CN107823196A - 鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鼠尾草酸在治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。体外和体内实验表明，鼠尾草酸能够抑制促炎症因子的表达，并且抑制核因子NF‑κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor kappa‑B ligand，RANKL)的产生。更重要的是，研究观察到鼠尾草酸在体外能够抑制破骨细胞生成和骨吸收，并且在体内可以对关节损伤施加治疗保护，在类风湿性关节炎的发展中发挥抗骨质损伤的作用。进一步的生化分析表明，鼠尾草酸还可以RANKL诱导的核因子‑κB和丝裂原活化蛋白激酶(p38和JNK)的活化作用，导致NFATcl的下调。上述结果证明，鼠尾草酸可能被开发为治疗类风湿性关节炎患者的治疗药物，以预防炎症和关节损伤。

Description

鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物方面的应用

技术领域

本发明属于类风湿性关节炎治疗技术领域，尤其涉及鼠尾草酸在治疗类风湿性关节炎 药物方面的应用。

背景技术

类风湿性关节炎是一种以渐进性滑膜炎症和关节损伤为特征的慢性自身免疫性疾病。 由于类风湿性关节炎病人对治疗反应的复杂性，如何治疗依然是我们面临的最大的问题。 非甾体类抗炎药(NSAIDs)在临床上被用来减少炎症，但其对预防类风湿性关节炎骨损伤 的功效较弱。虽然缓解抗风湿性药物，包括α-肿瘤坏死因子(TNFα)和白细胞介素-1β(IL-1β)的抑制剂，已经被证明对类风湿性关节炎患者是一种有效且前景不错的治疗方法。但是，长期摄入这些药物会引起严重的感染甚至会患恶性肿瘤。因此，我们急需开发 新型的治疗类风湿性关节炎补充和替代药物，以预防炎症和关节损伤，减少不良反应的产生。

迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)不仅是作为调味品，也作为食品、化妆品、营养补充剂的抗氧化剂而被广泛使用和商业化。鼠尾草酸，是一种从迷迭香叶中分离出来的主要酚类化合物，据研究，除了其强大的抗氧化性能之外，鼠尾草酸还具有重要的抗菌、抗炎、抗癌保肝和化学预防的功效。Yu等人(2009)研究表明，鼠尾草酸能够抑制IL-1β 诱导的NF-κB的激活(Yu Y-M，Lin C-H，Chan H-C，Tsai H-D.2009.Carnosic acid reducescytokine-induced adhesion molecules expression and monocyte adhesion toendothelial cells. European journal of nutrition 48(2)：101-106.)。众所周知，NF-κB的激活对破骨细胞生成以 及对与破骨细胞过度激活导致的疾病十分重要。类风湿关节炎骨侵蚀即是破骨细胞过度激 活所致，所以发明人推测，鼠尾草酸对类风湿性关节炎可能存在潜在的治疗作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物方面 的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。

鼠尾草酸在制备治疗胶原诱导性关节炎药物方面的应用。

鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎的抗关节损伤药物方面的应用。

鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎的抗炎药物方面的应用。

针对现有治疗类风湿性关节炎骨损伤的药物存在价格昂贵、毒副作用较大等问题，发 明人结合鼠尾草酸抗炎性的临床应用，以及其可能对抑制破骨细胞生成和抑制骨侵蚀产生 的作用，通过探讨鼠尾草酸对体外培养的小鼠破骨细胞、人类类风湿性关节炎成纤维细胞 样滑膜细胞(RAFLS)和胶原诱导性关节炎(CIA)的大鼠的影响，发现鼠尾草酸是一种对治 疗类风湿性关节炎很有前景的天然化合物。体外和体内进行的研究表明，鼠尾草酸能够抑 制促炎症因子的表达，其中促炎症因子包括α-肿瘤坏死因子(TNFα)，白细胞介素-1β (IL-1β)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8)， 白细胞介素-17(IL-17) 和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)，并且抑制RANKL的产生。更重要的是，研究观察到鼠尾草 酸在体外能够抑制破骨细胞生成和骨吸收，并且在体内可以对关节损伤施加治疗保护，在 类风湿性关节炎的发展中发挥抗骨质损伤的作用。进一步的生化分析表明，鼠尾草酸还可 以抑制RANKL诱导的核因子-κB和丝裂原活化蛋白激酶(p38和JNK)的活化作用，导致 NFATc1的下调。上述结果证明，鼠尾草酸可能被开发为治疗类风湿性关节炎患者的治疗药 物，以预防炎症和关节损伤。

附图说明

图1是鼠尾草酸以剂量依赖性的方式抑制核因子-κB受体活化因子配体诱导的破骨细 胞分化且无细胞毒性研究结果图。图中：

(A)鼠尾草酸的分子结构。

(B)鼠尾草酸可明显抑制破骨细胞的分化。用不同浓度的鼠尾草酸处理，然后用核因子-κB受体活化因子配体(100纳克/毫升)刺激5天(标尺＝100微米)后的破骨细胞 培养物的代表性图。

(C)破骨细胞的定量分析。对(B)图中的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞(≥3个细胞核)进行计数。核因子-κB受体活化因子配体处理的、鼠尾草酸未处理组为对照， n＝3；*，P＜0.05，***P＜0.001。

