CN107765013A - 早期卵巢癌筛查方法及试剂盒 - Google Patents

早期卵巢癌筛查方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种早期卵巢癌筛查方法及试剂盒，该方法是：采用角质素酶蛋白(YKL‑40)联合癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)三联检进行早期卵巢癌的筛查。通过上述方式，本发明能够提高预测早期卵巢癌的准确性。

Description

早期卵巢癌筛查方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤筛查技术领域，特别是涉及一种早期卵巢癌筛查方法及试剂盒。
背景技术
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其发病率列居女性各类妇科癌症的第三位，但死亡率居首位，对妇女生命健康造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育，组织解剖及内分泌功能较为复杂，目前其发病机制仍未研究清楚。又因卵巢癌临床早期无显著症状，多数患者发现时已为晚期，仅能接受保守治疗。有研究报道提示卵巢癌行剖腹探查术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30％，大多数已扩散到子宫双侧附件，大网膜及盆腔各器官，超过70％的患者就诊时已经是晚期，所以卵巢癌无论在诊断和治疗上确是一大难题，多年来专家们对卵巢恶性肿瘤的病理形态，临床发生发展规律及治疗方案进行了许多的探讨，到目前为止，就国内外临床资料统计显示：I期卵巢癌的5年生存率可达90％，而晚期患者仅为2.3-20％，由此可见，卵巢癌早期筛查与诊断对其预后有重要影响。由于其病因不清，难以预防，因此如何早期发现卵巢癌成为国内、外研究的热点。
目前，临床上采用的检测卵巢癌的方法主要有以下两种：一种是经***超声检查(TUV)，尽管其应用非常普遍，但是这种方法对检测肿块的良、恶性敏感性不高。此外，该方法对检查医师的经验及技术要求较高。另一种是常规的辅助诊断方法是检测血液肿瘤标志物：包括癌抗原125(CA125)、人附睾蛋白4(HE4)以及二者联合检测方法。CA125是较常用的肿瘤标志物，但CA125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。与CA125相比，HE4的敏感度较高、特异性也更强，但仍对卵巢癌早期辅助诊断意义不大，单一HE4对I期卵巢癌辅助诊断的敏感度仅45.9％。同时检测两种生物标志物，可以提高检测敏感度，但假阳性率较高，而且仍然不能做到早期辅助诊断。无论是CA125或HE4都无法准确地预测早期卵巢癌。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种早期卵巢癌筛查方法及试剂盒，能够提高预测早期卵巢癌的准确性。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)联合癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)在早期卵巢癌筛查中的用途。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种筛查早期卵巢癌的方法，所述方法包括：检测样品中YKL-40、CA125以及HE4的含量；
若CA125和HE4的含量分别在各自的临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的卵巢癌风险，若CA125和HE4的含量分别大于各自的临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的卵巢癌风险。
其中，所述样品为血液样品。
其中，所述临界值范围为正常人的含量范围。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)、癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)联合检测体外诊断试剂盒，所述体外诊断试剂盒包括：包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CA125第一抗体以及标记的抗HE4第一抗体；包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体，未标记的抗CA125第二抗体以及未标记的抗HE4第二抗体。
其中，所述标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CA125第一抗体以及标记的抗HE4第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。
