg/ml；
4）核酸清洗液；所述核酸清洗液的组成为：NaCl 0.05mM, EDTA 0.05mM, PH=8.0 的Tris-HCl 20mM，无水乙醇70%；
5）DNA洗脱液；所述DNA洗脱液的组成为：EDTA 0.05mM, PH=8.0的Tris-HCl 10mM；
6）核酸吸附磁珠。
2.如权利要求1所述从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，其特征在于， 1）中偶联了gp37蛋白的羧基纳米磁珠Eget103的制备方法为：
a）采用gp37蛋白的大肠杆菌表达***，可溶性表达gp37蛋白并纯化；
b）活化羧基化纳米磁珠；
c）gp37蛋白与羧基化纳米磁珠偶联。
3.如权利要求2所述从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，其特征在于， c）gp37蛋白与羧基化纳米磁珠偶联的具体过程为：
以含有Tween-20的硼酸盐溶液为偶联缓冲液，用所述偶联缓冲液清洗羧基化纳米磁珠；
将所述羧基化纳米磁珠、纯化后的gp37蛋白以及偶联缓冲液混合，20-30℃下偶联2-6小时；磁性分离去除上清液，加入PBST溶液重悬磁珠，20-30℃反应30-90min封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团；
磁性分离上清液，采用PBS或保存溶液洗涤后，置于保存溶液中，4℃保存。
4.如权利要求3所述从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述偶联缓冲液的pH为8.0-9.0。
5.采用权利要求1所述试剂盒从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的方法，其特征在于，包括步骤：
1）取复杂样本，加入所述样本稀释液，混匀后，离心取上清；
2）加入偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103，36.5-37.5℃下振荡培养10-20min；
3）磁性分离结合了大肠杆菌的磁珠，移去液体，结合了大肠杆菌的磁珠磁珠采用样本稀释液清洗；
4）向结合了大肠杆菌的磁珠中加入样本裂解液，于36.5-37.5℃下温育15-20min，裂解菌体；
5）裂解完毕后，冷却至室温，加入核酸吸附磁珠，室温混匀；
6）吸附有核酸的磁珠采用核酸清洗液清洗；
7）向吸附有核酸的磁珠中加入DNA洗脱液，36.5-37.5℃下温育，然后磁性分离，上清液于-20℃下保存。
6.如权利要求5所述从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的方法，其特征在于：步骤1）中，1g复杂样本中加入8-10 mL样本稀释液；步骤2）中偶联了gp37蛋白的羧基化纳米磁珠Eget103与步骤1）上清液的体积比为1:0.6-1.5。
7.如权利要求5所述从复杂样本中提取并纯化大肠杆菌DNA的方法，其特征在于：步骤4）中，结合了大肠杆菌的磁珠与样本裂解液的体积比为1:3-5；步骤5）中，核酸吸附磁珠与结合了大肠杆菌的磁珠的体积比为2.5-3.5:2；步骤7）中，DNA洗脱液与核酸吸附磁珠的体积比为1:5-7。
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