(D)通过MTS检测鼠尾草酸对骨髓来源巨噬细胞活力的影响。

(E)鼠尾草酸对RAW264.7细胞凋亡的影响。用不同浓度的鼠尾草酸孵育RAW264.7细胞24小时，然后用流式细胞术进行细胞凋亡分析。

图2是鼠尾草酸抑制破骨细胞功能研究结果图。图中：

(A)鼠尾草酸明显抑制破骨细胞的骨吸收能力。在羟基磷灰石涂层的抗酒石酸酸性 磷酸酶染色和破骨吸收的代表性图像(比例尺＝500微米)。

(B)抗酒石酸酸性磷酸酶离子多核细胞(≥3个细胞核)数量的定量分析图。

(C)使用图像J软件测量羟基磷灰石表面吸收的面积形成的图表，鼠尾草酸未处理组为对照，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。

(D)实时荧光定量PCR定量分析破骨细胞分化过程中marker基因的表达。用不同浓度的鼠尾草酸处理和100纳克/毫升核因子-κB受体活化因子配体孵育骨髓来源巨噬细胞，5天后检测破骨细胞特异性基因信使核糖酸(降钙素受体(CTR)，组织蛋白酶K(CTSK) 和TRAP)的相对表达。β-肌动蛋白为内参基因。鼠尾草酸未处理且核因子-κB受体活化 因子配体处理组为对照，n＝3，*P＜0.05，***P＜0.001。

图3是鼠尾草酸抑制破骨细胞分化的机制分析。图中：

(A)Western blot检测鼠尾草酸对MAPK和NF-κB信号通路的影响。用鼠尾草酸(5微摩尔)预处理骨髓来源巨噬细胞1小时后，然后用核因子-κB受体活化因子配体(100 纳克/毫升)处理0分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟，裂解蛋白并利 用蛋白印迹法检测p-ERK1/2，total ERK1/2，p-p38，total p38，p-JNK，total JNK， IκBα和β-肌动蛋白的表达情况。

(B)蛋白表达的定量分析。通过光密度分析测定相对表达。使用图像J软件确定IκBα 条带相对于β-肌动蛋白条带和每个磷酸化MAPK条带的密度相对于其总蛋白质对应物的比 率图表。n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，核因子-κB受体活化因子配体处理且鼠尾草酸 未处理组为对照。

(C)鼠尾草酸对NF-κB转录活性的影响。用不同浓度鼠尾草酸预处理NF-κB荧光 素酶报道基因构建体稳定转染的RAW264.7细胞1小时，然后用核因子-κB受体活化因子 配体诱导6小时。测量NF-κB荧光素酶活性。核因子-κB受体活化因子配体处理且鼠尾 草酸未处理的细胞为对照，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001。

图4是鼠尾草酸抑制核因子-κB受体活化因子配体诱导的NFATc1的活化作用和钙振 荡研究结果图。图中：

(A)鼠尾草酸对NFAT转录活性的影响。不同浓度鼠尾草酸处理NFAT荧光素酶报道基因构建体稳定转染的RAW264.7细胞1小时，然后用核因子-κB受体活化因子配体诱导 24小时。测量NFAT荧光素酶活性。核因子-κB受体活化因子配体处理且鼠尾草酸未处理 的细胞为对照，n＝3，**P＜0.01。

(B)蛋白印迹法检测NFATc1和c-fos的表达。用鼠尾草酸(5微摩尔)预处理骨髓来源巨噬细胞1小时，然后在指定的时间内用核因子-κB受体活化因子配体(100纳克/毫 升)进行刺激。提取蛋白并进行NFATc1，c-fos和β-肌动蛋白的表达分析，其中β-肌 动蛋白的表达为内参。

(C)NFATc1和c-fos的定量分析。相对于核因子-κB受体活化因子配体处理的，鼠尾草酸未处理的对照组，利用Image J分析软件分析确定NFATc1和c-fos带相对于β- 肌动蛋白带的比率。n＝3，*P＜0.05。

(D)鼠尾草酸对RAW264.7细胞钙振动的影响。实验分为3组：仅有重组巨噬细胞集落刺激因子刺激的为阴性对照组(NEG)；仅有核因子-κB受体活化因子配体刺激的为阳性对照组(POS)；核因子-κB受体活化因子配体和鼠尾草酸(5微摩尔)共同处理组。左图 为三组钙震荡的代表性图片。右图为钙振荡的定量分析(最大峰强度减去基线强度，n＝ 20)。

图5是鼠尾草酸抑制α-肿瘤坏死因子诱导的类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞 产生的促炎因子的研究结果图。图中：

(A)实时定量PCR分析鼠尾草酸对α-肿瘤坏死因子诱导的炎性因子表达情况。不同浓度的鼠尾草酸处理类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞1小时，α-肿瘤坏死因子处理24小时后，实时PCR荧光定量分析a-肿瘤坏死因子(TNFa)，白细胞介素-1β(IL-1β)， 白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-17(IL-17)、基质金属蛋 白酶-3(MMP-3)和核因子-κB受体活化因子配体的表达。β-肌动蛋白编码基因作为内参， α-肿瘤坏死因子处理的且鼠尾草酸未处理组为对照。n＝3，**P＜0.01，***P＜0.001。

