CN107760660B - 一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用 - Google Patents

一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用，该突变体包括A146位点是一个全新的突变位点，包括A146在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。本发明突变体，具有显著抵抗被其内源性抑制剂（PAI‑1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。可以应用于制备治疗血栓性疾病的药物，包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、脑卒中、及静脉血栓等疾病。

Description

一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用。
背景技术
随着社会和经济的迅速发展，人民生活质量的日益提高。其中，高糖、高蛋白和高脂肪食物在人们日常营养摄入中所占比例越来越高，从而导致高血压、高血脂、冠心病、心肌梗塞、脑梗塞等疾病形成，对整个人类的健康造成了巨大威胁。目前，心血管疾病，已经成为威胁人类健康的第一大杀手，尤其是血栓栓塞性疾病。其主要包括三类：(1) 冠状动脉形成血栓，主要指急性心肌梗死 (AMI); (2) 脑血管形成血栓，即急性缺血性卒中；(3) 静脉形成血栓，例如急性肺栓塞。根据统计，在美国每年大约有900,000人患有AMI，其中死亡人数多达225，000人，由于发病到死亡的时间特别快，其中大约有125，000人在未得到及时治疗便已经死亡。在我国，据统计每年有300万人需要溶栓药物治疗。而且，大多数的急性心肌梗死是由冠状动脉的闭合栓塞引起血流不足及心肌死亡而导致的。溶栓治疗是血栓性疾病治疗的重要手段，溶栓药物是通过溶解血栓、增加心肌血流、改善供氧使梗死范围缩小、改善缺血区的脑神经细胞损伤，从而使的临床治疗得到很大幅度的提高。 国际多个大型临床实验证实，溶栓治疗可以降低AMI病死率30%以上。
组织型纤溶酶原激活剂 (tissue plasminogen activitor，tPA) 是血液中纤溶***的生理性激活剂。由于tPA与血栓基质纤维蛋白具有较强的特异性亲和力，能在血栓局部有效的激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。tPA与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身性纤维蛋白溶解、治疗高等优点。天然tPA由527个氨基酸组成，其中包含五个结构域分别是：1、指型区（F区，4-49位氨基酸）与纤维蛋白结合相关。2、表皮生长因子区（E区，50-86位氨基酸）与细胞膜受体结合有关。3、kringle 1(K1区, 87-175氨基酸)为肝脏受体结合部位。4、kringle 2(K2区, 176-261氨基酸)含有纤维蛋白结合位点。5、水解酶结构域区（SPD区，262-527氨基酸）催化纤溶酶原转化成纤溶酶，并且是PAI-1的结合位点。
组织型纤溶酶原激活剂 (tPA) 是美国FDA在1987年批准作为治疗急性心肌梗塞的第一个基因工程重组的溶栓药物。1990年美国FDA又批准其用于治疗急性肺栓塞。1999年美国FDA再次批准其用于治疗急性缺血性卒中。并且是急性缺血性卒中目前唯一的溶栓治疗药物。
但是，tPA在临床上的应用也表现出一定的局限性。其中主要是在病灶部位富集了大量的纤溶酶原激活剂抑制物 (PAI-1),从而导致治疗性药物tPA很容易被PAI-1不可逆性抑制，迅速使其失去活性。在临床上，为了保证治疗效果，通常采用给病人注入高达100mg/50kg剂量。高剂量的tPA不仅会引起致命的颅内出血风险，而且会导致神经毒性副作用，从而提高了病人的死亡率。另外，在形成血栓过程中，大量的血小板被包含在血栓中。在伴随着凝血酶的刺激下，血小板不断被激活，释放出大量的PAI-1，同时也会导致血液中tPA药物的效价大大降低。虽然目前开发了一款具有抵抗PAI-1能力的TNK-tPA突变体. 但是TNK-tPA突变体所包含的KHRR296-299突变为AAAA对PAI-1的抵抗能力还不够,并且没有表现出增强对纤溶酶原激活能力。因此，在临床上，仍然有巨大的需求去开发新的tPA类药物，可以用于治疗急性心肌梗塞、脑血栓、肺栓塞等疾病，在医学上进一步去提高其应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用，具有显著抵抗被其内源性抑制剂（PAI-1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
该突变点位于tPA的水解酶结构域A146（氨基酸命名方式为Chymotrypsinogennumbering）位点。 该tPA突变体包括A146在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。
