CN107810191B

CN107810191B - Aml抗原及其用途

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Publication number: CN107810191B
Application number: CN201680037474.0A
Authority: CN
Inventors: H·斯皮茨; 马赖南·阿莱塔·吉利森; 马泰·科德; 梅泰·德博拉·哈森伯格; 宝拉·玛丽亚·威尔荷米娜·范赫尔登; 沃特·坡斯
Original assignee: Keling Biomedical Co ltd
Current assignee: Keling Biomedical Co ltd
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: TW201718631A; TWI751110B; JP2018520670A; AU2016281424A1; WO2016209079A1; CA2989551A1; HK1247934A1; AU2016281424B2; DK3313870T3; US20180170998A1; AU2020294288B2; EP3313870B1; JP2022000038A; AU2020294288A1; CN107810191A; US11524989B2; US20230235018A1; MX2017016258A; JP7010704B2; NZ738289A

Abstract

本发明涉及一种含AML细胞的抗原的新的化合物，及其用途。

Description

AML抗原及其用途

技术领域

本发明涉及生物学、免疫学和医药的领域。

背景技术

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)为高风险恶性肿瘤，其在低于60岁的患者中具有40％至50％的五年存活率。对于高于65岁的患者，结果甚至更糟，仅低于20％的患者获得持久的缓解。同种异体的干细胞移植频繁地应用于急性白血病的治疗。它起初是设计用于挽救患者免于其他致命性清髓性化疗，但随后发现由于同种异体反应性免疫应答相关并发症(移植物对抗宿主疾病；GvHD)而复杂化。移植物于回输前排除T细胞避免了GvHD，但观察到排除了T细胞的移植物的受体，与同卵双胞胎供体移植物的受体类似，经历了高得多的复发率，使得同种异体SCT的成功取决于抗白血病免疫应答(移植物抗白血病(GvL))的诱导越来越清楚。此已引导开发在不需清髓性调节(降低强度的干细胞移植(RIST))的情况下应用同种异体干细胞移植的策略，以降低细胞毒性，并且允许在包括年纪较大的患者及经重度预处理(heavily pretreated)的患者的更大患者群体中应用同种异体SCT。RIST中的准备方案的目的在于大量消灭受体的适应性免疫***以防止移植物排斥，而不用完全移除受体的骨髓，从而降低早期SCT毒性。在移植后，供体干细胞逐渐取代受体的干细胞，且通常在SCT后的三个月内实现完全的供体嵌合现象(chimerism)。虽然同种异体SCT对相当数量的患者是有疗效的，且在SCT受体的支持性护理上已有长足的进步，但仍然有15～30％的患者死于移植相关的并发症，如GvHD及感染性并发症(起因于SCT后缓慢的免疫恢复或GvHD的免疫抑制疗法的并发症)。因此，虽然当强有力的移植物抗白血病(GvL)应答被诱发时SCT可能是有疗效的，但它的治疗成功受限于造成GvHD的抗宿主免疫应答，其导致高发病率及死亡率。考虑到同种异体干细胞移植后高发生率的造成15～30％患者死亡的GvHD，以及对于特定患者而言并非总是有合适的供体的事实，替代性的治疗方式将是有有利的。国际专利申请PCT/NL2014/050873提供了源自患者的AML特异性的人类抗体，其可结合完整的AML细胞。重要的是，所述抗体源自曾接受同种异体SCT且已完全缓解的人类AML患者，显示所述抗体对于AML是有效的。因此，在AML疗法中使用如PCT/NL2014/050873所公开的抗体是优选的。

代替利用抗体的被动免疫，免疫疗法亦为具吸引力的方式。利用免疫疗法，患有疾病的患者被供予疾病特异性抗原，该疾病特异性抗原在所述患者中诱发和/或提升对抗该疾病的免疫应答。预防性或半预防性的应用亦具有吸引力，在预防性或半预防性的应用中，一个体在疾病发作之前或(进一步)发展之前被供予疾病特异性抗原以诱发免疫应答。例如，利用AML特异性靶分子的免疫以诱发对抗AML的免疫应答，对接受了同种异体造血干细胞移植的患者将特别具有吸引力。利用此种靶分子来免疫亦具有吸引力的另一群体是罹患中高风险的骨髓增生异常综合征(MDS)的患者。这类患者具有中高风险发展为AML，因此预先诱发抗AML的免疫应答是有利的。MDS患者发展为AML的风险通常是根据国际预后评分***(IPSS；例如，请参照Malcovati等人，2013)加以确立。中高风险的MDS患者的非限定例子为MDS-RAEB-1及MDS-RAEB-2患者。

因为缺少合适的AML特异性抗原，特异性针对AML的免疫疗法及疫苗目前尚无法取得。

AML特异性抗原亦特别适合用于测定患者的样本是否包含能特异性地结合AML细胞的抗体和/或免疫细胞。这类信息，例如，对于AML的诊断或监控AML疗法是有价值的。

发明内容

本案的目的是提供包括AML细胞的抗原的新颖的肽及化合物。优选地，所提供的肽及化合物能够检测和/或诱发免疫应答，优选特异性免疫应答，针对骨髓增生疾病，更优选针对AML。

本发明提供一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其中所述肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至184位的序列相同。该肽优选包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同。在一些实施例中，该氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或至少35个氨基酸残基、或至少40个氨基酸残基、或至少45个氨基酸残基、或至少50个氨基酸残基、或51个氨基酸残基。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其中该肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多33个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至165位的序列相同。在一些实施例中，该氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或33个氨基酸残基。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其中该肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至147位的序列相同。在一些实施例中，该氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或15个氨基酸残基。

本案发明人惊奇地发现针对AML的特异性免疫应答可利用本发明的CD43肽加以检测和/或诱发。此发现是出人意料的，因为CD43存在于大多数种类(非恶性)的白血球的表面上，也存在许多非造血肿瘤细胞上，例如人类结肠癌细胞、人类子***细胞、人类肺癌细胞及人类乳腺癌细胞等。有鉴于CD43的这样大量存在，在本发明之前，不认为CD43是用以提供AML特异性的合适的化合物。然而，如实施例所示，AML特异性抗体AT14-013结合本发明的CD43肽。此外，抗体AT14-013结合至多种不同的CD43+AML细胞(图2及图3)，但不结合至CD43+PBMC、活化及非活化T细胞、B细胞、非活化单核细胞、胸腺细胞、ALL细胞、结肠癌细胞、非恶性结肠细胞、Jurkat细胞、Ramos细胞或正常骨髓细胞(如图5所示)。因此，特异性针对如权利要求书所定义的CD43肽的抗体AT14-013结合CD43+AML细胞，但它不结合多种其他种类的CD43+细胞。有趣地是，抗体AT14-013不结合不同种类的非AML、CD43+造血干细胞或淋巴系的较成熟细胞。实施例还显示抗体AT14-013能够结合胎儿造血干细胞，由此推断AT14-013所识别的CD43表位是癌胚表位。抗体AT14-013还能够结合自体白血病干细胞。此外，抗体AT14-013能够对抗AML体内(in vivo)生长。因此，本发明提供了AML细胞的CD43抗原。

CD43，其亦被称为白唾液酸蛋白(leukosialin)、载唾液酸蛋白(sialophorin)、半乳糖糖蛋白(galactoglycoprotein)、白血球唾液酸糖蛋白或gp115，是糖基化类黏蛋白样I跨膜蛋白，存在于除了红血球以外的大多数造血细胞的表面上。CD43，由一个外显子(exon)编码，在细胞-细胞相互作用中起作用。它具有235个氨基酸的高度糖基化的细胞外区域。已描述了两种CD43糖型，其中一种糖型主要包含四糖类，而另一种糖型主要具有分支的六糖类。两种糖型都可被表达于一个细胞的表面上。CD43例如为Shelley等人(1989)及Schmid等人(1992)中所述。人类CD43的序列，如图13所示，以登录号CCDS10650.1存在于GenbankCCDS数据库中。

如本文中所使用的，术语“本发明的CD43肽”是指具有至多100个氨基酸残基长度的氨基酸链，其中所述氨基酸链包括一序列，该序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至184位的序列相同；或者，其中所述氨基酸链包括一序列，该序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至183位的序列相同；或者，其中所述氨基酸链包括一序列，该序列具有至少3个氨基酸残基且至多33个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至165位的序列相同；或者，其中所述氨基酸链包括一序列，该序列具有至少3个氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至147位的序列相同。

如实施例中详细解释的，本发明提供了人类CD43蛋白的第133至184位的氨基酸序列包括被抗体AT14-013特异性结合的AML表位的见解。所述AML表位包括存在于如图13所示的氨基酸序列第133至165位之间的一或多个氨基酸残基。所述AML表位存在于不同AML细胞系及AML原始细胞上，且不存在或暴露于许多其他CD43+细胞上，因而特别适合用于诱发或检测AML特异性免疫应答。在一些实施例中，本发明的CD43肽包括氨基酸序列GTITTNSPETSSRTS。在一些实施例中，本发明的CD43肽包括氨基酸序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTS。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽包括氨基酸序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTSGPPLTMATVSLETSKGTSG。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽具有至多90个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，本发明的CD43肽具有至多85个氨基酸残基、或至多75个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，本发明的CD43肽具有至多65个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多55个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽具有至多52个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多33个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基、或至多15个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，本发明的CD43肽具有至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基的长度。

在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽具有至少52个氨基酸残基或至少51个氨基酸残基的长度，其中所述肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至184位的序列相同。在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽具有至少51个氨基酸残基的长度，其中所述氨基酸残基与如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至183位的氨基酸相同。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽具有至少33个氨基酸残基的长度，且包括一氨基酸序列，该氨基酸序列与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至165位的序列相同。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽具有至少15个氨基酸残基的长度，且包括一氨基酸序列，该氨基酸序列与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至147位的序列相同。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽由序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTSGPPLTMATVSLETSK GTSG组成。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽由序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTS组成。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽由序列GTITTNSPETSSRTS组成。

如本文中所使用，表示“位于如图13所示的CD43氨基酸第X至Y位的序列”、“位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第X至Y位的序列”、“其中所述氨基酸残基与如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第X至Y位的氨基酸相同”以及“一氨基酸序列，该氨基酸序列(或其)与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第X至Y位的序列相同”涵盖位于所列举的位置之间，且包含第X位和/或第Y位氨基酸的序列。此外，该术语包含位于所列举的位置之间且不含第X位和/或第Y位氨基酸的序列。换言之，在一些实施方式中，所列举的第X位和/或第Y位氨基酸存在于本发明的CD43肽中，而在其他一些实施方式中，所列举的第X位和/或第Y位氨基酸是不存在的。

除了与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至184位的序列、或位于氨基酸第133至183位的序列、或位于氨基酸第133至165位的序列、或位于氨基酸第133至147位的序列相同的所列举的氨基酸序列以外，本发明的CD43肽可进一步包括其他氨基酸残基。在一些实施方式中，所述其他氨基酸残基不来源于CD43序列。所述其他氨基酸残基，于本文中亦称作“非CD43氨基酸残基”，例如可用于增强稳定性，和/或增强免疫源性，和/或偶联CD43肽与另一部分，例如分子支架(scaffold)或载体。此类支架或载体的非限定例子为钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)及CLIPS支架(例如，双(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯及四(溴甲基)苯，如WO 2004/077062中所述)。一些实施方式从而提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的肽，其中所述肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多52个氨基酸残基或至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至184位的序列相同，且其中所述肽还包括至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少10个、或至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少60个、或至少70个、或至少80个非CD43氨基酸残基，其中所述非CD43氨基酸残基的全长序列不存在于如图13所示的人类CD43中。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的肽，其中所述肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同，且其中所述肽还包括至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少10个、或至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少60个、或至少70个、或至少80个非CD43氨基酸残基，其中所述非CD43氨基酸残基的全长序列不存在于如图13所示的人类CD43中。在一些实施方式中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或至少35个氨基酸残基、或至少40个氨基酸残基、或至少45个氨基酸残基、或至少50个氨基酸残基、或51个氨基酸残基。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的肽，其中所述肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多33个氨基酸残基的长度，与位在如图13所示的CD43氨基酸第133至165位的序列相同，且其中所述肽还包括至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少10个、或至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少60个、或至少70个、或至少80个非CD43氨基酸残基，其中所述非CD43氨基酸残基的全长序列不存在于如图13所示的人类CD43中。在一些实施方式中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或33个氨基酸残基。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的肽，其中所述肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位在如图13所示的CD43氨基酸第133至147位的序列相同，且其中所述肽还包括至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少10个、或至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少60个、或至少70个、或至少80个非CD43氨基酸残基，其中所述非CD43氨基酸残基的全长序列不存在于如图13所示的人类CD43中。在一些实施例中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或15个氨基酸残基。