(B)MTS检测鼠尾草酸对类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞存活力的影响。

图6是鼠尾草酸显著地抑制胶原诱导性关节炎的发展。图中：

(A)胶原诱导性关节炎大鼠的后爪在症状发作后第14天的代表性照片。

(B)鼠尾草酸对胶原诱导大鼠关节炎指数评分的影响。足爪肿胀的影响；

(C)鼠尾草酸对胶原诱导大鼠足爪肿胀的影响(D)鼠尾草酸对胶原诱导大鼠体重的 影响。

(E)通过ELISA检测不同组踝关节中α-肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β的产生。(健康大鼠，n＝6；单纯胶原诱导组和药物治疗组，n＝8)

(F)通过蛋白印迹分析法，测定关节匀浆中核因子-κB受体活化因子配体的蛋白质水平(代表性图片)；

(G)核因子-κB受体活化因子配体的表达定量(n＝4)。##P＜0.01和###P＜0.001，与健康对照组相比较；*P＜0.05和**P＜0.01，与单纯CIA模型组比较。

图7是鼠尾草酸显著抑制胶原诱导性关节炎大鼠的关节破坏结果图。图中：

(A)X光片显示鼠尾草酸对大鼠后爪骨破坏的影响(代表性图片)。

(B)对X光片的影像学评分结果。

(C)通过微计算机断层分析关节骨体积(BV)和骨表面与骨体积之间的比例(BS/BV)。

(D)通过微计算机断层扫描后爪的代表性的三维再现。

(E)踝关节的代表性纵向中段。

(F)来自不同组的大鼠脚踝的苏木精-曙红代表性染色结果。

(G)对病理学切片的评分结果。评分方法见“材料与方法”部分。##P＜0.01和### P＜0.001，与健康对照组相比较；*P＜0.05和**P＜0.01，与单纯CIA模型组比较。每 组n＝6-8。

具体实施方式

鼠尾草酸抑制在体内破骨细胞和成纤维细胞样滑膜细胞以及大鼠体外胶原诱导性关节炎 的炎症反应和关节破坏的研究

一、材料与方法

1.材料及其来源

鼠尾草酸(纯度≥98％)购买于曼斯特生物科技有限公司(中国，四川成都)，溶于二 甲基亚砜。α-最小必须培养基和胎牛血清购买于TRACE(澳大利亚，悉尼)。重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB受体活化因子配体蛋白(RANKL)购买于安迪生物 科技有限公司(美国，明尼阿波利斯)。MTS试剂和荧光素酶分析试剂从普洛麦格公司(澳大 利亚，悉尼)中获得。抗体IκBα，ERK，JNK，p38，phosphorylated(p)ERK，p-p38， p-JNK，and β-actin购买于Santa Cruz Biotechnology(美国，加利福尼亚州，达拉 斯)。Anti-NFATc1和anti-c-fos抗体购买于BD生物科学(美国，加利福尼亚州，圣何 塞)。抗核因子-κB受体活化因子配体抗体购买自爱美捷科技有限公司(英国，剑桥)。抗 酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒从西格玛奥德里奇贸易有限公司(澳大利亚，悉尼)购买。 α-肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β ELISA试剂购买于华美生物工程有限公司(中国，武 汉)。冻干鸡II型胶原(CII)购买于西格玛化工公司(美国，密苏里州，圣路易斯)，并 溶于浓度为3毫克/毫升，温度为4℃的0.05摩尔/升乙酸中。

2.研究分析方法

2.1体外破骨细胞生成分析法

进行体外破骨细胞生成分析的目的，是为了检测鼠尾草酸对破骨细胞分化的影响。按 照我们之前分离骨髓来源巨噬细胞(BMM cells)的方法(Liu M，Xu L，Ma X，Xu J，Wang J，Xian M，等人(2015).MAGED1是小鼠骨重塑的负调节物。《美国病理学杂志》185(10)： 2653-2667)，把细胞放置于浓度为每6000 BMMs/孔板中(重复三个孔)，培养24小时后，， 将BMM cells分别与不同浓度的鼠尾草酸孵育，培养基中含有100纳克/毫升核因子-κB 受体活化因子配体和30纳克/毫升重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。培养液每隔一天更换一次。五天后，利用抗酒石酸酸性磷酸酶进行染色，并计算抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数目(核数量多于三个为破骨细胞)。

2.2细胞活性分析法

使用MTS分析法来检测鼠尾草酸对BMM细胞和类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细 胞活性的影响。对BMM细胞活性而言，按照6*10³个细胞/孔板将细胞种植牙96孔板中，并用不同浓度的鼠尾草酸(0，0.5，1，2.5，5，10，20微摩尔)进行处理48小时。对类 风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞的活力而言，按照5*10³个细胞/孔将细胞种植于96 孔板中，并用不同浓度鼠尾草酸(0，0.5，1，2.5，5，10，20微摩尔)孵育48小时。MTS 检测根据试剂盒说明书进行。用酶标仪(伯齐科技有限公司，奥尔滕贝格，德国)在490纳 米处测定吸光度。

2.3用流式细胞术检测细胞凋亡

根据Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书(e-Bioscience，加利福尼亚州，圣地亚哥)， 用不同浓度鼠尾草酸(0，1，2.5，5，10，20微摩尔)处理RAW264.7细胞24小时，并用 膜连蛋白-V和碘化丙啶溶液染色。采用CellQuest program分析软件进行流式细胞仪分析，每组中的凋亡细胞用百分率表达。