以tPA的水解酶结构域为基础，将A146突变为Y为例子(即；tPA(A146Y))，其中氨基酸序列SEQ ID NO.1为：IKGGLF ADIAS HPWQA AIFAK HRRSP GERFL CGGIL ISSCW ILSAAHCFQE RFPPH HLTVI LGRTY RVVPG EEEQK FEVEK YIVHK EFDDD TYDND IALLQ LKSDS SRCAQESSVV RTVCLPPAD LQLPD WTECE LSGYG KHEYL SPFYS ERLKE AHVRL YPSSR CTSQH LLNRTVTD NMLCA GDTRS GGPQA NLHDA CQGDS GGPLV CLNDG RMTLV GIISW GLGCG QKDVP GVYTKVTNYL DWIRD NMRP。
获得的tPA(A146Y)突变体重组蛋白比野生型提高了75%的PAI-1抵抗能力、增强了5倍的纤溶酶原激活能力。
以上所述146位氨基酸为Ala可以被取代为包括Tyr在内及Gly、Val、Leu、Met、IIe、Ser、Thr、Pro、Asn、Gln、Phe、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu中的任何一种。在本发明实施例中已经证明将Ala146位氨基酸的替代为Tyr，不仅能够显著性提高抵抗PAI-1的能力，而且能够增强激活纤溶酶原的能力。
本发明的优点在于：
本发明一种组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的突变体，具有显著抵抗被其内源性抑制剂（PAI-1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。该突变体包括A146（氨基酸命名方式为Chymotrypsinogen numbering）位点是一个全新的突变位点，在此之前从未有人报道过。我们通过实施例实验证实，tPA(A146Y)突变体重组蛋白不仅具有显著性提高了75%的PAI-1抵抗能力，而且表现出一个新功能，即增强了5倍对纤溶酶原激活能力。该突变体可以应用于制备治疗血栓性疾病的药物，包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、脑卒中、及静脉血栓等疾病。
附图说明
图1：蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中M为marker，1为tPA蛋白，2为tPA(A146Y)突变体蛋白。
图2：化学发光底物法检测tPA (A146Y)突变体酶的活性。
图3：tPA (A146Y)突变体对纤溶酶原激活能力的评价。
图4：tPA (A146Y)突变体对PAI-1抵抗能力的检测。
图5：体外血栓溶解实验。A为在正常血液中，tPA (A146Y)具有显著性的更强更快的血栓溶解能力比tPA。B为在加入外源性活性PAI-1的情况下，tPA (A146Y)的血栓溶解能力完全不受影响，而tPA-SPD的活性且被完全抑制了。说明tPA(A146Y)突变体蛋白具有非常强的PAI-1抵抗能力去促进血栓的溶解。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的方法和其优点作进一步说明，但这些实施例并不构成对本发明权利要求范围的限制。在不脱离本发明主要特征的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
实施例1 tPA(A146Y)突变体的构建、表达和纯化
这里的tPA(A146Y)是以tPA的水解酶结构域(tPA-SPD)为基础进行A146Y突变，又简称为tPA(A146Y)，或tPA-SPD(A146Y)（氨基酸命名方式为Chymotrypsinogennumbering）：
(1)tPA-SPD-pPICZαA质粒的构建。
以人肝细胞cDNA为模板，用PCR方法扩增出tPA-SPD基因片段。用限制性内切酶XhoI 和SacI切割tPA-SPD片段，并且用相同的内切酶XhoI 和SacI切割pPICZαA质粒（pPICZαA质粒购自Invitrogen公司），用T4链接酶将tPA-SPD片段连接到pPICZαA质粒中。将酶连产物经过42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单菌落，进行基因测序，将含有正确tPA-SPD序列的DH5α菌种，进行扩大培养，采用ZDNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提tPA-SPD-pPICZαA质粒，以备下面实验使用。
(2)tPA(A146Y)-pPICZαA突变体质粒的构建与蛋白表达。
在此进行的PCR的模板是采用上述（1）所获得tPA-SPD-pPICZαA质粒。
引物设计:Sense:5＇－CAAGCATGAGTACTTGTCTCCTTTCTATTC -3＇；
Antisense: 5＇－GAATAGAAAGGAGACAAGTACTCATGCTTG -3＇。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 597653DEST_PATH_IMAGE002
加入1µL DpnI（Takara）至上述PCR产物中，37℃温育过夜。采用ZDNA胶回收试剂盒（OMEGA）对PCR产物进行胶回收。42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单克隆测序，将含有正确突变的菌种进行15%甘油菌保存于-80℃冰箱待用。