上述肽亦被涵盖于术语“本发明的CD43肽”中。

一些实施方式提供了一种化合物，该化合物包括本发明的CD43肽。一些实施方式提供了一种免疫原性化合物，该免疫原性化合物包括本发明的CD43肽。在一些实施方式中，所述CD43肽偶联至医药上可接受的载体或支架。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽为具有至多100个氨基酸残基长度的截短的CD43分子。优选地，所述截短的CD43分子缺少野生型人类CD43的胞内区域。在优选的实施方式中，所述截短的CD43分子缺少野生型人类CD43的胞内区域以及跨膜区域两者。在更优选的实施方式中，本发明所述的CD43肽为截短的CD43胞外区域，其具有至多90个氨基酸残基、或至多80个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多52个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基、或至多33个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基的长度，所述截短的CD43胞外区域包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多52个氨基酸残基或至多51个氨基酸残基的长度，与位在如图13所示的CD43氨基酸第133至184位的序列相同。在一些实施例中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或至少35个氨基酸残基、或至少40个氨基酸残基、或至少45个氨基酸残基、或至少50个氨基酸残基、或51个氨基酸残基。

在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽为截短的CD43胞外区域，其具有至多90个氨基酸残基、或至多80个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基、或至多33个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基的长度，所述截短的CD43胞外区域包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基的长度，与位在如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同。在一些实施方式中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或至少35个氨基酸残基、或至少40个氨基酸残基、或至少45个氨基酸残基、或至少50个氨基酸残基、或51个氨基酸残基。

在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽为截短的CD43胞外区域，其具有至多90个氨基酸残基、或至多80个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基、或至多33个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基的长度，所述截短的CD43胞外区域包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多33个氨基酸残基的长度，与位在如图13所示的CD43氨基酸第133至165位的序列相同。在一些实施方式中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基、或至少20个氨基酸残基、或至少25个氨基酸残基、或至少30个氨基酸残基、或33个氨基酸残基。

在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽为截短的CD43胞外区域，其具有至多90个氨基酸残基、或至多80个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基、或至多33个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基的长度，所述截短的CD43胞外区域包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至147位的序列相同。在一些实施方式中，所述氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或15个氨基酸残基。

一些实施方式提供了根据本发明的CD43肽，其为截短的CD43胞外区域，具有至多90个氨基酸残基、或至多80个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多52个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基、或至多33个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基、或至多15个氨基酸残基的长度。

如技术人员已知的，一旦已经提供了免疫原性序列，就可能在一定程度上改变该序列，因而优选地可最优化所产生的免疫原的免疫源性和/或稳定性。这例如可藉由诱变步骤进行，其中优选在测试了所产生的化合物的稳定性和/或免疫源性之后，选择改善的AML特异性抗原化合物。技术人员能够很好地由特定的氨基酸序列起始，产生抗原变体。例如，应用保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代的例子包含一疏水性残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，被取代成另一疏水性残基，以及一极性残基被取代成另一极性残基，如精氨酸被取代成赖氨酸、谷氨酸被取代成天冬氨酸、或谷氨酰胺被取代成天冬酰胺。在一些实施方式中，实行替换净分析(replacement net analysis)，其涉及一个或多个氨基酸残基被替换为其他任一氨基酸残基，并测试产生的化合物。

一些实施方式因此提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其包括一氨基酸序列或大致上由一氨基酸序列组成，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多52个氨基酸残基或至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至184位的序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性。一些实施方式提供了一种经分离、重组或纯化的CD43肽，其包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至183位的序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其包括一氨基酸序列或大致上由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有33个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至165位的序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性。

一些实施方式提供了一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其包括一氨基酸序列或大致上由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的人类CD43蛋白的氨基酸第133至147位的序列具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性。

术语“％的序列同一性”于本文中定义为在比对(align)候选氨基酸序列和参考序列这两条序列，且在必要时引入缺口(gap)以达到最大的百分比同一性之后，候选氨基酸序列中与参考序列中的残基相同的残基的百分比。用于比对的方法及计算机程序已为所属技术领域所熟知。用于测定候选序列是否落入此定义的一种可用或适宜的计算机程序为“Align 2”，由Genentech,Inc.编写，其已于1991年12月10日随用户文件提交华盛顿特区20559的美国版权办公室。

本文所定义的经分离、重组或纯化的CD43肽亦称为“本发明的CD43肽”或“本发明的CD43抗原”。在一些实施方式中，本发明的CD43肽的氨基酸残基是选自于天然存在于真核细胞中的20种氨基酸残基，其亦称作为“标准”或“经典”氨基酸。可选地，本发明的CD43肽中包含非天然的氨基酸残基，例如D-氨基酸(即，氨基酸的D-立体异构物)或N-甲基氨基酸。

本发明的CD43肽优选为糖基化的。鉴于细胞表面上的天然CD43蛋白为高度糖基化的事实，此类肽更准确地反映了体内天然的AML抗原。在一些优选的实施例中，本发明所述的CD43肽包括唾液酸残基(亦称作α-N-乙酰基神经氨酸)。在体内，人类CD43为高度唾液酸化的。经神经氨酸酶处理切割来自CD43糖蛋白的唾液酸残基。在一些实施方式中，因此，本发明的CD43肽为神经氨酸酶敏感的。一些实施方式提供了本发明的经癌-唾液酸化(onco-sialylated)的CD43肽，这意味着所述CD43肽具有肿瘤特异性唾液酸化形式。如本文中所使用，具有“肿瘤特异性唾液酸化形式”的本发明的CD43肽涵盖具有肿瘤细胞产生的具有唾液酸化形式的本发明的CD43肽，或与肿瘤细胞产生的唾液酸化形式相同、或至少90％、或至少95％、或至少97％相似的具有唾液酸化形式的本发明的CD43肽。

一些实施方式提供了本发明的CD43肽，其由AML细胞生产。一些实施方式提供了本发明的CD43肽，其是由来源于AML细胞的细胞系的细胞所产生。此类CD43肽将具有糖基化形式，其非常相似于AML患者体内的AML细胞的糖基化形式。在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽由THP-1细胞所产生。在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽由Kasumi 3细胞、或由HL60细胞、或由KG1a细胞、或由SH2细胞、或由MonoMac6细胞、或由Molm13细胞、或由CMLK562细胞产生。

如本文中所使用的，本发明的CD43肽被称为具有AML特异性糖基化形式的本发明的CD43肽，其中本发明的CD43肽具有与所述CD43肽在AML细胞中(如于AML原始细胞或AML细胞系中)表达所产生的醣基化形式相似或相同的糖基化形式。一些实施方式因而提供了具有AML特异性糖基化形式的本发明的CD43肽。

一些实施方式提供了本发明的CD43肽，其由MDS细胞所产生。一些实施方式提供了本发明的CD43肽，其由来源于MDS细胞的细胞系的细胞所产生。此类CD43肽将具有一糖基化形式，其非常相似于MDS患者体内MDS细胞的糖基化形式。

一些实施方式提供了本发明的CD43肽，其具有MDS特异性糖基化形式。这些肽具有一糖基化形式，其与本发明的CD43肽在MDS细胞中(如于MDS原始细胞或MDS细胞系中)表达所产生的醣基化形式相似或相同。

在另一些实施方式中，提供了本发明的CD43肽，其由宿主细胞、利用体内糖基化工程(例如根据Roche Diagnostics GmbH)所产生。根据这些实施方式，提供了具有酶α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶的宿主细胞，使得在本发明的CD43肽产生时，CD43肽将被唾液酸化。因此更进一步提供了本发明的CD43肽，其由包含α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶的细胞所产生。在一些实施方式中，所述α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶包括外源性α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶，这意味着所述酶已经被重组地导入宿主细胞中(或导入当前宿主细胞所起源的亲本宿主细胞中)。一些实施方式提供了本发明的CD43肽，其由包含编码α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶的外源性核酸序列的宿主细胞所产生。

抗CD43的抗体已知于所属技术领域。然而，也清楚这些抗体辨识不同的表位。例如，如Kim等人(2014)的表1所示，抗CD43的单克隆抗体(mAb)YG5、2C8、8E10及DFT-1确实结合AML细胞，但这些已知抗体的一些或全部也结合许多其他非AML细胞，包含CEM7、Jurkat、IM9、Ramos、Raji、Daudi、Reh、正常骨髓及PBL细胞(Kim等人，2014)。因此，抗体YG5、2C8、8E10及DFT-1对于AML根本不具有特异性。相比之下，特异性结合本发明的CD43的抗体AT14-013不结合Jurkat细胞、Ramos细胞、正常骨髓细胞或PBL细胞/PBMC(图5及图9b)。抗体YG5、2C8、8E10及DFT-1因而结合另一CD43表位。

抗体UN1(Tuccillo等人，2014a以及Tuccillo等人，2014b)识别一CD43表位，该CD43表位包含GalNac-O-连接的单糖，对应于O-多糖的Tn抗原。得到的结论为，此表位的蛋白质核心包含CD43氨基酸64至83。此抗原由人类胸腺细胞，由白血病细胞系HPB-ALL、H9及Molt-4所表达，且表达于外周血CD4+ T淋巴细胞的亚群中。然而，抗体AT14-013不结合人类胸腺细胞，表明本发明提供了不同的AML抗原。

国际专利申请WO 2007/146172描述了抗体5F1、51-41及138-10，其识别存在于人类结肠直肠腺癌(colorectal adenocarcinoma)细胞系Colo205以及人类胃癌细胞系NCI-N87的表面上的CD43。WO 2007/146172中未提及AML。如实施例所示，与本发明的AML特异性CD43肽特异性结合的抗体AT14-013不结合Colo205。抗体5F1、51-41及138-10因而结合不同的CD43表位。

国际专利申请WO 2006/121240描述了能够识别CD43的未糖基化区域的抗体EB-1、EB-2及EB-3，该CD43的未糖基化区域由CD43氨基酸73至81所组成。此抗原存在于胸腺细胞、骨髓中的一些造血前体细胞、AML细胞、急性淋巴球性白血病(ALL)细胞以及慢性髓性白血病(CML)细胞上。EB-1识别它的在经唾液酸酶处理及未经唾液酸酶处理的CD43分子中的抗原。相比之下，在经唾液酸酶(神经氨酸酶)处理后，本发明的糖基化CD43不再被抗体AT14-013所辨识，这意味着本发明提供了神经氨酸酶敏感的AML抗原，与EB-1、EB-2及EB-3的抗原相反。此外，抗体AT14-013不结合ALL细胞或胸腺细胞，与抗体EB-1、EB-2及EB-3相反。再者，本发明的CD43肽包括一氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸且至多51个氨基酸残基的长度，与位于CD43的氨基酸残基133至184内的序列相同，其结构域与抗体EB-1、EB-2及EB-3所识别的CD43氨基酸残基第73至81位不同。抗体EB-1、EB-2及EB-3因而亦结合另一CD43表位。

总言之，本发明提供了一种新颖的AML特异性抗原。

本发明的CD43肽优选地具有至多100个氨基酸残基，且至少3个氨基酸残基、优选至少5个氨基酸残基、或至少6个氨基酸残基、或至少7个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少9个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基、之长度，或至少11个氨基酸残基、或至少12个氨基酸残基、或至少13个氨基酸残基、或至少14个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，所述长度为至少20个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少25个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少30个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少33个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少35个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少40个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少45个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少50个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少51个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述长度为至少52个氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述长度为至多90个氨基酸残基、或至多85个氨基酸残基、或至多75个氨基酸残基、或至多70个氨基酸残基、或至多65个氨基酸残基、或至多60个氨基酸残基、或至多55个氨基酸残基、或至多52个氨基酸残基、或至多51个氨基酸残基、或至多50个氨基酸残基、或至多45个氨基酸残基、或至多40个氨基酸残基、或至多35个氨基酸残基、或至多30个氨基酸残基、或至多25个氨基酸残基、或至多20个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述肽具有至多52个氨基酸残基，且至少3个氨基酸残基、优选至少5个氨基酸残基、或至少6个氨基酸残基、或至少7个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少9个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，所述肽具有至多51个氨基酸残基，且至少3个氨基酸残基、优选至少5个氨基酸残基、或至少6个氨基酸残基、或至少7个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少9个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，所述肽具有至多33个氨基酸残基，且至少3个氨基酸残基、优选至少5个氨基酸残基、或至少6个氨基酸残基、或至少7个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少9个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，所述肽具有至多15个氨基酸残基，且至少3个氨基酸残基、优选至少5个氨基酸残基、或至少6个氨基酸残基、或至少7个氨基酸残基、或至少8个氨基酸残基、或至少9个氨基酸残基、或至少10个氨基酸残基的长度。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少3个氨基酸残基且至多51个氨基酸残基或至多51个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多40个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多33个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多20个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至183位的序列相同。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多33个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至165位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多30个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至165位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多20个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至165位的序列相同。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至147位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少8个氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至147位的序列相同。在一些实施方式中，本发明的CD43肽由一氨基酸序列所组成，该氨基酸序列具有至少10氨基酸残基且至多15个氨基酸残基的长度，与位于如图13所示的CD43氨基酸第133至147位的序列相同。