2.4羟基磷灰石吸收法

把BMM细胞接种在包被有胶原蛋白的6孔板中(密度为1*10⁵个细胞/孔)进行培养，核因子-κB受体活化因子配体(100纳克/毫升)和重组巨噬细胞集落刺激因子(30纳克/ 毫升)刺激2至3天。当破骨细胞开始形成的时候，解离细胞并将相同数目的破骨细胞接 种到羟基磷灰石涂层板(CLS3989，美国，康宁)上。在重组巨噬细胞集落刺激因子和核 因子-κB受体活化因子配体存在的情况下，用鼠尾草酸处理细胞48小时。然后，一半的 孔用2.5％戊二醛固定，并进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，剩余的孔用10％漂白溶液漂白 除去细胞。光学显微镜观察，并使用Image J软件分析羟基磷灰石吸收的范围。

2.5实时荧光定量PCR分析

采用实时荧光定量PCR分析法检测破骨细胞特异性基因在成熟的破骨细胞中的表达水 平，检测细胞因子在α-肿瘤坏死因子诱导的类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞中的 表达水平。为了检测破骨细胞特异性基因的表达，将BMM细胞按照1*10⁵的细胞/孔接种于 6孔中，在30纳克/毫升的重组巨噬细胞集落刺激因子和100ng/ml核因子-κB受体活化因子配体存在的情况下，用不同浓度的鼠尾草酸(0，1，2.5，5微摩尔)持续处理5天。 用试剂盒(生命科技，澳大利亚，马尔格雷夫)提取总的核糖核酸(RNA)，并对 核糖核酸(RNA)进行互补DNA合成和实时荧光定量PCR分析。定量分析的基因包括组织 蛋白酶K(ctsk)，降钙素受体(CTR)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)，以β-肌动蛋白为 内参进行相对表达分析。上述基因的的引物对见文献(Liu M，Xu L，Ma X，Xu J，Wang J， Xian M，等人(2015).MAGED1是小鼠骨重塑的负调节物。《美国病理学杂志》185(10)： 2653-2667)。

除此之外，我们还检测了α-肿瘤坏死因子刺激的炎性因子的表达。将类风湿性关节 炎-成纤维细胞样滑膜细胞种植于12孔板中，用不同浓度的鼠尾草酸(0，5，10微摩尔)预处理1小时后，α-肿瘤坏死因子(50纳克/毫升)温育24小时，提取总的核糖核酸(RNA) 并进行实时荧光定量PCR分析。检测基因包括白细胞介素-6，白细胞介素-8，白细胞介素 -17，白细胞介素-1β，α-肿瘤坏死因子，基质金属蛋白酶-3和RANKL，以β-肌动蛋白 的表达为内参，检测上述各基因的相对表达。每个实验用三个平行反应，重复三次。

2.6核因子-κB(NF-κB)和NFAT荧光素酶测定

将转染有NF-κB和NFATc1的稳定细胞株RAW264.7种植于48孔板中，用不同浓度的鼠尾草酸(0，1，2.5，5，10微摩尔)预处理细胞1小时后，分别用RANKL处理6小时和 24小时，然后采用荧光素酶试剂盒进行报告基因的检测。

2.7蛋白印迹分析

收集并按照5*10⁵个细胞/孔的密度接种BMM细胞于6孔板中，分别用含鼠尾草酸和不 含鼠尾草酸的PBS处理1小时后，RANKL(100纳克/毫升)刺激不同的时间段，在裂解缓 冲液中溶解细胞，其中裂解缓解液中含有50mM Trise盐酸，150mM氯化钠、5mMEDTA、1％Triton X-100，1mM氟化钠，1mM的钒酸钠，1％脱氧胆酸盐，以及蛋白酶抑制剂混合物。 离心收集上清液中的蛋白质，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)， 接着将蛋白转移到硝酸纤维素膜。使用免疫印迹分析法检测磷酸化p38，磷酸化ERK、磷 酸化JNK、总p38，总ERK1/2、总JNK、IκB，NFATc1，c-Fos和β-肌动蛋白的水平。 最后，利用图像J软件进行灰度分析。

2.8细胞内钙离子振荡测量

根据制造商的方法指示说明，使用钙结合染料Fluo4-AM研究钙离子振荡(分子探针， 澳大利，亚斯科斯，赛默飞世尔科技公司)。用鼠尾草酸(5微摩尔)处理BMM细胞1小时，之后在重组巨噬细胞集落刺激因子存在的情况下使用100纳克/毫升RANKL刺激24小时。 阴性和阳性对照分别为单纯M-CSF刺激组和单纯RANKL刺激组。钙离子振荡测量时，使用 5微摩尔钙离子荧光探针(分子探针，澳大利亚，维多利亚州)和0.05％普朗尼克F-127 钙荧光探针(赛默飞世尔)，在室内温度放置细胞30分钟。测定缓冲液洗涤细胞三次后， 在室内温度继续孵育细胞20分钟，并使用激发波长为488纳米的倒置荧光显微镜(尼康 Ti-U)进行观察。每隔3分钟捕获图像2秒钟。使用尼康的Nikon Basic Research软件分析， 研究至少有2个振荡的细胞的平均峰值高度(最大峰值强度减去基线强度)。计算每个孔 的超过20个细胞，每一次计算重复三个孔。