其中，所述体外诊断试剂盒用于早期卵巢癌的筛查。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种用于早期卵巢癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，所述角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与CA125试剂盒、HE4试剂盒联合使用。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明采用角质素酶蛋白(YKL-40)联合癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)三联检进行早期卵巢癌的筛查。由于角质素酶蛋白(YKL-40)的灵敏度比癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)都高，通过这种方式，能够提高预测早期卵巢癌的准确性。
附图说明
图1是临床样品中CA125含量的实验数据分析示意图；
图2是临床样品中HE4含量的实验数据分析示意图；
图3是临床样品中YKL-40含量的实验数据分析示意图；
图4是临床样品的临床实验数据一示意图；
图5是临床样品的临床实验数据另一示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供角质素酶蛋白(YKL-40)联合癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)在早期卵巢癌筛查中的用途。
CA125是一种来自柱状上皮细胞的糖蛋白，1983年Bast等首先测定了血清CA125含量，之后研究人员分析了卵巢癌患者CA125的水平，确定了这一分子在辅助诊断卵巢癌方面的作用。CA125是目前筛查早期卵巢癌的主要血清标记物，已广泛应用临床辅助诊断、疗效观察和病情监测，但单独用于辅助诊断早期卵巢癌时，它的敏感度较低。在早期卵巢癌中仅有部分I期患者的血清中有CA125升高(>35U/ml)，并且生理情况(月经期或妊娠期)和一些良性疾病(子宫内膜异位，***等)以及肝硬化、心衰等疾病亦可导致CA125异常表达，这些都说明这一肿瘤标记物在卵巢癌早期辅助诊断中的检出率不高，敏感度与特异度不够。相比CA125，HE4是中国医师还不太熟悉的另一个卵巢癌肿瘤标志物。HE4编码基因最早是由Kichhoff等人于1991年从附睾上皮远端分离出来，位于染色体20q上，全长为12kb左右。1999年Schummer等人通过cDNA微阵列分析，发现HE4(又名WFDC2)mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中不表达。这一基因编码的蛋白质与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性，但未发现HE4具有蛋白酶抑制的作用。Hellstrom等将基因与蛋白质组技术相结合，筛选出HE4，并证明HE4是WFDC2基因的产物，由WAP类型的4个二硫键核心(WFDC)组成，且该基因可编码分泌蛋白，经证实为糖化蛋白质。这一研究组还通过比较卵巢癌患者及正常人血清中的HE4蛋白量，发现大多数卵巢癌患者血清中HE4蛋白有明显增加，而正常组织及良性疾病中含量却很低，因此提出HE4具有卵巢癌辅助诊断的价值，而且在早期诊断中优于CA125。由于这一新的血清标记物在良性肿瘤患者和正常人血清中含量极低，而在93％的卵巢浆液性癌及100％的卵巢子宫内膜样癌中呈阳性表达，因此HE4在鉴别卵巢肿瘤的良恶性质时明显优于CA125的43.3％(特异度为95％时)，HE4的灵敏度达到72.9％(特异度为95％时)。单一HE4对I期卵巢癌诊断的敏感度45.9％(特异度为95％时)，也明显优于单一CA125对I期15.1％(特异度为95％时)的灵敏度。
2007年美国布朗大学的研究人员报告说，HE4有助于早期辅助诊断卵巢癌，联合检测HE4和CA125的预测准确性高于单用任一标志物。Moore等人研究也表明CA125联合HE4的检测敏感性达76.4％、特异性95％，明显高于单项检测HE4或CA125的敏感度，在此基础上他们进一步研究CA125再联合其他标志物检测，其敏感性并无明显变化。之后，Montaqnana等人研究显示卵巢癌患者血清CA125和HE4水平明显高于正常人，以及卵巢良性肿块、***和子宫内膜肿瘤患者，而且血清HE4的敏感性和特异性高于CA125。更多的实验也证明了这两者联用，可以增加卵巢癌的诊断准确率，还可以将卵巢癌的高风险组和低风险组患者区分开来，但是两者联检还是无法准确地预测早期卵巢癌。