在一些实施方式中，上述肽为糖基化的，优选包括唾液酸残基，以更好的模拟天然的AML特异性抗原。在一些实施方式中，上述肽为癌-唾液酸化的。在一些实施方式中，上述肽由AML细胞或AML细胞系，优选为THP-1细胞所产生。在一些实施方式中，上述肽由MDS细胞或MDS细胞系所产生。

本发明亦涵盖编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物。因此更进一步提供了编码本发明的CD43肽的经分离、合成或重组的核酸分子或其功能等效物。如本文中所使用的，本发明的核酸分子或核酸序列优选地包括核苷酸链、更优选DNA、cDNA或RNA。在另一些实施方式中，本发明的核酸分子或核酸序列包括其他种类的核酸结构，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核酶。此类其他核酸结构被称为核酸序列的功能等效物。术语“核酸分子的功能等效物”因此涵盖包括展现与天然核苷酸相同功能的非天然核苷酸、经修饰的核苷酸和/或非核苷酸构成单元(building block)的链。

一些实施方式提供了本发明的核酸分子或其功能等效物，其中人类核酸序列已就非人类细胞，例如非人类生产细胞如E.coli、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞(其为小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞进行了密码子优化。这意味着来自所述人类核酸序列的一种或多种密码子已被替换成所述非人类细胞优选的一种或多种密码子。

如本文中所使用，编码本发明的CD43肽的经分离、合成或重组的核酸分子或其功能等效物亦称为“本发明的核酸分子或功能等效物”。

由于本发明提供了包括新颖的AML特异性抗原的CD43肽，许多应用变成了可能。例如，在一些实施方式中，本发明的CD43肽用于诱导、分离和/或取得免疫细胞和/或抗体、或其功能性部分或功能衍生物，其可特异性地结合淋巴组织增生和/或骨髓增生细胞。使用本发明的CD43肽诱导、分离和/或取得的免疫细胞和/或抗体、或其功能性部分或功能衍生物特别适合用于治疗或预防骨髓增生或淋巴组织增生疾病。更进一步地，有鉴于抗体AT14-013为对本发明的CD43肽具有特异性的抗体，所以也靶向白血病干细胞，已知该白血病干细胞更具有治疗抗性且常导致治疗后的疾病复发。在一些实施方式中，本发明的CD43肽用于诱导和/或取得AML特异性免疫细胞和/或AML特异性抗体。例如，使用一种或多种本发明的CD43肽、或使用包括本发明的CD43肽的免疫原性化合物、或使用编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、或使用包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体，对非人类动物进行免疫，之后优选进行一次或多次的加强剂给药。接着，从所述非人类动物收集对于淋巴组织增生和/或骨髓增生细胞具特异性，优选对AML具特异性，的免疫细胞和/或抗体。在一些实施方式中，所述免疫细胞包括T细胞，例如，自然杀伤细胞(NK细胞)或辅助性T细胞。

在一些实施方式中，从所述经免疫的非人类动物收集的所述免疫细胞包括B细胞，例如，AML特异性B细胞特别适合用于AML特异性抗体的生产。从所述经免疫的非人类动物收集的AML特异性B细胞，例如，可用于杂交瘤的产生，从所述杂交瘤取得AML特异性抗体。在另一些实施方式中，使用Bcl-6及Bcl-xL核酸转导从所述经免疫的动物收集的B细胞，并长期离体(ex vivo)培养于，例如，如欧洲专利号1974017及美国专利US 9,127,251中所述的B细胞培养物中。以这种方式，制造长期复制B细胞培养物，其中B细胞复制并产生抗体。在一些实施方式中，收集由所述杂交瘤或此类B细胞培养物所产生的AML特异性抗体，例如用于抗AML治疗，优选为了减小副作用，在抗体人源化之后用于抗AML治疗。在一些实施方式中，测试从所述非人类动物取得的抗体和/或B细胞与抗体AT14-013竞争结合CD43。这例如通过将AML细胞与从所述非人类动物取得的所述抗体或B细胞一起培养，接着加入抗体AT14-013来进行。作为对照，优选在不存在任何其他抗体或B细胞的情况下，将AML细胞与抗体AT14-013一起培养。若AML细胞与从所述非人类动物取得的抗体或B细胞的预培养显示出影响AT14-013与所述AML细胞的结合，则得到的结论为从所述非人类动物取得的所述抗体或B细胞与抗体AT14-013竞争对CD43的结合。

在一些实施方式中，对来自所述非人类动物的B细胞的编码可变区的核酸序列进行测序，以取得AML特异性可变区的核酸序列，其中，在将一种或多种包括这些序列的核酸分子导入生产细胞，如大肠杆菌(E.coli)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞或293(T)细胞之后，用于产生AML特异性抗体。所述一种或多种核酸序列优选就所述生产细胞进行了密码子优化。如本文中所使用的，术语“密码子”代表三个一组的核苷酸(或其功能等效物)，其编码特定的氨基酸残基。术语“密码子优化(codon optimized)”表示来自原始的、动物核酸序列的一种或多种密码子被替换成优选来自另一物种的细胞(例如特定的生产细胞)的一种或多种密码子。这些替换密码子优选编码与被替换的原始动物密码子相同的氨基酸残基。

在一些实施方式中，从所述非人类动物或所述非人类动物的免疫细胞所取得的CD43-特异性抗体是经人源化的，这意味着动物氨基酸序列的至少一部分、优选框架序列(framework sequence)的至少一部分或全部，被人类序列取代以减少在人类中的不良副作用。

含适合的给药步骤及佐剂的动物免疫流程、由所述经免疫的动物取得及纯化的抗体和/或免疫细胞的步骤、竞争实验及非人类抗体的人源化步骤已为所属技术领域所熟知。例如Hanly等人(1995)可作为参考。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽或包括本发明的CD43肽的化合物用于筛选噬菌体展示文库，以鉴别和/或分离AML特异性免疫球蛋白(通常为Fab片段)。在一些实施方式中，使用初始

噬菌体展示文库。在优选的实施例中，使用源自一位或多位AML患者的噬菌体展示文库，使得展示文库将已向AML偏倚。在一些实施方式中，测试由所述噬菌体展示文库所取得的AML特异性免疫球蛋白与抗体AT14-013竞争结合CD43。此例如利用于本文中所述的竞争测试来进行。

因此进一步提供了使用本发明的CD43肽、或使用本发明的免疫原性化合物、或使用编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、或使用含本发明的核酸分子或功能等效物的载体，来诱导、分离和/或取得免疫细胞或抗体、或其功能性部分或功能等效物，如Fab片段。所述免疫细胞、或抗体、或其功能性部分或功能等效物优选地能够特异性结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞。优选地，所述骨髓增生细胞为AML细胞、MDS细胞和/或CML细胞，最优选为AML细胞。在一些实施方式中，本发明的CD43肽、或本发明的免疫原性化合物、或本发明的核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体用于诱导和/或取得能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。此类抗体的非限定例子为AT14-013，如实施例所示。本发明的CD43肽、或本发明的免疫原性化合物能够诱导和/或取得具有ADCC和/或CDC诱导活性的抗体这一事实，意味着可被诱导或取得的抗体在体内(in vivo)是有作用的。

本文亦提供了本发明的CD43肽或化合物用作免疫原(immunogen)，以及本发明的核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体用作免疫原。

一些实施方式提供了一种用于产生能够特异性地结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞的免疫细胞和/或抗体的方法，例如AML特异性免疫细胞或AML特异性抗体，所述方法包括使用本发明的CD43肽、或使用本发明的化合物、或使用本发明的核酸分子或功能等效物、或使用包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体来免疫非人类动物。所述方法优选进一步包括从所述非人类动物收集能够特异性地结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞的免疫细胞和/或抗体。在一些实施方式中，从所述非人类动物收集AML特异性免疫细胞和/或AML特异性抗体。在一些实施方式中，测试从非人类动物取得的B细胞和/或抗体与抗体AT14-013对CD43结合的竞争。本文中亦提供了可藉由本发明的方法取得的能够特异性地结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞的免疫细胞和/或抗体。一些实施方式提供了可藉由本发明的用于产生AML特异性免疫细胞或AML特异性抗体的方法所取得的AML特异性抗体或AML特异性免疫细胞。此种AML特异性抗体优选地与抗体AT14-013竞争结合CD43。

所述非人类动物优选地包括哺乳动物，如啮齿动物或家畜(cattle)。在一些实施方式中，所述非人类动物包括小鼠、大鼠、兔子、美洲驼(llama)、骆驼、猪、家禽、牛、山羊、马、猿和/或大猩猩。

有鉴于抗体AT14-013特异性地结合本发明的CD43肽的事实，使用本发明的CD43肽所取得、产生或选择的其他抗体一般将与抗体AT14-013竞争结合CD43。与此相反，所属技术领域已知的现有CD43抗体不与抗体AT14-013竞争，而这些已知抗体确实彼此竞争，如图9所示。故这些所属技术领域已知的其他抗体确实结合一表位，该表位不同于AT14-013的表位。因此，进一步提供的是，与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物。所述经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，优选地与抗体AT14-013竞争结合位于如图13所示的CD43序列的氨基酸第133至184位的表位的至少一部分。所述经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物一般与抗体AT14-013竞争结合本发明的CD43肽。

如本文中所使用的术语“抗体”是指包括两条彼此结合的重链的免疫球蛋白，其中每一重链还与一轻链配对。

本文中“抗体的功能性部分”定义为与所述抗体在性质上而不一定在量上具有至少一种共享特征的部分。所述功能性部分能够结合与所述抗体相同的抗原，但不一定以相同的程度。抗体的功能性部分优选地包括至少重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，抗体的功能性部分包括至少重链可变区(VH)。抗体的功能性部分的非限定例子为单域抗体、单链抗体、纳米抗体(nanobody)、单抗体(unibody)、单链可变片段(scFv)、双特异性T细胞衔接器(BiTE)、Fab片段及F(ab')₂片段。

本文中“抗体的功能等效物”定义为人工结合化合物，其包括抗体的至少一个CDR序列，优选为重链CDR3序列。所述功能等效物优选地包括抗体的重链CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR3序列。更优选地，所述功能等效物包括抗体的重链CDR1、CDR2及CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。例如，藉由改变抗体使得产生的化合物的至少一抗原结合特征在性质上而不一定在量上实质地相同，来产生抗体的功能等效物。其可以许多方式进行，例如通过保守氨基酸取代，藉此一氨基酸残基被具有大致上相似特征(尺寸、疏水性等)的另一残基取代，使得所述抗体的整体功能基本上不受影响。抗体的功能等效物的非限定例子为具有经修饰的Fc尾部的抗体，其中Fc尾部例如经氨基酸替换和/或糖基化改变进行修饰。

如技术人员所熟知的，抗体的重链为构成免疫球蛋白分子的两种类型的链中较大的链。重链包括恒定区及可变区，其中可变区参与抗原结合。抗体的轻链为构成免疫球蛋白分子的两种类型的链中较小的链。轻链包括恒定区及可变区。可变区通常、但并非总是与重链的可变区一起参与抗原结合。