2.9胶原诱导性关节炎模型的构建与鼠尾草酸的药物治疗

从共有26只体重在160克-180克雌性维斯塔鼠购买于上海斯莱克实验动物有限公司 (中国，上海)购买雌性Wistar大鼠26只(体重在160克-180克左右)。将大鼠饲养在 特定的无病原体(SPF)条件下(22℃，12h/h光/暗，50％-55％湿度)并给它们提供食物 和水。在一周的适应期后，使用与弗氏完全佐剂相等体积(美国，穆村，圣路易斯，西格 玛)的100微克鸡II型胶原(CII，美国，穆村，圣路易斯，西格玛)进行皮内注射免疫， 此时标记为第0天。7天后，给大鼠皮下注射等量的在弗氏不完全佐剂里乳化的CII。以 同样的方式给对照组大鼠注射生理盐水(n＝6)。在关节炎症状发作时(临床关节炎指数 评分≥2)，将罹患关节炎的大鼠随机分为两组，分别是模型组和鼠尾草酸处理组。鼠尾草 酸处理组每隔一天在腹腔内注射鼠尾草酸(5mg/kg的鼠尾草酸溶于0.9％生理盐水)，模 型组每隔一天注射0.9％生理盐水，实验周期为14天。自从第一次免疫后的第9天开始， 每天使用0～4的临床关节炎评分***评价每个后肢的临床关节炎分数：0＝没有关节炎； 1＝一个或两个指骨间(IP)关节肿胀或发红；2＝三个或四个指骨间(IP)关节患有关节 炎的或者有一个较大的关节患有关节炎；3＝超过有四个关节发红或肿胀；4＝整个爪子患 有严重的关节炎，每只动物得分在0分-16之间。此外，使用足爪测量仪(YLS-7A，山东 医学科学院设备站)测定爪子的水肿程度。评分和足爪测量由两位对分组不知情的测试人 员实施。此外，计算关节炎发作后每只患病大鼠体重(％)的变化，公式如下：体重变化＝ [(患病第15天的体重/患病第1天的体重)-1]*100％。所有动物实验均由南京师范 大学实验委员会批准。

为了测定胶原诱导性关节炎大鼠的细胞因子水平，分离踝关节，通过含有蛋白酶抑制 剂混合物的裂解缓冲液(T-PER动物组织蛋白提取试剂；赛默飞世尔)提取组织匀浆液， 用ELISA检测试剂盒测定α-肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平。 如先前所述，采用蛋白印迹分析法，检测踝关节匀浆中的RANKL表达。

2.10影像学评估

利用美国柯达公司的多功能小动物活体成像***，通过X光射线观察CIA大鼠后肢足 爪。参数设定为35千伏拍摄，曝光时间30秒。根据文献(Cai X，Zhou H，Wong YF，Xie Y，Liu ZQ，Jiang ZH，et al.(2007).通过QFGJS抑制大鼠中胶原诱导的关节炎的发生 和进展，所述QFGJS是来自抗关节炎中草药配方。《民族医药学杂志》10(1)：39-48)报 道的评分***，评价关节破坏程度。根据每只大鼠的两只后爪的评分总和，计算总的影像 学评分，最大值为6分。观察者对分组情况不清楚。

2.11组织病理学评分

将足爪固定在4％的多聚甲醛中，在12％乙二胺四乙酸二钠中脱钙，并包埋在石蜡中。用苏 木精-曙红(H&E)对切片(4微米)进行染色并光镜观察。参考文献(Sims NA，GreenJR，Glatt M，Schlict S，Martin TJ，Gillespie MT，Romas E.2004.Targetingosteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis.Arthritis& Rheumatism 50(7)：2338-2346.)，对骨侵蚀和炎症评价进行关节炎的组织病理学评估。 评分者对实验分组情况不清楚。

2.12显微CT扫描分析骨破骨

为了进一步分析踝关节的骨病灶侵蚀，通过显微CT扫描大鼠踝关节(显微CT，布鲁克， 比利时，孔蒂赫)并进行三维重建。我们手工绘制包括跗关节和跟关节在内的整个踝关节 为兴趣区域(ROI)，计算整个关节的骨体积(BV)和骨表面(BS)。为了评估骨表面的局 部侵蚀，计算比率BS/BV。

2.13统计分析

结果表示为从三次或更多次实验得到的结果的平均±SD。采用非配对双尾t检验进行 数据统计分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。

三、结果

3.1鼠尾草酸在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化及其功能

为了研究鼠尾草酸对破骨细胞分化的影响，将培养的BMM细胞与不同浓度的鼠尾草酸 一起孵育，经M-CSF和RANKL刺激5天后进行TRAP染色，发现鼠尾草酸以剂量依赖性方式明显抑制破骨细胞的分化(图1B、C)。经5微摩尔鼠尾草酸处理后，只有50％的破骨细 胞数形成(图1C)。为了排除鼠尾草酸对BMM细胞的毒性影响，我们进行了细胞活力检测。 如图1D所示，鼠尾草酸即使在高达20微摩尔的浓度下，也不会抑制BMM细胞的活性或增 殖。以往的研究表明，鼠尾草酸能诱导多种癌细胞的凋亡，因此，发明人调查其是否对破 骨细胞分化产生影响。RAW264.7细胞用一系列浓度的鼠尾草酸处理24小时后，并通过流 式细胞仪器评估细胞凋亡情况。如图1E所示，鼠尾草酸即使在20微摩尔也不影响细胞凋 亡，这表明鼠尾草酸对破骨细胞的抑制作用并不是由细胞凋亡导致的。

