CN107760608B - 一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用，属于菌株诱变技术领域。本发明提供了一种高效生产低分子普鲁兰多糖的出芽短梗霉UVMU6‑1(Aureobasidium pullulans)，菌种保藏编号为CGMCC No.13178。本发明还提供了一种该出芽短梗霉在低分子量的普鲁兰多糖生产中的应用。本发明菌株的普鲁兰多糖生产能力高，能够有效提高普鲁兰多糖的产率，降低生产成本，利用该菌株发酵时具有较低的粘度，发酵液中产物浓度高，有效降低发酵成本，本发明提供的菌株生产的普鲁兰多糖的生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。

Description

一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用，属于菌株诱变技术领域。
背景技术
普鲁兰多糖(pullulan)，也叫短梗霉多糖、茁霉多糖、普聚多糖或茁霉糖，是以出芽短梗霉发酵所产生的胞外多糖，是无味无嗅的白色粉末。普鲁兰多糖化学组成主要是由α～1， 4～葡萄糖苷键连接的聚麦芽三糖，分子量4.8×104～2.2×106(商品普鲁兰多糖平均分子量2 ×105，大约由480个麦芽三糖组成)。生物法合成普鲁兰多糖的菌株主要为普鲁兰酵母(茁芽短梗霉，A.pullulans)，生产原料包括葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米以及其它相关生物质。我国在2006年批准普鲁兰多糖为食品添加剂新品种。在日本，普鲁兰多糖与淀粉一起被归类为无使用限制的添加剂。无论是急性、亚急性、慢性试验和变异源性试验都表明，普鲁兰多糖不引起任何生物学毒性和异常状态，在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染。上述优良特性使得普鲁兰多糖在化妆品、医药、食品、化工、环保、农药等领域具有广泛的用途。
尽管普鲁兰多糖的生产已经工业化，但是受生产厂家少等因素的制约，市售价格偏高(23 万/吨，进口价格30万/吨)，限制了普鲁兰多糖的应用。在生产工艺方面还有以下几个重要的提升空间，可有效缩减成本。其中主要原因是产品产量较低：由于产糖后培养液体粘稠、供氧困难，发酵时间延长后普鲁兰多糖被菌株降解等问题，目前生产普鲁兰多糖工艺的糖浓度大约为60g/L左右。山东福瑞达生物科技有限公司针对产量的提高做了大量工作，并把发酵产量提升到了118g/L(ZL201210443770.4)，产量的提升能够有效的压缩产品的发酵成本和分离成本。限制普鲁兰多糖产品发酵浓度的最大问题是发酵后多糖的粘稠度高，其根本原因是多糖的分子量相关的。不同分子量范围的普鲁兰多糖具有不同的粘稠度，因此获得低分子量、低粘稠度的普鲁兰多糖生产菌株，对于提高普鲁兰多糖的产量，降低普鲁兰多糖的生产成本具有重要的意义。经检索国内外没有经过诱变获得的高效生产低分子普鲁兰多糖的育种筛选方法和利用该方法生产低分子普鲁兰多糖的工艺。
发明内容
本发明针对现有普鲁兰多糖的生产行业中缺乏诱变获得的高效生产低分子普鲁兰多糖的育种筛选方法和利用该方法生产低分子普鲁兰多糖的工艺，本发明提供了一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用，具体涉及一种利用商品化菌株出芽短梗霉(A.pullulans CGMCC 3.933)经定向进化和诱变筛选获得的低分子量普鲁兰多糖的诱变菌株，出芽短梗霉 UVMU6-1(Aureobasidium pullulans)，菌种保藏编号为CGMCC No.13178以及利用该诱变菌株高效发酵生产普鲁兰多糖的方法。