互补决定区(CDR)为存在于重链可变区及轻链可变区中的高变区。在整个抗体的情况下，重链的CDRs 1～3及连接的轻链的CDRs 1～3一起形成抗原结合位。

如本文中所使用，若其能够以高于不相关的对照抗体或对照免疫细胞对AML细胞的结合亲和性(其中对照抗体或对照免疫细胞对所述AML细胞不具特异性)至少两倍的结合亲和性来结合AML细胞，则免疫细胞、抗体、或其功能性部分或功能等效物对AML具“特异性”。例如，AML特异性抗体、B细胞或T细胞对AML的结合一般分别由抗体、B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)的互补区来介导。AML抗原与抗体或BCR或TCR的可变区两者的特定三维结构使得这两个结构结合在一起(类似于锁及钥匙的相互作用)，而不是抗体或BCR或TCR的任意、非特异性的黏附。然而，对于其他类型细胞的一些反应性被涵盖在术语“AML特异性”之中。由于抗体或BCR或TCR一般识别抗原的表位，且由于这类表位可能也存在于其他细胞上，所以AML特异性的抗体、B细胞或T细胞可能识别这类其他细胞。这类其他细胞的非限定例子为MDS及CML细胞。尽管以较小程度，但黑素瘤细胞及黑素细胞显示也被AML特异性抗体AT14-013结合。因此，术语“AML特异性”并未排除抗体或B细胞或T细胞对包含相同表位的至少一部分的另一细胞的结合。然而，实施例中显示出许多CD43+细胞，包含CD43+造血细胞如PBMC、(前体)T细胞及B细胞，不包含本发明提供的AML抗原。

本发明的CD43肽特别适合用于测试生物样本中AML特异性结合化合物，例如AML特异性抗体或AML特异性免疫细胞(如B细胞或T细胞)的存在。例如，将来自一个体的样品，或此种样品的含抗体、B细胞和/或T细胞的级分与本发明的CD43、或包括本发明的CD43的化合物一起孵育，以筛选AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞的存在。若这类抗体或免疫细胞显示存在于所述样品或所述样品级分中，并结合本发明所述的CD43肽，则所述样品被分类为对AML特异性结合化合物(即，抗体和/或免疫细胞)呈阳性。所述样品例如包括血液样品、或骨髓样品、或活检，如髓系肉瘤(亦称为绿色瘤)。

AML特异性抗体或AML特异性免疫细胞例如使用免疫测定法，例如Western印记、(捕获)ELISA或RIA，来进行检测和/或定量。这些测定法已为所属技术领域所熟知。经标记的本发明的CD43肽，例如与血液样品或骨髓样品、或与活检如髓系肉瘤、或与这类样品中含抗体、B细胞和/或T细胞的级分一起孵育，然后清洗掉未结合的结合化合物。接着，测定本发明的CD43肽是否被AML特异性抗体或免疫细胞结合。在一些实施方式中，将未经标记的本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的未经标记的化合物与包括抗体和/或免疫细胞的样品接触，所述样品例如为血液样品、或骨髓样品、或活检如髓系肉瘤、或这类样品中含抗体、B细胞和/或T细胞的级分。孵育后，优选地实行一次或多次清洗步骤以去除未结合的抗体及未结合的免疫细胞。接着，例如使用特异性地针对人类抗体或人类免疫细胞、并与标记物偶联的抗体，测试抗体或免疫细胞是否已结合了本发明的CD43肽，其中所述标记物例如为荧光化合物或例如辣根过氧化氢酶或碱性磷酸酶。在进一步的清洗步骤后，例如通过测量发射光或通过添加辣根过氧化氢酶或碱性磷酸酶的底物，测定是否已结合了第二抗体。这些检测技术已为所属技术领域所熟知。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物与已富含抗体和/或免疫细胞的样品级分接触。在一些实施方式中，所述级分为B细胞体外培养物或T细胞体外培养物。在一些实施方式中，本发明的CD43肽或包括本发明的CD43肽的化合物与已从生物样品大致纯化的抗体和/或免疫细胞接触，例如藉由挑选CD19阳性细胞所取得的纯化的B细胞级分，和/或利用抗Ig抗体或蛋白A或G纯化方法所纯化的抗体/B细胞级分。蛋白A或G纯化方法已为所属技术领域所熟知，且方法流程及试剂为商业上可取得的。如本文中所使用，术语“已从样品大致纯化的免疫细胞”指产生的级分的至少80％、优选至少85％、更优选至少90％或至少95％的细胞由免疫细胞所组成。术语“已从样品大致纯化的抗体”指产生的级分的至少80％、优选至少85％、更优选至少90％或至少95％的质量由抗体所组成。

因此进一步提供了本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物在结合和/或检测免疫细胞、和/或抗体、或其功能性部分或功能等效物中的用途。所述免疫细胞、和/或抗体、或其功能性部分或功能等效物优选地能够特异性结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞。优选地，所述淋巴组织增生细胞为AML细胞、或MDS细胞、或CML细胞，优选为AML细胞。本文中亦提供了本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物用作AML特异性结合化合物如抗体和/或免疫细胞的检测部分，以及提供了用于测定样品是否包括AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞的方法，所述方法包括将本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物与所述样品、或与所述样品中包括抗体和/或免疫细胞的级分一起孵育，接着测定本发明所述的CD43肽是否被AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞结合，或包括本发明所述的CD43肽的化合物是否被AML特异性抗体和/或免疫细胞结合。若检测到这样的结合，则得到的结论为所述样品包括AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞。

亦提供了用于测定样品是否包括AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞的方法，所述方法包括将本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物与已从所述样品大致纯化的抗体和/或免疫细胞一起孵育，接着测定本发明所述的CD43肽是否被AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞结合，或包括本发明所述的CD43肽的化合物是否被AML特异性抗体和/或免疫细胞结合。

在一些实施方式中，使用如上述的检测测试的结果来确定个体是否具有AML。若来自个体的样品显示包含AML特异性免疫细胞和/或AML特异性抗体，则可得到的结论为所述个体为AML患者。因此，本文亦提供了本发明的CD43肽用作诊断试剂，以及包括本发明的CD43肽的化合物用作诊断试剂。进一步提供了本发明的CD43肽用于诊断AML的用途，以及包括本发明的CD43肽的化合物用于诊断AML的用途。进一步提供了一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括：

-本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物，以及

-用于检测结合CD43肽的抗体或结合CD43肽的免疫细胞的工具。

此类工具例如涵盖特异性地针对人类抗体或人类免疫细胞的经标记的抗体。在一些实施方式中，所述经标记的抗体与辣根过氧化氢酶或碱性磷酸酶接合。

一些实施方式提供了一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括：

-本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物，以及

-用于检测抗体或免疫细胞的工具。

一些实施方式提供了一种用于分类包含抗体的样品或包含免疫细胞的样品的方法，所述方法包括将本发明的CD43肽(为了检测T细胞，可选地于MHC复合物的环境中)、或包括本发明所述的CD43肽的化合物，与所述样品的抗体和/或免疫细胞接触，以及测定本发明所述的CD43肽、或本发明所述的化合物是否被所述样品的抗体和/或免疫细胞的至少一种结合。若本发明所述的CD43肽或化合物被所述样品的抗体和/或免疫细胞结合，则所述样品被分类为包括CD43特异性抗体和/或免疫细胞。

一些实施方式提供了一种用于测定个体是否具有骨髓增生或淋巴组织增生疾病，优选AML的方法，所述方法包括将本发明的CD43肽(为了检测T细胞，可选地于MHC复合物的环境中)、或包括本发明所述的CD43肽的化合物，与所述个体的抗体和/或免疫细胞接触，以及测定本发明所述的CD43肽、或本发明所述的化合物是否被所述个体的抗体和/或免疫细胞的至少一种结合。若本发明所述的CD43肽或化合物被所述个体的抗体和/或免疫细胞结合，则得到的结论为所述个体具有淋巴组织增生或骨髓增生疾病，如AML。在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽、或包括本发明所述的CD43肽的化合物与包括所述个体的抗体和/或免疫细胞的样品接触，所述样品例如为血液样品、或骨髓样品、或活检如髓系肉瘤。在另一些实施方式中，本发明所述的CD43肽或化合物与来自所述个体的样品的级分接触，其中所述级分包括免疫细胞和/或抗体。在一些实施方式中，本发明所述的CD43肽或化合物与已从所述样品大致纯化的抗体和/或免疫细胞接触，例如藉由挑选CD19阳性细胞所取得的纯化的B细胞级分，和/或利用抗Ig抗体或蛋白A或G纯化方法所纯化的抗体/B细胞级分。

在一些实施方式中，本发明的检测测试的结果用于确定个体是否展现针对骨髓增生或淋巴组织增生疾病(如AML)的可检测到的免疫应答。例如，这优选是用于确定已接受药物治疗的患有骨髓增生疾病的患者，例如已接受针对AML治疗的AML患者，例如已接受免疫疗法如干细胞移植或供体-淋巴细胞输注的AML患者，是否具有GvL应答。迄今为止，还未有测试受治疗的患者受否存在强有力的GvL应答的诊断工具。这类诊断工具是极度需要的，因为：1)它将允许在复发发生之前的时间点，早期辨识出高风险复发的同种异体SCT受体，因而得以早期干预，如逐渐减少免疫抑制剂或供体-淋巴细胞的输注；2)它将允许滴定这类供体淋巴细胞输注，直到抗白血病抗体确实出现；以及3)当可验证强有力的GvL应答的存在时，它将给予往往受许多SCT相关并发症之一所苦的同种异体SCT受体希望。现在的患者必须等待并观察是否发生复发，且并没有预测疾病复发的方式。因此，确定患者是否具有抗AML免疫应答的测试的可用性将大幅改善SCT患者的临床护理，影响预后及生活质量。

一些实施方式因而提供了一种用于测定个体是否展现针对骨髓增生或淋巴组织增生疾病(优选AML)的免疫应答的方法，所述方法包括将本发明的CD43肽(可选地于MHC复合物的环境中)、或包括本发明所述的CD43肽的化合物与所述个体的抗体和/或免疫细胞接触，以及测定本发明所述的CD43肽、或包括发明所述的CD43肽的化合物是否被所述个体的抗体和/或免疫细胞的至少一种结合。若显示本发明所述的CD43肽或所述化合物被结合，则代表所述个体展示针对所述骨髓增生或淋巴组织增生疾病(优选AML)的免疫应答。在一些实施方式中，测定所述个体的抗体或B细胞是否与抗体AT14-013竞争对于CD43的结合。竞争的抗体将对骨髓增生或淋巴组织增生疾病(优选AML)特别有效。

在一些实施方式中，与抗体AT14-013竞争结合CD43的抗体、或其功能性部分或功能等效物被用于检测样品中的骨髓增生细胞。因而进一步提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物在测定样品是否包括骨髓增生细胞中的用途，所述骨髓增生细胞优选为AML或MDS或CML细胞。本文中亦提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，用于淋巴组织增生或骨髓增生疾病(优选AML或MDS或CML)的诊断，以及与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物在诊断AML中的用途。亦提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物在制备淋巴组织增生或骨髓增生细胞(优选AML或MDS或CML细胞)的诊断试剂中的用途。一些实施方式提供了一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，以及用于检测抗体-细胞复合物的工具。所述工具例如包括针对AML细胞的另一抗体，如AT14-013。在一些实施方式中，所述工具包括针对骨髓细胞的另一细胞表面组分的经标记的抗体。在一些实施方式中，所述工具包括经标记的抗体，其针对与抗体AT14-013竞争的所述抗体或功能性部分或功能等效物。

亦提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的、用作诊断试剂的、经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物。一些实施方式提供了一种用于测定骨髓增生细胞是否存在于样品中的方法，该方法包括：

-使所述样品接触与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，以及

-允许所述抗体或功能性部分或功能等效物结合骨髓增生细胞(若存在)，以及

-测定骨髓增生细胞是否结合至所述抗体或功能性部分或功能等效物，从而测定骨髓增生细胞是否存在于所述样品中。在一些实施方式中，所述骨髓增生细胞为AML或MDS或CML细胞。

更进一步提供了抗体AT14-013、或其功能性部分或功能等效物在测定样品是否包括AML或MDS或CML细胞中的用途。本文中亦提供了抗体AT14-013、或其功能性部分或功能等效物用于AML或MDS或CML的诊断，以及抗体AT14-013、或其功能性部分或功能等效物在诊断AML或MDS或CML中的用途。亦提供了抗体AT14-013、或其功能性部分或功能等效物在制备用于AML或MDS或CML的诊断试剂中的用途。