在明确了鼠尾草酸能够抑制破骨细胞的分化后，发明人用羟基磷灰石吸收法测定了鼠 尾草酸是否会损害破骨细胞骨吸收的功能。如图2A-C所示，鼠尾草酸能够以剂量依赖的 方式显著地减少羟基磷灰石再吸收的面积，在5微摩尔时减少到55％。为了进一步评估鼠 尾草酸对破骨细胞形成和功能的抑制作用，发明人随后通过实时定量PCR检测了RANKL诱 导的破骨细胞标志基因CTR，CTSK和TRAP的mRNA表达水平，结果发现，鼠尾草酸显著地抑制破骨细胞的一系列标志基因表达(图2D)，这进一步证实了鼠尾草酸对破骨细胞形成的抑制作用。综上研究结果表明，鼠尾草酸抑制体外培养的破骨细胞的骨吸收功能。

3.2鼠尾草酸抑制RANKL诱导的MAPK和NF-κB的激活

为进一步探索鼠尾草酸抑制破骨细胞分化和活性的潜在机制，发明人通过免疫印迹法 检测了破骨细胞形成过程中两条重要的信号通路MAPK和NF-κB。如预期，RANKL刺激10分钟，三个MAPK家族成员，细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和 p38激酶的磷酸化水平明显增加，可持续至30分钟(图3A，B)。而鼠尾草酸可明显抑制 JNK和p38的磷酸化(图3A，B)。鼠尾草酸对RANKL诱导的ERK的磷酸化水平没有明显影 响。

除了MAPK信号通路外，发明人还通过免疫印迹和荧光素酶报告基因的测定来分析了 鼠尾草酸对NF-κB信号通路的影响。如图3A和3B所示，免疫印迹分析显示RANKL刺激 后，NF-κB的抑制亚基IkBa在10分钟内迅速降解，但这种降解会被5微摩尔的鼠尾草 酸明显抑制。发明人进一步利用NF-κB的荧光素酶报告基因，发现鼠尾草酸能够以剂量 依赖的形式抑制NF-κB的转录活性(图3C)。

3.3鼠尾草酸抑制了RANKL诱导的NFATc1活性

NFATc1是破骨细胞的分化和功能的主要调控因子。发明人随后通过荧光素酶报告基因 的检测分析了鼠尾草酸对RANKL诱导的NFATc1活性的影响。结果表明，当RANKL刺激RAW264.7细胞时，NFATc1的转录活性增加。鼠尾草酸以浓度依赖性的方式显著抑制其活 性(图4A)。为了进一步探讨鼠尾草酸对NFATc1表达的影响，采用蛋白印迹法分析对了NFATc1的蛋白水平。结果如图4B和4C所示，RANKL能够明显提高NFATc1的蛋白表达， 而鼠尾草酸能够减弱NFATc1的蛋白水平。众所周知，转录因子c-fos是通过NFATc1启动 因子来调节NFATc1的表达。发明人随后也检测了c-fos基因的表达情况，结果如图4B和 4C所示，鼠尾草酸明显抑制c-fos基因的蛋白表达水平，这也进一步证实了鼠尾草酸对 RANKL诱导的NFATc1表达起抑制作用。

细胞内钙离子振荡是RANKL诱导的破骨细胞分化过程中NFATc1的激活所必需的(Negishi- Koga T，Takayanagi H.2009.Ca2+-NFATc1 signaling is an essential axisof osteoclast differentiation.Immunological reviews 231(1)：241-256.)。考虑到鼠尾草酸对NFATc1活性的抑 制作用，发明人接着检测了鼠尾草酸对由RANKL刺激的细胞质内钙离子振荡的影响。结果 表明，鼠尾草酸可以显著抑制RANKL诱导的钙离子振荡强度，这与荧光素酶报告基因检测 以及蛋白印迹分析结果一致(图4D)。

3.4鼠尾草酸处理明显地抑制在α-肿瘤坏死因子诱导的类风湿性关节炎成纤维细胞样滑 膜细胞的细胞因子的产生

鼠尾草酸已被证明是一种非常有效的抗炎药物(Rau O，Wurglics M，Paulke A，Zitzkowski J， Meindl N，BockA，et al.(2006).Carnosic acid and carnosol，phenolicditerpene compounds of the labiate herbs rosemary and sage，are activators ofthe human peroxisome proliferator-activated receptor gamma.Planta medica 72(10)：881-887；

Kuo C-F，Su J-D，Chiu C-H，Peng C-C，Chang C-H，Sung T-Y，et al.(2011).Anti-inflammatory effects of supercritical carbon dioxide extract and itsisolated carnosic acid from Rosmarinus officinalis leaves.Journal ofagricultural and food chemistry 59(8)：3674-3685.)。为了确定鼠 尾草酸是否在类风湿性关节炎中也起到抗炎的作用，发明人检测了α-肿瘤坏死因子诱导 的类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞中的多种细胞因子水平。如图5A所示，鼠尾草 酸以浓度依赖性的方式显著减少α-肿瘤坏死因子介导的α-肿瘤坏死因子(TNFα)，白细 胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介 素-17(IL-17)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达。此外，RANKL是破骨细胞分化和 激活最重要的调控因子，发明人检测发现，鼠尾草酸也能够显著抑制RANKL的表达水平。 MTS检测细胞活力发现，鼠尾草酸即使在高达20微摩尔时，对类风湿性关节炎-成纤维细胞 样滑膜细胞存活率没有影响(图5B)。