挑取上述保存的甘油菌在LB培养基中进行活化、扩大，采用ZDNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提tPA- A146Y-pPicZαA质粒。对抽提的质粒进行线性化。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
37℃，过夜。乙醇沉淀回收。
将回收得到的DNA片段电转毕赤酵母X-33菌株:1.5KV，0.6S。涂于YPD（含100 µg/ml Zeocin）平板，挑单菌落，小量表达进行验证。
将小量表达成功的毕赤酵母X-33接种于YPD（含100 µg/ml Zeocin）28℃培养1天，以1：10接种于BMGY培养基，28℃扩大培养1天，以1：4接种于BMMY培养基进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1%的甲醇。收菌，离心10000rpm，30min，然后将上清液用孔径0.45 μm的滤膜抽滤，得到抽滤液。将抽滤液流过已经用平衡液(20 mM Tris-HCl pH 7.4，500 mMNaCl)平衡好的Ni-NTA柱(GE公司，流速5ml/min, 柱体积25 ml)，此时抽滤液中带有6个His标签的tPA (A146Y)蛋白就会结合在Ni-NTA柱上。再用五个柱体积的平衡液(20 mM Tris-HCl pH 7.4，500 mM NaCl)对Ni-NTA柱继续冲洗去杂蛋白。最后，用洗脱液(20 mM Tris-HCl pH 7.4，500 mM NaCl，500 mM 咪唑)对蛋白进行洗脱，对收集的蛋白用透析液(20 mMTris-HCl pH 7.4，150 mM 的NaCl)进行透析两次，每次透析至少进行2个小时。透析后离心20分钟(20000rpm，Hitachi Koki CR22N 高速冷冻离心机，R20A2转头)去除沉淀。采用SDS-PAGE电泳对目的蛋白进行鉴定， tPA(A146Y)具有28KDa的分子量，见图1，测序得序列如SEQID NO.1所示。分析所得蛋白溶液用Millipore超滤管(10000Da)进行浓缩，然后分装，-80℃保存备用。
(3) 其余的基于tPA的突变体都是根据如上实例，在tPA(A146Y)的基础上，设计合适引物，在PCR过程中改变变性温度和退火时间，转化及表达、纯化过程如(2)进行。同时tPA蛋白经过上述相同的转化及表达、纯化的方法获得。
实施例2 tPA(A146Y) 突变体酶的活性检测
用已报道的显色法(chromogenic assay) [Gorlatova NV (2003). Mapping ofa conformational epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis. Implications for serpin function. J Biol Chem. ]进行酶活性测定。其反应原理如下，在200µL体积的反应体系中，加入一定浓度的tPA蛋白。然后加入发光底物S2288(Chromogenix)，tPA能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团- p-硝基苯胺(pNA)切下来，最后通过酶标仪检测405nm的吸光度值就可以测定tPA酶的活性。
具体测定过程：
(a) 材料
经上述实施例1获得的tPA，tPA(A146Y)，tPA底物S-2288。
Buffer：20mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，0.2% BSA. 0.22μm孔径滤膜过滤。
(b) 步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将tPA和tPA(A146Y)稀释至200nM，和配制320μM S-2288。根据需要加入到200μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
①180μl buffer+10μl tPA+10μl 320μM S-2288
②180μl buffer +10μl tPA(A146Y)+10μl 320μM S-2288
在最后加入发光底物S2288(Chromogenix)并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405nm处，30s/ read进行检测30min。每个测试至少重复3次。取平均值使用GraphPadPrism 5软件进行反应线性拟合，PBS作为空白对照。
结果见图2，结果显示，突变体tPA (A146Y) 和tPA对发光底物S2288的切割反应速度基本一致，说明突变体tPA (A146Y) 和tPA具有相同的酶活性，同时也说明A146Y的点突变，并没有影响tPA酶的活性。
实施例3 tPA(A146Y)对天然底物纤溶酶原激活能力的检测