本发明的新颖的CD43肽及其编码核酸分子或功能等效物的其他有趣应用为预防性或半预防性的应用及免疫疗法。如本文中所使用，半预防性应用代表一个体已经患有疾病，但所述疾病的进一步进展被至少暂时延迟或防止。例如，本发明的CD43肽、或其编码核酸分子或其功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体、或包括本发明的CD43肽的化合物可半预防性地给药予患有中高风险骨髓增生异常综合征(MDS)的个体。如前述，此类患者具有中高风险发展为AML，因此在MDS进展为AML之前，利用本发明的CD43肽或化合物或核酸分子或功能等效物或载体，预先诱发所述患者中的抗AML免疫应答是有益的。本发明的CD43肽、或本发明的化合物或核酸分子或功能等效物或载体的半预防性应用的另一例子为，其用于接受了同种异体造血干细胞移植(HSCT)的AML、MDS或CML患者。此类同种异体HSCT的目标为引起同种异体移植物抗白血病/MDS的应答，但目前没有能够确认这类应答的发展的方式。本发明提供了本发明的CD43肽、或其编码核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体、或包括本发明的CD43肽的化合物，作为诱发针对表达CD43的恶性细胞的同种异体反应性(alloreactive)免疫应答(移植物对抗肿瘤的应答，例如，针对MDS、AML或CML)的预防性或半预防性试剂的用途。本发明的CD43肽、或本发明的化合物或核酸分子或功能等效物或载体的预防性或半预防性应用的另一例子为，其用于CML患者。目前，利用酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(Imatinib)，很好地控制了许多患者中的CML。然而，患者可能发展出对于一种或多种酪氨酸激酶抑制剂的抗性。此外，酪氨酸激酶抑制剂的使用有时候涉及不良副作用，像是水肿、皮肤疹、疲劳、恶心及骨髓抑制。酪氨酸激酶抑制剂亦是昂贵的。本发明提供了本发明的CD43肽、或其编码核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体、或包括本发明的CD43肽的化合物，作为推迟或防止CML发展为AML的预防性试剂或半预防性试剂的用途。在一些实施方式中，例如，为了降低不利的副作用和/或费用，使用本发明所述的CD43肽或化合物或核酸分子或功能等效物或载体来替代酪氨酸激酶抑制剂。在另一些实施方式中，本发明所述的CD43肽或化合物或核酸分子或功能等效物或载体与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂一起使用。因此，本文中亦提供了本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物、或编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体，用作预防性试剂或半预防性试剂。亦提供了本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物、或编码本发明的CD43肽的核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体，在制备针对AML的预防性试剂或半预防性试剂中的用途，其中AML例如为已接受了同种异体HSCT的AML患者。在一些实施方式中，如前文所解释的，所述半预防性试剂是用于MDS或CML患者。所述预防性试剂或半预防性试剂优选地包括疫苗。如本文中所使用，术语“预防性试剂”亦包含半预防性试剂。

在一些实施方式中，本发明的CD43肽或化合物或核酸分子或功能等效物或载体是用于治疗骨髓增生或淋巴组织增生疾病，优选为AML。如本文中所使用，“治疗”包含缓和至少一症状，和/或至少暂时地，推迟或甚至中止疾病的进展。在一优选实施方式中，本发明的CD43肽(可选地在MHC复合物的环境中)、或其编码核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体、或包括本发明所述的CD43肽的化合物，被给药予AML患者，以促进他/她的免疫***，从而产生增强的免疫应答。在一些实施方式中，离体(ex vivo)培养来自AML患者的初始

T细胞或B细胞，并与本发明的CD43肽或化合物一起孵育(在T细胞培养物的情况下，可选地在MHC复合物的环境中)，以取得AML特异性T细胞或B细胞，随后将该AML特异性T细胞或B细胞(可选地在离体扩增之后)给药予患者。在一些实施方式中，测定来自所述AML患者的AML特异性B细胞是否与抗体AT14-013竞争结合CD43，因为竞争的B细胞对AML将特别地有效，尤其是考虑到AT14-013也靶向已知具有更高治疗抗性且常为治疗后疾病复发的原因的白血病干细胞的事实。

在一些实施方式中，使用过继细胞疗法(adoptive cell therapy)。在一些实施方式中，利用在MHC复合物环境中的本发明的CD43肽、或利用包括在MHC复合物环境中的本发明的CD43肽的化合物，测试来自AML患者的T细胞的结合或活化，识别所述CD43肽的T细胞优选地经离体(ex vivo)扩增并接着给药予患者，其将导致抗AML的T细胞应答。

在一些实施方式中，使用供体淋巴细胞的过继细胞疗法。优选地利用在MHC复合物环境中的本发明的CD43肽、或利用包括在MHC复合物的环境中的本发明的CD43肽的化合物，测试分离自接受了同种异体HSCT的AML患者、或分离自HSCT供体的供体T细胞的结合或活化，并且，识别所述CD43肽的供体T细胞优选地经离体(ex vivo)扩增并接着给药予患者，其将导致抗AML的同种异体T细胞应答。

在一些实施方式中，T细胞经修饰以为它们提供AML特异性结合部分。所述T细胞优选地源自AML患者或MDS患者或CML患者或HSCT供体。在一些实施方式中，产生了嵌合抗原受体(CAR)T细胞。这些为具有经修饰的T细胞受体的T细胞，其中经修饰的T细胞受体已被提供了感兴趣的结合特异性，优选源自抗体。一般而言，通过将源自单株抗体的单链可变区(scFv)与CD3-ζ(zeta)跨膜结构域融合来产生CAR T细胞，使得在scFv识别靶点时诱发ζ信号。

根据一些实施方式，使用本发明的CD43肽、或其编码核酸分子或功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体、或包括本发明的CD43肽的化合物，来产生和/或分离CD43特异性B细胞和/或抗体，其进而用于产生经修饰的T细胞。例如，使用所述CD43肽或化合物或核酸分子或功能等效物或载体以诱发、检测和/或分离AML特异性抗体或AML特异性B细胞。接着，在一些实施方式中，将所述抗体或B细胞的重链和/或轻链可变区提供给T细胞，藉此产生具AML特异性的经修饰的T细胞。在一些实施方式中，这些经修饰的T细胞接着被给药予AML患者，其将导致AML特异性T细胞应答。在一些实施方式中，所述经修饰的T细胞为CAR T细胞。在一些实施方式中，在将所述抗体或B细胞的重链和/或轻链可变区提供给T细胞之前，测试所述AML特异性抗体或AML特异性B细胞与抗体AT14-013对CD43结合的竞争。此类竞争的抗体优选地经选择以用于产生具AML特异性的经修饰的T细胞。

因而更进一步提供了本发明的CD43肽(可选地在MHC复合物的环境中)、或包括本发明所述的CD43肽的化合物、或编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体，用作药物。亦提供了本发明的CD43肽(可选地在MHC复合物的环境中)、或包括本发明所述的CD43肽的化合物、或编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体，在产生AML特异性T细胞中的用途。一些实施方式提供了一种用于产生经修饰的T细胞的方法，所述方法包括将来自AML患者的含抗体的样品或来自AML患者的含B细胞的样品与本发明的CD43肽或化合物接触，产生针对AML的结合的抗体或B细胞，接着取得来自所述AML患者的来自AML特异性抗体或来自AML特异性B细胞的一种或多种AML特异性结构域，且将所述一种或多种结构域提供给T细胞。一些实施方式提供了一种用于产生经修饰的T细胞的方法，该方法包括使用本发明的CD43肽或化合物或核酸分子或功能等效物或载体免疫非人类动物，从而诱发针对AML的免疫应答，随后，可选地在测定了所述AML特异性抗体或AML特异性B细胞是否与抗体AT14-013竞争对于CD43的结合之后，从所述非人类动物取得来自AML特异性抗体或AML特异性B细胞的一种或多种AML特异性结构域，或者取得编码所述一种或多种AML特异性结构域的一种或多种核酸序列，并且将所述一种或多种结构域、或所述一种或多种核酸序列提供给T细胞。本文还提供了本发明的CD43肽或化合物用于免疫疗法，以及在MHC复合物的环境中的本发明的CD43肽用于免疫疗法，以及编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物用于免疫疗法。一些实施方式提供了一种载体用于免疫疗法，该载体包括本发明的核酸分子或功能等效物。进一步提供了本发明的CD43肽、或包括本发明的CD43肽的化合物、或编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、或包括本发明的核酸分子或功能等效物的载体，在制备针对骨髓增生或淋巴组织增生疾病，优选AML的药物中的用途。

亦提供了一种免疫组合物，该免疫组合物包括本发明的CD43肽、和/或包括包含本发明的CD43肽的化合物、和/或包括编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物、和/或包括包含本发明的核酸分子或功能等效物的载体。所述免疫组合物优选地进一步包括生物相容性添加物，例如，载剂、稀释剂、赋形剂或填充剂。一些实施方式提供了一种疫苗，该疫苗包括本发明的CD43肽(可选地在MHC复合物的环境中)。一些实施方式提供了一种包括含本发明所述的CD43肽的化合物的疫苗，以及一种包括编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物的疫苗，以及一种包括含本发明的核酸分子或功能等效物的载体的疫苗。其他实施方式提供了一种包括本发明的CD43肽的组合物，或一种包括含本发明的CD43肽的化合物的组合物，或一种包括编码本发明的CD43肽的核酸分子或其功能等效物的组合物，或一种包括含本发明的核酸分子或功能等效物的载体的组合物，其中所述组合物为医药组合物，其进一步包括医药上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方式中，与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物用于骨髓增生或淋巴组织增生疾病(优选AML)的治疗。如WO2015/093949中所述，从完全缓解的AML患者取得抗体AT14-013，证明AT14-013对于AML是有效的。此外，AT14-013亦靶向白血病干细胞，已知白血病干细胞具有更高的治疗抗性且常为治疗后的疾病复发的原因。与AT14-013竞争结合CD43的抗体从而对骨髓增生疾病(如AML)亦将非常有效。因此，此类抗体给药予AML患者将有效地抵消和/或杀死AML细胞。一些实施方式从而提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，用作药物。一些实施方式提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，在制备药物中的应用。

亦提供了与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，用于至少部分地治疗或预防脊髓发育不良或骨髓增生或淋巴组织增生疾病的方法中；以及与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物，在制备针对骨髓增生或淋巴组织增生疾病的药物中的用途。所述骨髓增生疾病优选地包括AML。又一些实施方式提供了一种组合物，该组合物包括与抗体AT14-013竞争结合CD43的经分离、重组或纯化的抗体、或其功能性部分或功能等效物。所述组合物优选地为医药组合物，该医药组合物包括医药上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

如前文所述，一些实施方式提供了一种编码本发明的CD43肽的经分离、合成或重组的核酸分子、或其功能等效物。此类核酸分子或功能等效物例如可用于利用核酸表达***，例如宿主细胞来产生本发明的CD43肽。在一些实施方式中，AML细胞用作为宿主细胞。在一些实施方式中，THP-1细胞用作为宿主细胞。在一些实施方式中，选自由Kasumi 3细胞、HL60细胞、KG1a细胞、SH2细胞、MonoMac6细胞、Molm13细胞及CML K562细胞所组成的组中的细胞用作为宿主细胞。

本发明所述的核酸分子或功能等效物也可用于诱发免疫应答。例如，本发明的核酸分子或功能等效物被给药予AML患者，以诱导或增强AML特异性免疫应答(免疫疗法)。在一些实施方式中，本发明的核酸分子或功能等效物被给药予MDS或CML患者，以推迟或防止MDS或CML进展为AML(预防性或半预防性应用)。在一些实施方式中，本发明的核酸分子或功能等效物被给药予非人类动物，以诱发抗AML的免疫应答，其后可从所述动物收集AML特异性抗体和/或AML特异性免疫细胞。或者，对来自所述非人类动物的AML特异性B细胞的编码可变区的核酸序列进行测序，以取得AML特异性可变区的一种或多种核酸序列，其后将包含AML特异性可变区序列的一种或多种核酸分子导入生产细胞，用于AML特异性抗体的产生。

在一些实施方式中，本发明的核酸分子或功能等效物存在于基因递送载具(genedelivery vehicle)中，该基因递送载具促进将所述核酸分子或功能等效物引入感兴趣的细胞中。因此，进一步提供了一种基因递送载具，优选为载体，其包括本发明的核酸分子或功能等效物。本文中亦提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括本发明的核酸分子或功能等效物，和/或包括本发明的基因递送载具或载体。

虽然目前的申请可能将特征描述作为相同实施方式的部分或作为分开的实施例的部分，本申请的范围亦包含一些实施方式，其包括本文所述的所有特征或一些特征。

下列实施例中对本发明进行了更进一步解释。这些实施例并不限定本发明的范围，而仅是用于阐明本发明。

附图说明

图1：AT14-013(2K23-1K13)的序列，包含抗体的可变重链序列和可变轻链序列和CDR序列。

图2：AT14-013与AML细胞系和来自新确诊的患者的新鲜分离的原代AML原始细胞(blast)的结合。FAB：AML的法国-美国-英国分类(French-American-Britishclassification)(Bennett等人，1976)。