本申请的发明人研究发现角质素酶YKL-40是炎症因子，同时又是肿瘤标记物，从炎症到癌变的过程中，它在血液中的含量会随着病情的程度而增加。仅仅使用角质素酶作为标记物，它是不足以准确定位的，而且心血管疾病和糖尿病也会导致血液中角质素酶升高。但当它与其他癌症标记物一同检测时，就能更有效地帮助临床预警癌症，这是因为从炎症到癌症，它在血液中含量会显著增加。
为了准确定位卵巢癌，本申请的发明人提出一种三联检测法，就是在卵巢癌辅助诊断的标记物CA-125和HE4这二项(二联检测)基础上，再增加角质素酶的检测。
请参见图1至图3，检测临床110例病人血样，图1是检测病人血样中的CA125，横坐标表示卵巢癌的阶段，纵坐标表示CA125的含量，单位是U/ml，图2是检测病人血样中的HE4，横坐标表示卵巢癌的阶段，纵坐标表示HE4含量的负对数，图3是检测病人血样中的YKL-40，横坐标表示卵巢癌的阶段，纵坐标表示YKL-40的含量，单位是ng/ml。具体的临床数据请参见图4至图5。从图1中可以看出，从健康阶段(Healthy)到卵巢癌II期阶段，CA125的含量均比较低，直到卵巢癌III期阶段，CA125的含量才显著性升高；从图2中可以看出，健康阶段(Healthy)，HE4的含量很低，炎性或良性肿瘤阶段(Bengin)和卵巢癌I期阶段，HE4的含量与健康阶段相比，有所升高，但是炎性或良性肿瘤阶段(Bengin)和卵巢癌I期阶段，HE4的含量相当，根据HE4的含量，无法区分炎性或良性肿瘤阶段(Bengin)和卵巢癌I期阶段，在卵巢癌II期阶段，HE4的含量与炎性或良性肿瘤阶段(Bengin)和卵巢癌I期阶段相比才显著性升高；从图3中可以看出，在健康阶段(Healthy)和炎性或良性肿瘤阶段(Bengin)，YKL-40的含量基本相当，在卵巢癌I期阶段，YKL-40的含量与健康阶段(Healthy)和炎性或良性肿瘤阶段(Bengin)相比，已经显著性升高了。
因此，结合图1至图3，可以看到，YKL-40的灵敏度显然高于CA125和HE4。而且，在正常对照组中，有二例血样的CA-125与HE4都超出正常范围，但它们血样中的YKL-40都在正常范围，如果采用CA-125与HE4二联法定性为阳性的，经本申请YKL-40联合CA-125与HE4的三联检测可以定为阴性，经过确诊，这二例血样确实为阴性。因此，本申请YKL-40联合CA-125与HE4的三联检测法，确实优于原先的CA-125和HE4二联检测法。
本发明还提供一种筛查早期卵巢癌的方法，该方法包括：
A、检测样品中YKL-40、CA125以及HE4的含量；
B、若CA125和HE4的含量分别在各自的临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的卵巢癌风险或有其它炎症，若CA125和HE4的含量分别大于各自的临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在卵巢癌的风险小，需进一步核查其它指标。
其中，该样品为血液样品，例如：血清、血浆、全血等。
其中，临界值范围为正常人的含量范围。
在上述初期的实验数据中已经发现，加入YKL-40成为三联检测以后，有以下二项较为显著的优点：第一，当CA-125和HE4这二项指标还处于临界值范围时(BorderlineRisk，临界值范围的含量，还不足以定位为阳性时)，但是如果同时伴有YKL-40的显著增高，有助于定性为阳性。这样，使卵巢癌的早期辅助诊断阳性率，从原来CA-125和HE4二联法的40％，增加到目前的60％以上。在上述110例检测病例中，对于这一点得到了进一步的印证。第二，目前临床上使用的CA-125和HE4二联检测法的假阳性率还是比较高。而从本申请的实验数据中分析，当CA-125和HE4的二联检测出现异常增高时，而YKL-40并没有出现显著增高，癌症病变的几率就会减少很多。因此，加入YKL-40成为三联检测以后，可以帮助减低假阳性率。在这次110例病人血样检测中，也再次证实了这一优点的存在：在正常对照组中，有二例血样的CA-125与HE4都超出正常范围，但它们血样中的YKL-40都在正常范围，因此如用二联法定性为阳性的，经本申请的三联检测可以定性为阴性。因此，加入YKL-40的三联检测法，确实优于原先的CA-125和HE4二联检测法。