一种高效生产低分子普鲁兰多糖的出芽短梗霉UVMU6-1(Aureobasidiumpullulans)，该菌株已经于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13178。
本发明所述的出芽短梗霉UVMU6-1(Aureobasidium pullulans)(菌种保藏编号为CGMCC No.13178)是由出芽短梗霉(A.pullulans)CGMCC 3.933经过诱变筛选获得的。
本发明出芽短梗霉UVMU6-1的诱变及筛选方法为：
将出芽短梗霉(A.pullulans)CGMCC 3.933的菌悬液在磁力搅拌下进行紫外线照射，然后将菌液加入到含有0.03～0.07％曲利苯蓝的YPD固体培养基中涂平板，置于30℃、恒温倒置培养2天后，挑选菌株，并进行复筛。
本发明出芽短梗霉(A.pullulans)CGMCC 3.933的菌悬液的菌体浓度为105CFU/mL～107 CFU/mL。
本发明所述在磁力搅拌下进行紫外线照射，是在照射前先打开紫外灯5min～20min，然后将含有菌悬液的培养皿置于磁力搅拌器上，在紫外灯功率10W～15W、照射距离30cm的条件下进行磁力搅拌和照射，5min时关闭紫外灯。
优选地，本发明所述YPD固体培养基，含有如下质量百分比的成分：0.8％～1.2％酵母膏， 1.5％～2.5％蛋白胨，1.5％～2.5％葡萄糖，若制固体培养基，加入1.5％～2.0％的琼脂粉。所述YPD 固体培养基灭菌条件为115℃灭菌25～35分钟。
本发明所述复筛，是取种子，接种到YPD培养基中，培养24～36小时，取上述种子接种到 50mL的YPD无糖培养基中，培养24小时添加5mL 70％的灭菌后的葡萄糖，培养48小时，再取5mL发酵液，煮沸5～10分钟，12000转/分钟离心10～20分钟，利用2倍体积的乙醇沉淀，4～10 摄氏度静置过夜，12000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥，测定多糖的产量。其中乙醇沉淀时沉到底部的为小分子普鲁兰多糖。
本发明涉及的诱变及筛选方法具体如下：
取10mL出芽短梗霉(A.pullulans)CGMCC 3.933的菌悬液(单位菌体浓度105～107CFU/mL)于直径9cm的培养皿中，磁力搅拌下进行紫外线照射。紫外灯功率10W～15W，照射距离30cm，照射前事先打开紫外灯5min～20min使其稳定，然后将含有菌悬液的培养皿置于磁力搅拌器上，搅拌并计时，在5min的时候将培养皿盖子盖上，关闭紫外灯，取100μL菌液加入到含有YPD(含有0.03～0.07％的曲利苯蓝)固体培养基中涂平板，置于30℃，恒温倒置培养2天后，以菌落颜色深浅、表面质地为筛选指标，筛选出颜色深，菌落表面湿润，菌落直径与厚度比值较高的菌株，并对其进行编号。再接入含有制霉素培养基上培养，进行下一步的复筛和遗传稳定性验证，并确定普鲁兰多糖的产量。
上述遗传稳定性检测的方法为：取筛选到的能够高效生产低分子普鲁兰多糖的菌株，接种到5ml的YPD培养基中，培养48小时后，取100μL接种到5ml新鲜的YPD培养基中，如此反复重复10次以上，后进行上述复筛验证，产量稳定的用于后期发酵试验。
本发明还提供了一种高效生产低分子普鲁兰多糖的出芽短梗霉UVMU6-1在普鲁兰多糖生产中的应用。
所述的应用，包括如下步骤：
步骤一：取出芽短梗霉UVMU6-1的种子接种到YPD培养基中培养，然后接种到YPD无糖培养基中，添加灭菌后的生物质糖，培养后获得培养种子；
步骤二：取步骤一获得的培养种子接种到发酵培养基中，调节pH值，并向培养基中持续补加空气和生物质糖，发酵结束后测定多糖的浓度。
优选地，本发明步骤一所述的YPD培养基，含有如下质量百分比的成分：0.8～1.2％酵母膏，1.5％～2.5％蛋白胨，1.5％～2.5％葡萄糖。
优选地，本发明步骤二所述的发酵培养基包含如下质量百分比的成分：2％～4％生物质糖，0.5％～1％酵母膏和1％～2％蛋白胨。