图3：AT14-013结合至AML细胞系及原代分离的AML细胞。源自患者101的AT14-013与AML细胞系Kasumi3、SH-2、Molm13及THP-1的结合，以及与自新确诊的患者(FAB分类M0-M5)分离的原代白血病原始细胞的结合的代表性例子。自身(in-house)产生的对流感特异性的人类抗体用作阴性对照(填充灰色的直方图)。

图4：AT14-013亦结合至来自高风险骨髓增生异常综合征(MDS/RAEB I及II)以及原始细胞危象(blast crisis)慢性髓性白血病(CML)的患者的白血病原始细胞。绘示的为代表性例子；除了K562(其为一CML细胞系)之外，标示为患者辨识码。自身产生的针对流感的人类抗体用作阴性对照(填充灰色的直方图)。

*BL-060：双表型白血病，对AML治疗反应良好。

图5：AT14-013不结合至非骨髓细胞。(a)AT14-013不结合至健康的PBMC、T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)、非活化的单核细胞(CD14+)或原代分离的胸腺细胞(除了存在于胎儿胸腺中的少部分骨髓细胞以外)。(b)AT14-013亦不结合原代分离的B-或T-ALL细胞、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。(c)AT14-013亦不结合结肠癌细胞系，或来自患结肠癌(Colon CA)或有健康的结肠或回肠的患者的原代分离的细胞。

AT14-013确实结合至粒细胞(a)及人类黑素瘤细胞系(c)。自身产生的针对流感的人类抗体用作阴性对照(填充灰色的直方图)。

图6：CDC及ADCC。钙黄绿素(Calcein)标记的THP-1细胞与AT14-013及兔子血清补体一起培养。活细胞被鉴定为钙黄绿素+、dapi-细胞。然后可使用我们的基于珠粒的测定，计算死细胞的量作为补体依赖性细胞死亡(CDC)的测量值。THP1细胞与CD33的孵育不诱发CDC(左侧)。在使用AML细胞系SH-2或新鲜分离的白血病原始细胞作为靶细胞的Jurkat报导***中(右侧)，AT14-013也能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

图7：AT14-013的靶点鉴定：免疫沉淀法(IP)。对THP1细胞裂解液使用生物素标记的(藉由转肽酶(sortase)标签)AT14-013进行IP，在Imperial Coomassie染色的凝胶上产生约140kDa的条带。所述条带是特异性的，因为其未见于THP1细胞裂解液的AT10-002IP或Jurkat细胞裂解液的IP中。将条带从凝胶中切出，且藉由质谱仪分析鉴定出靶点为CD43。

图8：AT14-013的靶点确认。使用AT14-013或使用流感特异性抗体AT10-002对THP-1及Molm13裂解液进行免疫沉淀。使用小鼠-抗-CD43(克隆Mem59)进行的Western印记分析确认了CD43为AT14-013的结合靶点。

图9：AT14-013结合至独特的CD43表位。(a)使用商业上可取得的CD43特异性抗体DF-T1、84-3C1、L10及Mem59，和使用AT14-013，对THP-1细胞进行染色。所有抗体均结合至THP-1细胞的细胞膜。(b)相较于商业上可取得的CD43特异性抗体，AT14-013具有不同的结合分布图(profile)。在Kim ea(Kim等人，2014)中，概述了商业上可取得的CD43抗体YG5、2C8、8E10及DFT-1对多种细胞系的结合。我们比较了AT14-013对相同细胞系的结合，发现了不同的结合模式。(c)如指示使用AT14-013及商业上可取得的CD43特异性抗体进行了竞争实验。简言之，THP-1细胞与浓度渐增的指定抗体一起孵育，其后添加可能竞争的抗体(称为“竞争抗体”)。细胞与商业上可取得的CD43抗体的预孵育不影响AT14-013对THP-1靶细胞的结合，而这些商业上可取得的CD43抗体确实抑制彼此与THP-1细胞的结合。示出了AT14-013或84-3C1为“竞争抗体”的实验结果。(d)竞争实验的概述。AT14-013不与商业上可取得的CD43抗体竞争结合THP-1，代表AT14-013结合不同的表位。

图10：使用神经氨酸酶(唾液酸酶)对THP-1细胞的去糖基化，从细胞膜去除了唾液酸。“无”表示未经神经氨酸酶处理，“1:20”及“1:200”表示神经氨酸酶的稀释。这些细胞经神经氨酸酶处理后，抗体AT14-013、Mem 59、DF-T1及84-3C1丧失对THP-1细胞的结合。克隆L10不结合至CD43的唾液酸化表位，因为THP-1细胞的神经氨酸酶处理不影响该抗体对其靶细胞的结合。

图11：CD43截短的变异体定位商业上可取得的抗体DF-T1及MEM59的表位。a)使用抗CD43探测的表达CD43的截短变异体的HEK293T细胞的免疫印记，指向蛋白质的胞内C端尾部。b)使用CD43特异性抗体MEM59(上方)及DF-T1(下方)对相同印记进行免疫染色，揭示它们的表位存在于区域‘C’(氨基酸59～82)中。

图12：来自THP1细胞的CD43截短的变异体的免疫沉淀鉴定出AT14-013表位。a)使用抗Flag抗体，探测过表达分选的CD43截短变异体的THP1细胞的输入裂解液的免疫印记。丽春红(PonseauS)染色证实样品的等量装载。所有突变蛋白质均表达。b)THP1变异细胞系与AT14-013的洗脱免疫沉淀的抗Flag免疫印记，揭示结合至突变体A～F，且不结合至突变体H～J，从而限定了表位。c)显示所有样品中的内源性免疫沉淀的CD43，使用抗CD43胞浆尾部结合抗体(Novus)进行的免疫印记，以及截短变异体的染色。

图13：CD43的氨基酸序列(Genbank CCDS10650.1)。显示信号肽、AT14-013表位、跨膜结构域，及细胞内结构域和细胞外结构域。

图14：AT14-013与其他AML原始细胞的结合。AT14-013与来自新确诊的患者的新鲜分离的原代AML原始细胞(CD45dim)的结合。自身产生的对流感有特异性的人类抗体用作阴性对照。对于商业用的小鼠抗CD43抗体，小鼠抗CMV用作为对照。

WHO:Swerdlow S.H.造血及淋巴组织的肿瘤的WHO分类(2008)。CD43+ T细胞及扁桃体细胞用作测定的额外的对照。AT14-013不与这些健康的细胞结合。

(％门选(gated)＝-；<10％,+；10～25％,++；25～50％,+++；50～75％,++++；75～100％)。

图15：ADCC及CDC。

a)对于以效靶例为50:1的AML细胞系SH-2与PBMC，AT14-013(空心正方形)能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。活细胞被鉴定为钙黄绿素+、dapi-细胞。然后可使用我们的基于珠粒的测定，来计算死细胞的量。SH2细胞与AT10-002孵育不诱导ADCC(黑点)。AT14-013的经计算的EC50为0.16ug/ml。

钙黄绿素标记的SH-2细胞(b)与AT14-013(空心正方形)或AT10-002(黑点)及兔子血清补体一起孵育。活细胞被鉴定为钙黄绿素+、dapi-细胞。SH2细胞或AML原始细胞与AT10-002孵育不诱导CDC(黑点)。AT14-013的经计算的EC50为1.86ug/ml。

图16：a)THP1变异细胞系与AT14-013的经洗脱的免疫沉淀的抗Flag免疫印记，揭示结合至突变体A-F2、较少结合至G，且不结合至突变体H-J。b)显示在所有样品中的内源性免疫沉淀CD43的使用抗CD43胞浆尾部结合抗体(Novus)的免疫印记，以及截短变异体的染色。此对照确定免疫沉淀在所显示的所有样品中都为成功的。

图17：a)如处死时藉由全身测量所测得的(p<0.001，重复ANOVA)，对植入SH-2AML细胞的小鼠的处理产生90.3％的肿瘤生长抑制。b)藉由每分钟的光子量(cpm)测量的AML细胞的数量，在所有测量的器官中均显示大幅减少(p＝0.0011，重复二因素方差分析(2wayANOVA))。c)藉由于骨髓及肝中的FACS评估肿瘤细胞的数量(p＝0.0017，二因素方差分析)。

图18：AT14-013结合至胎儿CD34+造血干细胞(HSC)但不结合至胎儿CD34+CD38+祖细胞或胎儿CD34-CD38-成熟细胞的代表性例子。填充灰色的直方图：针对流感的对照抗体AT10-002(如WO 2013/081463中所述)。

图19：AT14-013与自体白血病干细胞反应。

使用AT14-013，使用对CD34和CD38具特异性的抗体，以及使用针对CD45的抗体(BD，cat 348815)，对供体#101(与取得产生AT14-013的B细胞的供体相同)的AML原始细胞进行染色，以将整体原始细胞群(CD45dim)与骨髓中的健康细胞区分开，并藉由流式细胞仪进行分析。

具体实施方式

实施例

实施例1

材料与方法

患者和健康人类的材料

研究实验流程已经过学术医学中心的医学伦理委员会核准。所有参与者签署了知情同意书。参与者包括由我们的诊所招募的健康个体及患恶性血液病的患者，他们捐赠了外周血和/或骨髓。

AML特异性克隆AT14-013的产生

如WO 2015/093949的实施例2所述，AML患者101的经转导的初始及记忆IgG B细胞，其如前述(Kwakkenbos等人，Nat Med 2010以及WO 2015/093949的实施例1)藉由导入Bcl6及Bcl-xL而永生化，以每孔20或40个细胞的浓度(此后称微量培养物(microculture))接种，并使用IL-21和CD40L扩增。接着，藉由FACS，利用人类IgG H+L AF647(LifeTechnologies)或人类-IgG-PE(Southern Biotech)作为二级抗体，筛选扩增的B细胞微量培养物的上清液中结合AML细胞系(THP-1、MonoMac6等等)的抗体，以及结合肝及结肠细胞系的抗体。许多自身产生的抗体用作阴性对照抗体，例如，抗CD30(表达于活化的B及T淋巴细胞上)、抗CD33(表达于单核细胞、骨髓祖细胞及骨髓白血病上)、D25(针对RSV；如WO2008/147196中所述)及AT10-002(针对流感；如WO 2013/081463中所述)。选择结合AML细胞系但不结合肝和结肠细胞系的微量培养物，并以1个细胞/孔的浓度接种，再次测试它们的上清液对于AML细胞系的特异性。选择上清液特异性地结合AML细胞系且不结合肝或结肠细胞系、或健康的PBMC和骨髓的克隆用于测序。在正常培养条件下，于FBS IgG低血清(Hyclone)的存在下扩增克隆，且从这些培养物的上清液纯化抗体如下述用于重组的抗体。接着再次测试重组抗体的特异性结合。取得的AML特异性抗体之一为AT14-013。使用人类IgG H+L AF647(Life Technologies)作为二级抗体，额外地测试所发现的AT14-013抗体对新确诊的AML患者的新鲜分离的原始细胞(FAB M0-M5)的结合。

AML特异性抗体AT14-013的克隆

如WO 2015/093949的实施例1所述，为了产生重组抗体，我们使用

迷你试剂盒(Qiagen)分离总RNA，生成cDNA，进行PCR，将重链可变区及轻链可变区克隆至pCR2.1TA克隆载体(Invitrogen)中。为了排除反向转录酶或DNA聚合酶诱导的突变，我们进行了多个独立的克隆实验。为了产生重组的mAb，我们将处于人类IgG1及κ(Kappa)恒定区框架内的每一抗体的重链可变区及轻链可变区克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)基载体中，且瞬时转染293T细胞。我们使用蛋白A或G(取决于克隆的Ig亚型)，从培养物上清液中纯化了重组的抗体。

