CN107794313A - 一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物 - Google Patents

一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测羊口疮病毒VIR基因的荧光定量PCR引物，所述引物序列为上游引物：5’‑ CGATATCCGGAAAGGTCGTTG‑3’，下游引物：5’‑ GCTGTTGATGAGGATGGTGAG‑3’。本发明根据GenBank登录的KF666563.1的VIR基因序列，设计特异性引物，首次针对羊口疮病毒VIR基因建立SYBR Green I实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可用于羊口疮病毒的诊断和流行病学调查。

Description

一种用于检测羊口疮病毒VIR基因的荧光定量PCR引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测羊口疮病毒VIR基因的荧光定量PCR引物，属于分子生物学领域。
背景技术
羊口疮是由羊传染性脓疱病毒引起的羊接触性、嗜上皮性、***共患的传染病，各个年龄段的羊群都能感染发病，主要临床症状表现为嘴唇、口腔黏膜、外阴等出现丘疹或水疱，其中羔羊的危害最严重。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属成员，病毒的核酸为双线DNA，基因组全长约145Kb。目前广泛存在世界各国养羊国家和地区，我国新疆、内蒙、甘肃、吉林、山西、青海、宁夏、四川、黑龙江、福建等十几个省份均有该病发生和流行的报道，给养羊业造成较大的经济损失。
关于羊口疮病毒的诊断还没有通用标准，主要根据临床症状和实验室手段进行确诊。该病易与***、羊痘等相混淆，同时容易引起激发感染。由于当前的疫苗免疫效果不理想，导致该病的防控异常困难。因此很有必要研制一种快速有效的早期诊断试剂盒。国内外有一些关于羊口疮病毒实时荧光定量PCR的报道，然所使用的基因多为B2L、F1L及DNA聚合酶基因，未见有使用干扰素基因VIR建立实时荧光定量PCR的方法，本发明根据羊口疮病毒干扰素基因VIR序列设计特异性的引物，首次建立了针对羊口疮病毒VIR基因的实时荧光定量PCR方法，以期为羊口疮在临床早期诊断和防治提供技术支持，填补了羊口疮病毒VIR基因实时荧光定量PCR检测方法的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测羊口疮病毒的引物，为羊口疮在临床早期诊断和防治提供技术支持，填补了羊口疮病毒VIR基因实时荧光定量PCR检测方法的空白。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测羊口疮病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- CGATATCCGGAAAGGTCGTTG -3’，
下游引物：5’- GCTGTTGATGAGGATGGTGAG -3’。
利用本发明的引物可用于检测羊口疮病毒VIR基因，尤其适用于基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的优化，建立了一套可用于检测羊口疮病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法。
一种用于检测羊口疮病毒的试剂盒，包含所述的引物。
具体方法如下：
1、引物设计：根据GenBank上公布的羊口疮病毒KM666563.1基因序列，针对对VIR基因序列设计特异性的引物。
2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为： SYBR Premix Ex Taq 2×12.5μL、上、下游引物（10 μM）各1μL、模板2μL、双蒸水8.5μL。最佳反应条件为：95℃，30s 预变性；95℃，5s，60℃，30s，共40 个循环。
3、阳性标准品的制备：使用全式金病毒DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。
4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
该方法可用于羊口疮病毒的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。
有益效果
本发明根据GenBank登录的KM666563.1的VIR基因序列，设计特异性引物，建立针对羊口疮病毒VIR基因建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测到100copies，特异性好、重复性好，可用于羊口疮病毒的临床诊断和流行病学调查。
附图说明
图1 羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的特异性扩增曲线。
图2 为羊口疮病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的标准曲线。
图3 为羊口疮病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的敏感性扩增曲线。
具体实施方式
实施例1 羊口疮病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立
一、材料：
大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌、羊口疮病毒为本研究室分离、鉴定和保存。
二、步骤
1、仪器与试剂： SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）、DL2000 Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR管购自Axygen（美国）公司； Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪，eppendorf（德国）公司产品。
2. 引物的特异性
引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据GenBank登录的KM666563.1的VIR基因序列，利用Beacon Designer 7.9软件设计引物，通过BLAST软件比对分析，初步验证其特异性。
3、阳性标准品的制备
以提取的DNA为模板，使用全式金病毒DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。
4. 反应条件的优化
采用25μL反应体系(SYBR Premix Ex Taq 2×) 12.5μL，PCR上游引物（10μM）1μL，PCR下游引物（10μM）1μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积25μL，以出现最小的Ct值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度（55～68℃）和引物浓度（0.2～1.0μM）进行优化。
5、建立标准曲线
用EASY Dilution将构建的标准品梯度稀释(107、106、105、104、103、102、101copies/μL)作为模板，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立标准曲线。
对阳性标准品的标准曲线和敏感性扩增曲线显示，SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法对羊口疮病毒的最低检测限为100copies，且Ct与拷贝数在1×102-1.1×107 拷贝/μL，反应范围内有很好的线性关系，相关系数R2为0.998，扩增效率为112%。标准曲线见图2，敏感性扩增曲线见图3。
6 特异性检测
6.1 特异性检测
用优化的条件分别对羊口疮病毒大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌核酸样品进行检测，对该方法的特异性进行评价。检测结果显示，只有羊口疮病毒核酸样品为阳性，其余核酸样品检测结果均为阴性。见图1。
6.2 重复性评估
对同一阳性标准品设3个重复管，用实时荧光定量PCR进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃保存，分别于第7、14、21d重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为1.24 %-2.75%，组间变异系数为1.63%～2.59%，可重复性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 林裕胜
<120> 一种用于检测羊口疮病毒VIR基因的荧光定量PCR引物
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgatatccgg aaaggtcgtt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgttgatg aggatggtga g 21

Claims (2)

1.一种用于检测羊口疮病毒VIR基因的荧光定量PCR引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- CGATATCCGGAAAGGTCGTTG -3’，
下游引物：5’- GCTGTTGATGAGGATGGTGAG -3’。
2.一种用于检测羊口疮病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。
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