优选地，本发明步骤二所述的生物质糖，来源于淀粉、秸秆、麦秆、稻草、玉米或米糠。
优选地，本发明步骤二所述的生物质糖为葡萄糖、蔗糖或果糖。
优选地，步骤一和步骤二中所述的培养的条件为：发酵温度30℃，发酵pH值4，发酵罐转速400转/分钟，空气流量2L/分钟。
所述应用(发酵生产普鲁兰多糖)具体步骤如下：
取种子，接种到2～3mL的YPD培养基中，培养24～36小时；取上述种子接种到50mL的YPD 无糖培养基中，添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养36～48小时。取上述培养种子接种到含 2～4％葡萄糖，0.5～1％酵母膏和1～2％蛋白胨的发酵培养基中，利用盐酸和氨水调节pH值，400 转，pH 4.0，空气流量4L/min培养，并向培养基中持续补加葡萄糖。培养100小时后，测定多糖的浓度。
本发明有益效果：
1、本发明利用商品化的出芽短梗霉(A.pullulans)CGMCC 3.933进行诱变育种，并建立了高效生产低分子普鲁兰多糖菌株的筛选方法，和利用该方法筛选到的出芽短梗霉UVMU6-1 (菌种保藏编号CGMCC No.13178)，并发酵高效生产低分子普鲁兰多糖。
2、本发明的诱变菌株CGMCC No.13178与常规普鲁兰多糖生产菌相比，其普鲁兰多糖生产能力更为高，并由此有效提高普鲁兰多糖的产率，降低生产成本，并且发酵时具有较低的粘度，发酵液中产物浓度高。利用本发明方法生产普鲁兰多糖产量高，利用生物基葡萄糖进行发酵，获得的普鲁兰多糖的产量高达135g/L，利用生物基蔗糖进行发酵获得的普鲁兰多糖的产量达到127g/L。
3、本发明提供的菌株生产的普鲁兰多糖的生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。
附图说明
图1为普鲁兰酶解普鲁兰多糖的薄板层析图；
(1，酶解标准样品；2，标准样品；3，麦芽三糖；4，酶解产品；5，产品) 。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所涉及的培养基配方如下：
YPD培养基：含有如下质量百分比的成分：0.8％～1.2％酵母膏，1.5％～2.5％蛋白胨， 1.5％～2.5％葡萄糖。
发酵培养基:含有如下质量百分比的成分：2～4％葡萄糖，0.5～1％酵母膏和1～2％蛋白胨的发酵培养基中，利用盐酸和氨水调节pH值。
本发明按照如下最优配方举例说明进行以下实验，其他范围也都可以实现本发明的技术效果，具体配方如下：
YPD培养基：含有如下质量百分比的成分：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
发酵培养基:含有如下质量百分比的成分：3％葡萄糖，0.75％酵母膏和1.5％蛋白胨的发酵培养基中，利用盐酸和氨水调节pH值。
实施例一：高效生产低分子普鲁兰多糖菌株的诱变及筛选
取10ml出芽短梗霉(A.pullulans)CGMCC 3.933菌悬液(单位菌体浓度105～107CFU/mL) 于直径9cm的培养皿中，磁力搅拌下进行紫外线照射。紫外灯功率10W～15W，照射距离30cm，照射前事先打开紫外灯5min～20min使其稳定，然后将含有菌悬液的培养皿置于磁力搅拌器上，搅拌并计时，在5min的时候将培养皿盖子盖上，关闭紫外灯，取100μL菌液加入到含有 YPD(含有0.03～0.07％的曲利苯蓝)固体培养基中涂平板，置于30℃，恒温倒置培养2天后，以菌落颜色深浅、表面质地为筛选指标，筛选出颜色深，菌落表面湿润，菌落直径与厚度比值较高的菌株，并对其进行编号。再接入YPD培养基上培养，进行下一步的复筛和遗传稳定性验证，并确定普鲁兰多糖的产量。