CDC及ADCC

为了量化AML特异性抗体AT14-013诱导的靶细胞的补体依赖性细胞死亡(CDC)，我们使用了基于FACS的白血病细胞裂解分析。THP-1细胞与2μM钙黄绿素AM(BectonDickinson)于37℃孵育30分钟。将钙黄绿素标记的THP-1细胞与抗体及兔子血清补体于37℃一起孵育4小时。以50/50的比例向细胞中添加FACS校正珠粒(Accudrop FluorescentBeads,BD Biosciences)，其后使用FACS取得珠粒的标准量。由于已藉由校正珠粒确定了相等的测定体积，死亡细胞的量可被计算为：100-((各处理中的Dapi阴性，钙黄绿素AM阳性细胞/对照中的Dapi阴性，钙黄绿素AM阳性细胞)×100)。对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，我们使用Jurkat细胞生成了读出***，其中Jurkat细胞稳定转导有NFAT(6x)-IL2(最小启动子)-GFP和CD16a(FcR-IIIa)。在此***中，通过结合抗体而活化的CD16a受体活化NFAT，NFAT诱导GFP表达，该GFP表达随后用作读出值(read-out)，以量化效应细胞的活化。将AML细胞(靶细胞)与抗体一起孵育，并与以前述钙黄绿素AM染色的Jurkat细胞(效应细胞)混合。效应物：标靶的比例为1:1。

AT14-013靶点的鉴定及验证

THP-1细胞经裂解(补充有蛋白酶及磷酸酶抑制剂(Roche)的0.5％Triton X114(Sigma)、150mM NaCl、10mM Tris-HCL pH7.4、1.5mM MgCl₂)，且经无关的抗体(自身生成的RSV抗体D25)、蛋白G及链霉亲合素(Streptavidin)珠粒(Pierce)预清除(preclear)，以去除非特异性结合的蛋白质。接着将预清除的细胞裂解液与结合珠粒的AML特异性抗体、或与作为阴性对照的流感特异性抗体AT10-002一起孵育(于4℃进行3小时)。在补充有0.5％脱氧胆酸钠(Deoxycholate)及0.1％SDS的细胞裂解缓冲液中清洗经抗体孵育的珠粒5次，从珠粒上洗脱下结合的蛋白质(0.1M甘氨酸pH10.5、150mM NaCl、1％Triton X100、1mMEDTA)，且接着于SDS-PAGE上进行电泳。85％的IP样品于SDS-PAGE上进行电泳，并使用Imperial蛋白质染料(Pierce)染色以对总蛋白质进行染色，并切出特定条带用于质谱仪分析。将剩余的IP样品于SDS-PAGE上进行电泳，并转移至PVDF膜(Bio-RAD)用于免疫印记。印记经由Ponseau S染色以揭示总蛋白质，并使用BSA进行封闭，接着与小鼠-抗CD43(克隆MEM-59,Abcam)一起孵育，用于Western印记分析。

表位定位：竞争

THP-1细胞与AT14-013和商业上可取得的CD43抗体在冰上预孵育60分钟，其中商业上可取得的CD43抗体：小鼠抗人类CD43PE(Ebioscience；克隆84-3C1)、小鼠抗人类CD43FITC(Invitrogen；克隆L10)、小鼠抗人类CD43FITC(Abcam；克隆MEM-59)、小鼠抗人类CD43未经标记(Abcam；克隆MEM-59)、小鼠抗人类CD43未经标记(Thermo Scientific：克隆DF-T1)。最大封闭抗体浓度为10ug/ml。之后，以1ug/ml的终浓度添加竞争抗体。藉由此步骤，封闭抗体的终浓度为2ug/ml。细胞在冰上孵育30分钟，其后添加dapi(Sigma)以从分析中排除死亡细胞。藉由流式细胞仪分析样品。

表位定位：去糖基化

THP-1细胞与神经氨酸酶(Roche；稀释1:20或1:200)于37℃孵育60分钟，以从CD43去除唾液酸(de Laurentiis等人，2011)。然后清洗细胞，于60％正常山羊血清中封闭，并与AT14-013和如上述商业上可取得的CD43抗体DF-T1、84-3C1、L10及MEM-59一起孵育。为了能够比较经不同荧光物染色的细胞，将与未经处理的细胞(没有神经氨酸酶)的结合设定为1。图10所示为与经神经氨酸酶处理的细胞结合增加/减少的倍数。

表位定位：CD43截短的变异体

CD43 cDNA获自Geneart(Life Technologies)，并经修改为在C或N端任一者上(C端至信号肽，包括CD43的前19个氨基酸)包含处于框架内的3xFLAG标签。将cDNA克隆于含CD43 cDNA的IRES-GFP 3’的pHEF-TIG第三代慢病毒载体中；在HEK293T细胞中产生VSV-G慢病毒颗粒。在纤维连接蛋白(retronectin)存在的情况下，使用这些病毒转导THP1、MOLM及其他细胞，并分选GFP以取得过表达CD43的细胞的单纯群体。通过带CD43 C端FLAG标签的cDNA的PCR-克隆，构建截短的CD43变异体，以包含信号肽(AA 1-19)，接续为野生型全长胞外序列(变异体A：S20-P400，接续为3xFLAG：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)或截短的胞外序列(变异体B-J)。B：31-400；C：59-40；D：82-400；E：112-400；F：133-400；G：166-400；H：184-400；I：202-400；J：220-400(跨膜结构域开始于AA 255)。藉由慢病毒转导和GFP分选，在THP1细胞中表达这些变异体。将经分选的细胞裂解，并如前述使用AT14-013和对照进行免疫沉淀。将洗脱的IP样品于SDS-PAGE上进行电泳，并使用抗-FLAG-HRP(Sigma)进行免疫印记，以揭示结合。

结果

AT14-013特异性结合AML细胞

在此实施例中，我们辨识出我们实验室最近开发出的(WO 2015/093949及图1)AML特异性抗体AT14-013的靶点。此抗体源自被称为患者101的患者。他在49岁时被诊断出患中度风险的AML(没有细胞遗传或分子异常；FAB分类AML-M5)。因为没有可用的HLA匹配的亲族干细胞供体，他接受了两个疗程的化疗(阿糖胞苷(cytarabine)、伊达比星(idarubicine)、安吖啶(amsacrine))以及一个疗程的巩固性化疗(白消安(busulphan)、环磷酰胺)，接着进行了自体造血干细胞移植(HSCT)。在初次诊断后的14个月，他的病情复发。在一个周期的高剂量阿糖胞苷之后他获得了完全的缓解，其后他接受了相匹配的、非亲属供体的降低强度的同种异体HSCT(RIST-MUD)。6周后，他发展出皮肤、肝脏及肠道的急性GvHD(阶段1；程度II)，其对皮质类固醇治疗反应良好。有鉴于此患者维持无疾病至今超过5年，尽管他的疾病具有高风险性，但此患者可被视为已产生了强有力的移植物对抗AML应答，这是选择他作为对强有力发AML特异性抗体应答研究的原因。HSCT后38个月，从该患者取得的放血产物中分离出B细胞，该B细胞如前述藉由导入Bcl6及Bcl-xL而永生化(Kwakkenbos等人，Nat Med2010)，且以20或40个细胞/孔(well)的浓度培养。筛选这些微量培养物的上清液对AML细胞系的结合，且将对AML具特异性的微量培养物以1个细胞/孔的浓度进行亚克隆。通过此程序辨识出的抗体之一为AT14-013，IgG1κ(kappa)，高度体细胞超变抗体。

如图2所示，AT14-013特异性结合至多种AML细胞系及原代AML细胞，涵盖所有AMLFAB分类。在图3中，显示出AT14-013与Kasumi3、SH-2、Molm13及THP-1结合，以及与从新确诊的患者分离的原代白血病原始细胞结合的一些代表性例子。此外，AT14-013结合至其他骨髓恶性肿瘤，如来自高风险骨髓增生异常综合征(MDS/RAEB I/II)的AML，或原始细胞危象慢性髓性白血病(CML)及CML细胞系K562(图4)。AT14-013对粒细胞确实显示出一些结合，但并不结合淋巴系的健康外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、胸腺细胞、恶性血液病，或肝脏及结肠的健康或恶性细胞。AT14-013确实结合培养的黑色素细胞及黑素瘤细胞系(图5)。

AT14-013诱导靶细胞的CDC及ADCC

AT14-013可诱导AML细胞系及原代分离的AML原始细胞的补体依赖性细胞毒性及抗体依赖性细胞毒性(图6)。

AT14-013的靶点为CD43的独特表位

我们接着辨识AT14-013的靶点。THP-1细胞裂解液与生物素标记的带分选酶标签的AT14-013孵育进行免疫沉淀(IP)，产生了～140kDa的条带。所述条带具有特异性，因为其未见于THP1裂解液的AT10-002IP或Jurkat裂解液IP中(图7)。免疫沉淀条带的质谱仪分析揭示了CD43为靶蛋白。在3种预期的胞内肽中辨识出三种，得到7％的蛋白质覆盖率，未辨识到胞外肽，因为这些胞外肽是高度糖基化的。通过Western印记分析，确认了AT14-013结合CD43。简言之，使用AT14-013或流感特异性抗体AT10-002，对THP-1和Molm13的裂解液进行免疫沉淀。使用小鼠-抗CD43(克隆Mem59)的Western印记分析确认了CD43为AT14-013的结合靶点(图8)。

CD43广泛地表达于健康及恶性的细胞上。CD43特异性抗体已被生产且为商业上可取得的，例如，DF-T1、84-3C1、L10及MEM-59。藉由这些抗体，我们确认了THP-1细胞的CD43表达(图9a)。观察到AT14-013不结合非骨髓细胞，以及相较于其他CD43抗体，AT14-013对各种细胞和细胞系具有不同的结合分布图(图9b)，这表明AT14-013识别与其他CD43抗体不同的CD43表位。确实地，当我们进行竞争实验时，THP-1细胞与商业上可取得的CD43抗体及AT14-013一起孵育，我们发现这些CD43抗体彼此竞争对THP-1的结合，但不与AT14-013竞争(图9c及图9d)。值得注意的是，已经描述了CD43克隆L10及84-3C1彼此竞争(L.Borche等人，2005)；此亦于我们的实验中得到了证实。

CD43蛋白为高度糖基化的蛋白质(de Laurentiis等人，2011)。CD43抗体Mem59、DF-T1及84-3C1(但没有L10)结合至唾液酸化的表位，因为经神经氨酸酶预处理靶细胞移除了所有α-N-乙酰神经氨酸(唾液酸)之后，这些抗体丧失了对CD43的结合(US2010/0234562A1)。图10中，我们证实在使用神经氨酸酶预孵育THP-1细胞后，亦丧失了AT14-013对THP-1细胞的结合，这证明AT14-013特异性结合至CD43的唾液酸化的表位。

为了更具体地辨识出AT14-013的结合表位，我们生成了10种CD43的带Flag标签的胞外截短的变异体，其表达于HEK及THP1细胞中。对与Mem59或DF-T1一起孵育的这些细胞的裂解液进行的Western印记分析，证实这些抗体结合至位于氨基酸59～82之间相似的表位(图11a及图11b)。我们通过经这些截短的变异体转导的THP1细胞的免疫沉淀，测试了AT14-013的结合。如IP的抗Flag免疫印记所示(图12a及图12b)，AT14-013与变异体A-F强烈地相互作用，与变异体G较小程度地相互作用，且不与变异体H-J相互作用。图12c中，我们使用抗C端的CD43抗体确认了AT14-013的IP。内源性CD43存在于所有样品中，然而截短的CD43仅存在到变异体G。因此，我们得到的结论为AT14-013的表位在氨基酸第133至184位。

实施例2：对AML原始细胞的结合

材料及方法

使用如实施例1标题“AML特异性克隆AT14-013的产生”下所述的方法，测试抗体AT14-013对不同细胞的结合。在测定之前，使用抗人类CD45(BD)对患者样品进行染色。AML细胞被定义为CD45dim。使用抗人类CD3(biolegend)对健康的PBMC进行染色。藉由ficol密度梯度分离源自扁桃体的多型核细胞。

结果

如实施例1及图4所示，AT14-013特异性结合至多种AML细胞系及原代AML细胞，涵盖所有AML FAB分类。此外，我们以更广泛的AML原始细胞测试了抗体。其显示结合至目前测试的所有AML原始细胞，且通常比商业的抗CD43抗体的结合更好。有趣地是，不依赖于唾液酸的L10抗体在几乎所有的样品中结合最小。此外，以表达CD43的健康T细胞及源自扁桃体的细胞测试了抗体。于此，仅商业的抗体显示被染色。结果总结于图14中。