3.5鼠尾草酸对关节炎严重程度以及对关节炎发展进程的影响

为进一步明确鼠尾草酸对类风湿关节炎的可能治疗效果，发明人建立了胶原诱导的类 风湿关节炎大鼠模型。将那些已经罹患关节炎的大鼠(临床关节炎指数评分≥2)分为两 组，一组每隔一天注射鼠尾草酸(5毫克/千克，溶解于5％的DMSO/95％的PBS)，另一组只注射5％的DMSO/95％的PBS，14天为一期。如图6A所示，注射5％的DMSO/95％的PBS的胶 原诱导性关节炎大鼠能够明显观察到例如红斑和肿胀的关节炎症状，而鼠尾草酸能够显著减弱关节炎的严重程度。相比于对照组，鼠尾草酸药物处理组大鼠关节炎指数评分最高为4.2，降低了30％(图6B)。足爪测量结果也进一步证明了这一点(图6C)。由于体重的减 轻与类风湿性关节炎的临床积极进展有关，为此发明人检测了关节炎发病后体重的变化。 如图6D，鼠尾草酸处理组可以有效地抑制胶原诱导性关节炎大鼠体重的减轻。为进一步评 价在胶原诱导性关节炎大鼠中的抗炎作用，发明人检测了大鼠踝关节匀浆中α-肿瘤坏死因 子(TNFα)和白细胞介素-1β(IL-1β)的变化，结果发现：鼠尾草酸能够显著抑制关节 组织中TNFα和IL-1β的合成(图6C)。蛋白印迹分析结果显示，鼠尾草酸还降低关节组 织中RANKL蛋白质的合成，这一点与体外实验结果一致。鼠尾草酸导致的RANKL的减少， 可能对胶原诱导性关节炎动物骨破坏带来一定的保护作用(图6F，G)。

3.6鼠尾草酸处理能够抑制胶原诱导性关节炎动物的骨破坏

使用X射线、显微CT和组织学评分，发明人研究了鼠尾草酸对胶原诱导性关节炎大鼠关节破坏的影响。在X射线成像条件下，无关节炎的健康大鼠表现出正常的关节结构和关节间隙。无药物处理的关节炎大鼠表现出具有典型的关节破坏，关节移位以及关节间隙狭窄的类风湿性关节炎(图7A)。然而，放射学检测结果和平均放射学性分数表明，鼠尾 草酸处理组大鼠中的关节破坏被显著地抑制(图7A，B)。显微CT也进一步显示，与健康 对照组大鼠相比，胶原诱导性关节炎大鼠的踝关节周围骨显示骨体积的显著减少(BV)和 参数量化的表面密度增加(BS/BV)，而鼠尾草酸处理的关节炎大鼠则能够抑制骨体积和骨 表面与骨体积之间的比例的变化，表明鼠尾草酸具有防止局灶性骨侵蚀中的潜在的保护作 用(图7C)。此外，组织病理学评分也表明，罹患关节炎的大鼠踝关节中具有滑膜增生、 炎症细胞浸润、软骨损伤以及骨侵蚀(图7F)等病理学特征，而鼠尾草酸处理后的大鼠其 踝关节的滑膜炎症和骨破坏表现出显著的改善(图7F，G)。

四、讨论

鼠尾草酸，是在迷迭香的叶子中发现的含量最高的抗氧化剂，除了其被证实具有抗氧化活 性之外，它在许多细胞和动物模型也发挥强有力的抗炎特性。RAU等人(2006)将鼠尾 草酸的抗炎效果归因于其对过氧化物酶体增殖物激活受体γ的活化作用(Kuo C-F，Su J-D， Chiu C-H，Peng C-C，Chang C-H，Sung T-Y，et al.(2011).Anti-inflammatoryeffects of supercritical carbon dioxide extract and its isolated carnosicacid from Rosmarinus officinalis leaves.Journal of agricultural and foodchemistry 59(8)：3674-3685；

Rau O，Wurglics M，Paulke A，Zitzkowski J，Meindl N，Bock A，et al.(2006).Carnosic acid and carnosol，phenolic diterpene compounds of the labiate herbsrosemary and sage，are activators of the human peroxisome proliferator-activated receptor gamma.Planta medica 72(10)： 881-887)。另有一些研究表明，鼠尾草酸可以通过抑制细胞因子和趋化因子如α-肿瘤坏死 因子、白细胞介素-1β，白细胞介素-6，白细胞介素-8，MCP-1，CCL5，CXCL10，发挥在 LPS刺激的巨噬细胞和角质形成细胞中的直接抗炎作用(Tsai T-H，Chuang L-T，Lien T-J，Liing Y-R， Chen W-Y，Tsai P-J(2013).Rosmarinus officinalis Extract Suppresses Propionibacterium acnes-InducedInflammatory Responses.Journal of medicinal food 16(4)：324-333.)。基于以往的观察，发明人推断， 鼠尾草酸可能会通过抗炎而减弱类风湿性关节炎的严重程度。体内外实验也证明了这一 点，主要证据如下：1)鼠尾草酸抑制了TNFα诱导的关节炎滑膜成纤维细胞多种炎性因子 的分泌，包括α-肿瘤坏死因子、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞 介素-17以及基质金属蛋白酶-3(MMP-3)；2)鼠尾草酸下调了关节炎大鼠踝关节匀浆中α- 肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β的合成；3)鼠尾草酸降低了在关节炎滑膜细胞和胶原诱 导大鼠中RANKL的表达；4)鼠尾草酸在临床和组织病理学水平上降低了胶原诱导性关节炎 大鼠的炎症反应。总之，鼠尾草酸在类风湿性关节炎中的抗炎作用，与以往在其他炎症性 疾病的鼠尾草酸的研究结果相似。换言之，鼠尾草酸在类风湿性关节炎中的抗炎作用体现 在对一系列的炎性细胞因子表达的抑制作用。