用已报道的显色法(chromogenic assay) [Gorlatova NV (2003). Mapping ofa conformational epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis. Implications for serpin function. J Biol Chem. ]进行测定。其反应原理如下，在200µL体积的反应体系中，加入一定浓度的tPA和纤溶酶原（Plasminogen,简称PLG），tPA激活PLG生成纤溶酶（plasmin, 简称Pn），然后加入Pn特异性的发光底物S-2403，Pn能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团-p-硝基苯胺(pNA)切下来，而tPA不会酶切发光底物S2403。最后通过酶标仪检测405nm的吸光度值就可以测定tPA对PLG的激活能力。
具体测定过程：
(a) 材料
经上述实施例1获得的tPA，tPA (A146Y)，及PLG，Pn底物S-2403。
Buffer：20mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 0.2% BSA. 0.22μm孔径滤膜过滤。
(b) 步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将tPA-SPD和tPA-SPD(A146Y)稀释至200nM，配制1μM PLG，320μM S-2403。根据需要加入到200μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
①170μl buffer+10μl PLG+10μl tPA+10μl 320μM S-2403；
②170μl buffer+10μl PLG+10μl tPA(A146Y)+10μl 320μM S-2403；
在最后加入发光底物S2403(Chromogenix)并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405nm处，30s/ read进行检测30min。每个测试至少重复3次。使用GraphPad Prism 5软件进行数据处理，PBS作为空白对照。
结果见图3，结果显示，tPA(A146Y) 对PLG的激活能力提高了5倍，说明A146Y突变显著性增强了tPA对天然底物PLG激活能力。
实施例4 tPA(A146Y)对PAI-1抵抗能力的检测
用已报道的显色法(chromogenic assay) [Gorlatova NV (2003). Mapping ofa conformational epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis. Implications for serpin function. J Biol Chem. ]进行测定。其反应原理如下，在200µL体积的反应体系中，加入tPA与不同浓度的PAI-1反应10min，tPA会被PAI-1抑制，然后加入S-2288，未与PAI-1结合的tPA会酶切S-2288并释放发色基团- p-硝基苯胺(pNA)，最后通过酶标仪检测405nm的吸光度值就可以测定残留的tPA的酶活，来间接计算出tPA对PAI-1的抵抗能力。
具体测定过程：
(a) 材料
经上述实施例1获得的tPA，tPA(A146Y)，及PAI-1, tPA底物S-2444。
Buffer：20mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 0.2% BSA. 0.22μm孔径滤膜过滤。
(b) 步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将tPA和tPA(A146Y)稀释至200nM，和配制320μM S-2288。PAI-1分别采用8个浓度；40nM，80nM，120nM，160nM，200nM，4800nM，560nM，600nM。根据需要加入到200μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
①180μl buffer+10μl tPA+10μl 320μM S-2288；
②180μl buffer +10μl tPA(A146Y)+10μl 320μM S-2288；
③170μl buffer+10μl tPA+10μl PAI-1(40nM--600nM)+10μl 320μM S-2288；
④170μl buffer +10μl tPA(A146Y) +10μl PAI-1(40nM--600nM)+10μl 320μMS-2288；
其中将tPA或者tPA(A146Y)与PAI-1预先孵育10min，然后充分混匀且尽量避免产生气泡，最后加入发光底物S2288(Chromogenix)并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405nm处，30s/ read进行检测30min。每个测试至少重复3次。数据处理采用GraphPad Prism5软件。
结果见图4，结果显示，在tPA完全被PAI-1抑制时， tPA(A146Y)仍然具有75%的活性，说明A146Y突变显著性提高了tPA对PAI-1的抵抗能力。
实施例5tPA-SPD(A146Y)通过抵抗PAI-1的抑制提高血块的溶解