上述110例临床样本，其中正常人群样本22例，良性卵巢肿瘤病人样本10例，卵巢癌病人样本78例，其中卵巢癌病人样本中，I期病人样本18例，II期病人样本19例，III期病人样本22例，IV期病人样本19例。卵巢癌分期主要依据临床检验的结果而定的。在本发明实施方式中，卵巢癌的样本的分期是依据B超，CT扫描或MRI检查等临床影像诊断结果并结合脱落细胞学检查或细针穿刺吸取法检查的细胞学诊断结果进行分期的。正常人群(即健康人群)是没有妇科肿瘤的女性，良性肿瘤病人是指有***，非恶性肿瘤，I期病人是指病变局限于卵巢，包括病变局限于一侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤，无腹水和病变局限于双侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤，无腹水以及病变已穿出卵巢表面，或包膜破裂，或在腹水中或腹腔洗液中找到恶性细胞。II期病人是指病变累及一侧或双侧卵巢，伴盆腔转移，包括病变扩展或转移至子宫或输卵管和病变扩展至其他盆腔组织以及肿瘤穿出卵巢表面，或包膜破裂；或在腹水或腹腔洗液中找到恶性细胞。III期病人是指病变累及一侧或双侧卵巢，伴盆腔以外种植或腹膜后***转移：包括病变大体所见局限于盆腔，***阴性，但腹腔镜下腹腔腹膜面有种植瘤和腹腔腹膜种植瘤直径＜2cm，***阴性以及腹腔腹膜种植瘤直径≥2cm，或伴有腹膜后或腹股沟***转移，但没有转移到其它远处器官。IV期病人是指癌细胞向远处器官转移，如转移到肝脏等。
CA125、HE4和YKL-40的检测试剂由深圳海格德生物科技公司提供。在CA125的检测中，临界值(Cutoff)定为35，在22例正常人群样本中，有4例的样本超过临界值，在10例良性肿瘤病例中，有3例超过临界值，假阳性率为21.9％。在I期卵巢癌病人18例样本中只有4例超过临界值，检出率只有22.2％，在II期卵巢癌病人19例样本中只有6例超过临界值，检出率也只有31.58％，因此CA125辅助诊断早期卵巢癌的检测率低于35％，敏感性很低，特异性也低。在HE4的检测中，临界值(Cutoff)定为70，在22例正常人群样本中，有4例的样本超过临界值，在10例良性肿瘤例有3例超过临界值，假阳性率为21.88％。在I期卵巢癌病人18例样本中只有9例超过临界值，检出率只有50％，在II期卵巢癌病人19例样本中只有11例超过临界值，检出率也只有57.89％，因此HE4辅助诊断早期卵巢癌的检测率低于60％。在YKL-40的检测中，临界值(Cutoff)定为100，在22例正常人群样本中，有3例的样本超过临界值，在10例良性肿瘤例有1例超过临界值，假阳性率是12.5％。但是，结合CA125和HE4的水平，可以将YKL-40的假阳性排除。在I期卵巢癌病人18例样本中，16例样本超出临界值，检出率88.89％，只有2例低于临界值，漏检率只有11.1％，在II期卵巢癌病人19例样本中有17例超过临界值，检出率也只有89.47％，漏检率为10.53％。因此YKL-40诊断早期卵巢癌的检测率达到89％，即敏感性达到89％，特异性也高。对照YKL-40升高的病人，CA125和HE4水平都不高，可以认为病人有可能有其它炎症。在良性肿瘤病人中YKL-40的升高，但CA-125和HE4的水平不高，我们可以考虑病人有其它炎症。在晚期病人中有三例病人的YKL-40水平低于临界值，但CA125和HE4水平都很高，因此如果三个指标中有2个指标超出临界值很多，需要进一步排查。
目前在临床上，进行卵巢癌的确切诊断，仍然还是以病理学方法为主。而目前临床上使用的所有血样检测，包括本申请提供的三联检测法，都是对临床医生起到辅助性诊断作用，主要起到初期筛选性或预警性的作用。按照本申请的方法，检测结果为阳性的，不等于绝对的卵巢癌症阳性。但是血液检测为阳性的病例，与阴性病例比较，在卵巢癌的发病几率上说，要大出十倍乃至数十倍以上，足以让临床医生提高警觉，并给予病人进一步的必要检查。不少妇产科医生反映，目前各种费用昂贵的扫描(例如CT scan，MRI，或新型的超声波)，不可能大规模用于初期疾病筛选。因此对于不容易做出早期辅助诊断的卵巢癌，尤其需要有一项快速，简便，费用低，敏感度高，而结果相对可靠的初选辅助诊断方法。而本申请的的方法以及产品正好满足这样的一种临床需求。
本发明还提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)、癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)联合检测体外诊断试剂盒，该体外诊断试剂盒包括：
包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CA125第一抗体以及标记的抗HE4第一抗体；
包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体，未标记的抗CA125第二抗体以及未标记的抗HE4第二抗体。
很显然，上述三联检的体外诊断试剂是采用层析法原理的。通过上述三联检的体外诊断试剂，可以检测样本中的YKL-40、CA125以及HE4。
其中，该标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CA125第一抗体以及标记的抗HE4第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。当然，也可以采用胶体金进行标记。