在类风湿性关节炎治疗中，最重要的临床问题之一是渐进性的关节损伤，这与功能性 障碍密切相关。虽然大多数抗类风湿性关节炎药物成功地改善了关节炎症，但它们在防止 关节破坏方面具有较少的功效。在本项研究中，发明人第一次证明，鼠尾草酸不仅能抑制 关节炎症，而且还能抑制体外破骨细胞分化和体内骨破坏。破骨细胞负责骨吸收，是关节 受损的主要效应细胞。体外研究表明，鼠尾草酸能够显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化 和骨吸收活性，并且这种抑制作用与细胞增殖和凋亡没有任何关系。与体外研究结果相一 致，体内数据表明，影像学评分、显微CT扫描和组织病理学评分一致显示，鼠尾草酸显著降低了由胶原诱导性关节炎引起的关节损伤。发明人进一步推测，鼠尾草酸所具有的对体外破骨细胞生成和体内骨破坏的抑制作用，可能通过抑制NF-κB和MAPK活性来实现的。

众所周知，RANKL介导的NF-κB通路在破骨细胞的形成和激活中十分重要。RANK和RANKL之间相互作用，导致IκB通过蛋白酶体的快速降解以及随后NF-κB的释放，NF-κB 移位到核中并且启动破骨细胞标记基因的转录。在本研究中，发明人发现，鼠尾草酸明显 抑制了NF-κB信号通路，表现为IκBα的降解和NF-κB的转录激活水平均受到抑制。 除了NF-κB信号通路，RANKL诱导的三个MAPK家族成员ERK、JNK和p38的激活在破骨细 胞分化激活和生存中也发挥着重要的作用。本研究发现，鼠尾草酸能够抑制RANKL诱导的 JNK和p38的磷酸化水平。然而，ERK的磷酸化不受鼠尾草酸的抑制。这些数据表明，鼠 尾草酸可能通过多条信号通路抑制破骨细胞的分化，其直接作用靶点仍需进一步揭示。

众所周知，NFATc1位于RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路下游，是破骨细胞分化和激活过程中最关键的转录因子。在本项研究中，RANKL诱导的NFATc1的蛋白表达和转录活性均受到，鼠尾草酸显著抑制。而且鼠尾草酸还明显抑制了NFATc1的上游基因c-fos 的蛋白表达，其下游靶基因TRAP、CTR和CTSK也被显著下调，众多证据一致证明了NFATc1 在鼠尾草酸抑制破骨分化过程中扮演着重要角色。

文献表明，NFATc1还可调节破骨细胞生成过程中钙离子的释放(Negishi-Koga T，Takayanagi H(2009).Ca2+-NFATc1 signaling is an essential axis of osteoclastdifferentiation. Immunological reviews 231(1)：241-256.)。本研究研究发现，鼠尾草酸明显降低了RANKL诱导的 细胞内钙离子水平，这也再次证明了NFATc1在此过程中的重要作用。综上，鼠尾草酸通 过抑制RANKL诱导的NF-κB、MAPK和钙离子释放，导致NFATc1的表达和活性下调，从而 导致破骨细胞的分化和激活被抑制。已知，炎症能够引起破骨细胞生成，并导致类风湿性 关节炎骨吸收的发生。在本项目中，发明人发现鼠尾草酸能够有效地抑制一系列的促炎症 因子的产生，并下调RANKL的表达。这些细胞因子表达水平的降低，可能会抑制破骨细胞 的形成和骨吸收活性。更重要的是，细胞和分子数据表明，鼠尾草酸可以通过抑制NF-κB 和MAPK的激活直接抑制破骨细胞的分化及其功能。因此，鼠尾草酸的抗骨破坏作用可能 归因于对破骨细胞形成的直接抑制作用和抑炎导致的间接作用。

除了效力外，药物的安全问题也需考虑。众所周知，鼠尾草酸对于人类的健康是安全 的。美国食品和药物管理局和欧洲食品***已经批准，鼠尾草酸作为抗氧化添加剂可广 泛应用于包括油、动物油脂、酱料、烘焙制品、肉类和鱼类产品在类的一系列食品中。本项目中，5微摩尔的鼠尾草酸能够抑制胶原诱导性关节炎大鼠体重的减轻；并且在高达20微摩尔时也不影响BMM细胞和类风湿性关节炎-成纤维细胞样滑膜细胞的细胞活力，这说明鼠尾草酸的安全性极高。鉴于其有效性和安全性，鼠尾草酸是一种很有前途的治疗类风湿关节炎的补充或替代药物。

Claims (4)

1.鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。

2.鼠尾草酸在制备治疗胶原诱导性关节炎药物方面的应用。

3.鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎的抗关节损伤药物方面的应用。

4.鼠尾草酸在制备治疗类风湿性关节炎的抗炎药物方面的应用。