用已报道的血块溶解实验方法(clot lysis assay) [Peng SZ (2017). A long-acting PAI-1 inhibitor reduces thrombus formation. Thromb Haemost. ]进行血栓溶解能力检测。由于Ca2+的加入会激活血液凝血反应，形成血栓，从而提高了反应体系的浑浊度，在405nm的吸光度值具有最大的变化。其反应原理如下，在200µL体积的反应体系中，加入30%人源血清与一定浓度的tPA，再加入一定量的PAI-1反应10min，然后加入Ca2+。最后通过酶标仪检测405nm的吸光度值的变化来评价tPA的溶解血栓的能力。
具体测定过程：
(a) 材料
经上述实施例1获得的tPA，tPA(A146Y)，及PAI-1，CaCl2溶液。
人源血清（简称：PPP）获得通过3500rpm离心10min来自健康的自愿者的血液。
Buffer：20mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl. 0.22μm孔径滤膜过滤。
(b) 步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将tPA和tPA(A146Y)稀释至100nM，和配制100mM CaCl2溶液。PAI-1采用120nM的浓度。根据需要加入到100μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
①65μl buffer+30μl PPP +5μl 100mM CaCl2 ；
②55μl buffer+30μl PPP+10μl tPA+5μl 100mM CaCl2；
③55μl buffer+30μl PPP+10μl tPA(A146Y)+5μl 100mM CaCl2；
④45μl buffer+30μl PPP+10μl tPA+10μl PAI-1+5μl 100mM CaCl2；
⑤45μl buffer+30μl PPP+10μl tPA(A146Y)+10μl PAI-1+5μl 100mM CaCl2；
其中④⑤将tPA/tPA(A146Y)与PAI-1孵育10min，然后充分混匀且尽量避免产生气泡，最后加入Ca2+，充分混匀后，放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405nm处，30s/ read进行检测60min。每个测试至少重复3次，取平均值。数据处理采用GraphPad Prism 5软件。
结果见图5，结果显示，在图5A中没有加入外源性PAI-1的条件下，tPA(A146Y)比tPA明显具有更快更强的溶解血栓的能力。在图5B中加入外源性PAI-1的条件下，tPA(A146Y)溶解血栓的能力根本不受影响，而tPA却完全被抑制了，说明tPA(A146Y)具有显著性PAI-1抵抗能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys
20 25 30
Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys
35 40 45
Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg
50 55 60
Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu
65 70 75 80
Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp
85 90 95
Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu
100 105 110
Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu
115 120 125
Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Tyr
130 135 140
Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val
165 170 175
Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln
180 185 190
Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
195 200 205
Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly
210 215 220
Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
245 250

Claims (2)

1.一种组织型纤溶酶原激活剂突变体，其特征在于：所述突变体的突变位点位于tPA的水解酶结构域Ala146位点，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种组织型纤溶酶原激活剂突变体在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。
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