其中，该体外诊断试剂盒用于早期卵巢癌的筛查。
量子点(Quantum Dots)是由半导体材料，如硒化镉CdSe，组成的纳米颗粒，当量子点被一种普通光激发之后，可以释放出比普通荧光素强达数十倍的荧光，且有激发光谱宽、发射光谱窄的特点。发射光谱还可根据半导体材料的不同与纳米颗粒大小的不同而进行变动调节，且发射光的稳定性高，不会被淬灭。正是由于量子点荧光的这些优点，用量子点纳米颗粒标记的抗体，可比普通荧光素标记的抗体发光强度提升数百倍，从而使试剂的信号敏感度达到与化学发光的水平相当。
该试剂盒的开发技术路线大致分为以下几步：
筛选或自行研发检测肿瘤标志物的单克隆抗体；
抗体和量子点纳米颗粒或荧光微球偶联条件的确定和优化；
免疫层析法检测肿瘤标志物的条件确定和优化；
检测肿瘤标志物试剂盒的性能技术参数的确定和优化；
检测试剂盒的中试和大量生产条件和工艺的确定和优化；
试剂盒配套的荧光检测仪器的研发生产。
试剂盒开发的工艺流程采用以下几个步骤：配制包被和标记用的工作液体、抗体和量子点纳米颗粒或荧光微球偶联、制备荧光垫、制备样品垫、包被抗体到NC膜、干燥、试剂条的组装等。
本发明还提供一种用于早期卵巢癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，该角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与CA125试剂盒、HE4试剂盒联合使用。
例如，用于早期卵巢癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)酶联(ELISA)试剂盒。
总结来说，本申请的方法以及产品具有以下明显的优点：
(1)通过检测YKL-40在血液中的含量，可以明确划分正常人、炎症病人、癌症病人，在癌症情况下，它的水平随着病情发展而递增。
(2)CA125、HE4和YKL-40联检，可以弥补HE4和CA125的不足，卵巢癌的早期辅助诊断的灵敏度和特异度明显提高。
(3)早期辅助诊断卵巢癌的价值远高于目前临床上常用的检测方法，具有广阔的应用前景，填此领域的空白。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种角质素酶蛋白(YKL-40)联合癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)在早期卵巢癌筛查中的用途。
2.一种筛查早期卵巢癌的方法，其特征在于，所述方法包括：
检测样品中YKL-40、CA125以及HE4的含量；
若CA125和HE4的含量分别在各自的临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的卵巢癌风险，
若CA125和HE4的含量分别大于各自的临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的卵巢癌风险。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为血液样品。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述临界值范围为正常人的含量范围。
5.一种角质素酶蛋白(YKL-40)、癌抗原125(CA125)以及人附睾蛋白4(HE4)联合检测体外诊断试剂盒，其特征在于，所述体外诊断试剂盒包括：
包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CA125第一抗体以及标记的抗HE4第一抗体；
包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体，未标记的抗CA125第二抗体以及未标记的抗HE4第二抗体。
6.根据权利要求5所述的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CA125第一抗体以及标记的抗HE4第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。
7.根据权利要求5所述的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述体外诊断试剂盒用于早期卵巢癌的筛查。
8.一种用于早期卵巢癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，其特征在于，所述角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与CA125试剂盒、HE4试剂盒联合使用。
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