实施例3：ADCC及CDC

除了实施例1及图6，进一步进行了另一ADCC和CDC实验。

材料及方法

为了量化AML特异性抗体AT14-013诱导的靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及补体依赖性细胞死亡(CDC)，我们使用了基于FACS的白血病细胞裂解分析。SH2细胞与10nM的钙黄绿素AM(Becton Dickinson)于37℃孵育30分钟。然后，将钙黄绿素标记的细胞与抗体及健康的外周血单核细胞(PBMC；效应物:靶标为50:1)于37℃孵育4小时，或与兔子血清补体于37℃孵育1小时。将FACS校正珠粒(Accudrop Fluorescent Beads,BDBiosciences)以50/50的比例添加到细胞中，之后通过FACS取得珠粒的标准量。由于已藉由校正珠粒确定了相等的测定体积，死亡细胞的量可被计算为：100-((各处理中的Dapi阴性，钙黄绿素AM阳性细胞/对照中的Dapi阴性，钙黄绿素AM阳性细胞)×100)。

结果

AT14-013诱导靶细胞的CDC及ADCC

AT14-013可诱导AML细胞系及原代分离的AML原始细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(图15A)以及诱导补体依赖性细胞毒性(图15B)。

实施例4：表位定位：CD43截短的变异体

除了实施例1及图12以外，进一步研究了AT14-013的结合表位。

材料及方法

使用与实施例1相同的方法。CD43 cDNA获自Geneart(Life Technologies)，并经修改为C或N端任一者上(C端至信号肽，包括CD43的前19个氨基酸)包含处于框架内的3xFLAG标签。将cDNA克隆于含CD43 cDNA的IRES-GFP 3’的pHEF-TIG第三代慢病毒载体中；在HEK293T细胞中产生VSV-G慢病毒颗粒。在纤维连接蛋白(retronectin)存在的情况下，使用这些病毒转导THP1、MOLM及其他细胞，并分选GFP以取得经CD43转导的细胞的单纯群体。通过带CD43 C端FLAG标签的cDNA的PCR-克隆，构建截短的CD43变异体，以包含信号肽(AA1-19)，接续为野生型全长胞外序列(变异体A：S20-P400，接续为3xFLAG：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)或截短的胞外序列(变异体B-J)。B：31-400；C：59-400；D：82-400；E：112-400；F：133-400；F2：148-400；G：166-400；H：184-400；I：202-400；J：220-400(跨膜结构域开始于AA 255)。藉由慢病毒转导及GFP分选，在THP1细胞中表达这些变异体。将经分选的细胞裂解，并如前述使用AT14-013及对照进行免疫沉淀。将洗脱的IP样品于SDS-PAGE上进行电泳，并使用抗-FLAG-HRP(Sigma)进行免疫印记，以揭示结合。

结果

AT14-013的靶点为CD43的独特表位

为了更具体地辨识出AT14-013的结合表位，我们生成了11种CD43的带Flag标签的胞外截短变异体，其表达于THP1细胞中。我们通过经这些截短变异体转导的THP1细胞的免疫沉淀，测试了AT14-013的结合。如IP的抗Flag免疫印记所示(图16A+B)，AT14-013与变异体A-F强烈地相互作用，与变异体F2较小程度地相互作用，与变异体G较小程度地相互作用，且不与变异体H-J相互作用。图16b中，我们使用抗C端的CD43抗体证实了AT14-013的IP。内源性CD43存在于所有样品中，然而截短的CD43仅存在到变异体F2中。因此，我们得到的结论为，AT14-013的表位包括存在于氨基酸第133至165位之间的一个或多个氨基酸残基。有鉴于AT14-013与变异体F2较小程度地相互作用(开始于氨基酸第148位，如图13所示)，我们还得到AT14-013的表位至少包括存在于氨基酸第133至147位之间的一个或多个氨基酸残基的结论。

实施例5：AT14-013在体内抑制AML生长

目前已知的实验流程，例如，如Miller等人，Blood(2013),Vol.121,No.5,e1-e4中所述。

为了评估AT14-013在体内对抗AML的效率，处理经人类造血细胞重建及经SH2细胞异种移植的免疫缺陷型小鼠。通过将50 000个CD34⁺CD38^-造血干细胞注射到经亚致死地辐射的新生小鼠(1～5天大)的肝脏中，使6只雌性NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG，TheJackson Laboratory)人源化。8周时，小鼠进行放血以评估它们血液中人类造血细胞的植入。此实验中，仅使用外周血中的人类嵌合现象高于20％的小鼠。6只小鼠中的5只符合此标准，且在d0静脉内地接种10×10⁶表达荧光素酶及GFP的SH-2细胞。在d14，以荧光素(150mg/kg)IP注射小鼠，并藉由体内生物荧光测定肿瘤的植入。依据此测量，小鼠随机地被分为2组，接着藉由一周两次iv接种AT14-013或抗体AT10-002(针对流感毒，如WO 2013/081463中所述，作为对照)(375μg)进行给药。如前述，每星期测量一次生物荧光。在d39，在深度麻醉下藉由颈椎脱位处死小鼠，使器官暴露并定量生物荧光。取得肝脏及骨髓的单细胞悬浮液，且藉由FACS定量SH-2GFP+细胞的存在。如处死时藉由全身测量所测量的(p<0.001，重复ANOVA，图17A)，植入SH-2AML细胞的小鼠的处理造成90.3％的肿瘤生长抑制。藉通过每分钟的光子量(cpm)所测量的AML细胞的数量，在所有测量的器官中均显示大幅减少(p＝0.0011，重复二因素ANOVA，图17B)。藉由骨髓及肝脏中的FACS评估肿瘤细胞的数量，证实了这一观察(p＝0.0017，二因素ANOVA，图17C)。

因此，对于本发明的CD43肽具特异性的抗体特别适用于骨髓增生或淋巴组织增生疾病(如AML)的体内治疗或预防。

实施例6

材料及方法

从位于AMC的人类免疫***(HIS)小鼠机构(Human Immune System(HIS)MouseFacility)取得妊娠第16至21周之间的胎儿肝脏、骨髓及胸腺组织(根据荷兰法律：WetFoetaal Weefsel)。使用匀质器(Stomacher)破坏全器官，接着进行密度梯度离心及磁珠分离，从组织中取得了富含CD34的单核细胞悬浮液。藉由密度梯度离心及磁珠分离，制备了胎儿骨髓的富含CD34的细胞悬浮液。

使用商业上可取得的CD34(BD,cat.343516)及CD38(BD,cat.303522)抗体，通过流式细胞仪测量抗体AT14-013对来自胎儿肝脏、胎儿胸腺及胎儿骨髓的细胞的结合，以区分出这些样品中的不同的子集。

结果

AT14-013特异性结合CD43的癌胚(oncofetal)表位

如前文所述，AT14-013为CD43特异性抗体，其识别主要由AML及MDS原始细胞表达的独特、癌-唾液酸化的(onco-sialylated)肿瘤抗原。肿瘤抗原是具有肿瘤特异性表达的异常蛋白质，或是异常表达的正常蛋白，例如癌胚抗原，其是正常仅由胎儿组织在个体发生时所表达的抗原。

细胞的肿瘤性转化常常与癌胚抗原的表达相关。我们发现从胎儿肝脏及胎儿骨髓取得的CD34+CD38-造血干细胞表达CD43的AT14-013表位，但从胎儿肝脏及胎儿骨髓取得的CD34+CD38+祖细胞或CD34-CD38-成熟细胞不表达CD43的AT14-013表位(图18)。这些结果显示AT14-013能够结合在成人中广泛地由AML及MDS表达的CD43的癌胚-唾液酸化的表位。

实施例7

使用AT14-013，使用对CD34及CD38具特异性的抗体(与实施例6的步骤相同)，以及使用针对CD45的抗体(BD，cat 348815)，对供体#101(与取得产生AT14-013的B细胞的供体相同)的AML原始细胞进行染色，以将整体原始细胞群(CD45dim)与骨髓中的健康细胞区分开，并藉由流式细胞仪进行分析(图19)。这显示出AT14-013结合患者(在其中发现了AT14-013)的白血病原始细胞。AT14-013结合CD34+CD38-原始细胞，其包括白血病干细胞。

从而得到的结论为，抗体AT14-013与自体白血病干细胞反应，使得AT14-013特别适用于骨髓增生或淋巴组织增生疾病的治疗或预防，因为它也靶向已知更具治疗抗性且常为治疗后的疾病复发的原因的白血病干细胞。

于此，伴随着对本发明的CD43肽具有特异性的另一抗体，例如，与抗体AT14-013竞争结合CD43的抗体，也特别适用于骨髓增生或淋巴组织增生疾病的治疗或预防。

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美国专利申请号9,005,974

Claims

1.一种具有至多100个氨基酸残基长度的经分离、重组或纯化的CD43肽，其中所述肽能够与抗体AT14-013结合，并且其中所述肽包括氨基酸序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTS，并且其中，所述肽具有AML特异性糖基化形式或MDS特异性糖基化形式。

2.一种免疫原性化合物，包括如权利要求1所述的CD43肽。

3.一种MHC复合物，包括如权利要求1所述的CD43肽。

4.一种经分离、合成或重组的核酸分子或其功能等效物，编码如权利要求1所述的CD43肽，其中所述术语“功能等效物”由包括展现与天然核苷酸相同功能的非天然核苷酸、经修饰的核苷酸、DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)和/或锁核酸(LNA)的链组成。

5.一种载体，包括如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物。

6.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在用于分离和/或取得针对所述CD43肽的免疫细胞和/或抗体或所述抗体的功能性部分或功能等效物的用途，其中所述抗体的功能等效物是含所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

7.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在用于在体外诱导、分离和/或取得针对所述CD43肽的免疫细胞和/或抗体或所述抗体的功能性部分或功能等效物的用途，其中所述抗体的功能等效物是含所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

8.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在用于诱导、分离和/或取得针对所述CD43肽的免疫细胞和/或抗体或所述抗体的功能性部分或功能等效物的用途，其中所述用途用作非治疗目的，其中所述抗体的功能等效物是含所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

9.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在用于产生和/或取得免疫细胞和/或抗体或所述抗体的功能性部分或功能等效物的用途，前提是所述用途不包括作为疫苗的用途，其中所述抗体的功能等效物是含所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

10.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在用于在体外产生和/或取得免疫细胞和/或抗体或所述抗体的功能性部分或功能等效物的用途，其中所述抗体的功能等效物是含所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

11.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在用于产生和/或取得免疫细胞和/或抗体或所述抗体的功能性部分或功能等效物的用途，其中所述用途用作非治疗目的，其中所述抗体的功能等效物是含所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

12.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在制备能够特异性结合骨髓增生细胞或淋巴组织增生细胞的诊断试剂中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述骨髓增生细胞为急性髓性白血病(AML)细胞、骨髓增生异常综合征(MDS)细胞，或慢性髓性白血病(CML)细胞。

14.一种免疫组合物，所述免疫组合物包括如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体。

15.根据权利要求14所述的免疫组合物，其中所述免疫组合物为医药组合物，所述医药组合物还包括医药上可接受的载体。

16.根据权利要求14所述的免疫组合物，其中所述免疫组合物为医药组合物，所述医药组合物还包括稀释剂。

17.根据权利要求14所述的免疫组合物，其中所述免疫组合物为医药组合物，所述医药组合物还包括赋形剂。

18.一种诊断试剂盒，包括如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物或如权利要求3所述的MHC复合物，以及用于检测抗体或免疫细胞的工具。

19.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在制备用于MDS、AML或CML患者的预防性试剂中的用途。

20.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物、如权利要求3所述的MHC复合物、如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体在制备用于治疗骨髓增生或淋巴组织增生疾病的药物中的用途。

21.如权利要求1所述的CD43肽、如权利要求2所述的免疫原性化合物或如权利要求3所述的MHC复合物在制备用于诊断骨髓增生或淋巴组织增生疾病的诊断试剂中的用途。

22.如权利要求21所述的用途，其中，所述诊断试剂用于诊断AML。

23.一种用于产生能够特异性结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞的免疫细胞和/或抗体的方法，所述方法包括使用如权利要求1所述的CD43肽、使用如权利要求2所述的免疫原性化合物、使用如权利要求3所述的MHC复合物、使用如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或使用如权利要求5所述的载体，来免疫非人类动物。

24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括从所述非人类动物收获能够特异性结合淋巴组织增生细胞和/或骨髓增生细胞的免疫细胞和/或抗体。

25.权利要求23或24所述的方法，其中，所述免疫细胞和/或抗体为AML特异性免疫细胞或AML特异性抗体。

26.一种经分离的宿主细胞，包括如权利要求4所述的核酸分子或功能等效物或如权利要求5所述的载体。