上述复筛方法：取种子，接种到3ml的YPD培养基中，培养24～36小时；取上述种子接种到50ml的YPD无糖培养基中，培养24小时添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养48 小时，再取5mL发酵液，煮沸5～10分钟，12000转/分钟离心10～20分钟，利用2倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，12000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥，测定多糖的产量。其中乙醇沉淀时沉到底部的为小分子普鲁兰多糖。
上述遗传稳定性检测的方法：取筛选到的能够高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株，接种到5mL的YPD培养基中，培养48小时后，取100μL接种到5ml新鲜的YPD培养基中，如此反复重复10次以上，后进行上述复筛验证，产量稳定的用于后期发酵试验。
通过上述诱变和筛选方法获得的诱变菌株，经鉴定为出芽短梗霉UVMU6-1(Aureobasidium pullulans)，该菌株已经于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13178。
实施例二：低分子普鲁兰多糖的测定
发酵产物和普鲁兰多糖均按照1g/10mL的比例溶解到去离子水中，得到样品溶液和普鲁兰多糖标准溶液；麦芽三糖，葡萄糖，按照10mg/mL的比例溶解于去离子水；展层体系：乙腈和蒸馏水按照体积比正丁醇：乙酸：蒸馏水＝8:3:2的比例混合均匀，置于具塞玻璃瓶中备用。显色剂：浓硫酸和无水乙醇按照V浓硫酸：V无水乙醇＝1:6的比例混合均匀，装到喷壶中备用。
将普鲁兰多糖标准溶液、普鲁兰多糖水解液、样品溶液、样品酶解液分别稀释100倍，按照普鲁兰多糖标准溶液、普鲁兰多糖水解液、麦芽三糖、样品酶解液、样品溶液、葡萄糖的顺序在硅胶层析板上点样，在展层液中层析，待液体层析到硅胶板顶部后取出吹干，重复层析2-3次。将显色剂喷到层析后的硅胶板上，吹干后在酒精灯上加热显色，观察实验现象。分离获得样品同标准品一样，被水解为麦芽三糖，结果表明获得产品为普鲁兰多糖(图1)。
实施例三：利用生物基葡萄糖高效生产低分子普鲁兰多糖
基础培养基：1.0％(w/v)酵母粉，2.0％(w/v)蛋白胨，自然pH。普鲁兰摇瓶发酵培养基：上述培养基调节pH为4，并添加70％的葡萄糖10ml，8磅(115℃)灭菌30min。葡萄糖需单独灭菌。
上述培养基接种出芽短梗霉UVMU6-1，生长36小时后作为种子，接种到5L的发酵罐培养。5L发酵罐含有以下成分：4.0％(w/v)葡萄糖，1.0％(w/v)酵母粉，2.0％(w/v)蛋白胨，初始pH 4，8磅(115℃)灭菌30min。发酵温度30℃，发酵pH值4，发酵罐转速400转/分钟，空气流量2L/分钟。葡萄糖需单独灭菌，发酵过程中，向发酵罐中补加葡萄糖和氨水，发酵结束后，再取5ml发酵液，煮沸5～10分钟，12000转/分钟离心10～20分钟，利用2倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，12000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥，测定多糖的产量。普鲁兰多糖产量达到135g/L。原始菌株产量30g/L，较原始菌株提高了350％。
实施例四：利用生物基蔗糖高效生产低分子普鲁兰多糖
普鲁兰摇瓶发酵培养基：实施例三中基础培养基调节pH为4，并添加70％的蔗糖10ml， 8磅(115℃)灭菌30min。蔗糖需单独灭菌。上述培养基接种出芽短梗霉UVMU6-1，生长36小时后作为种子，接种到5L的发酵罐培养。5L发酵罐含有以下成分，4.0％(w/v)蔗糖，1.0％(w/v)酵母粉，2.0％(w/v)蛋白胨初始pH 4，8磅(115℃)灭菌30min。发酵温度30℃，发酵pH值4，发酵罐转速400转/分钟，空气流量2L/分钟。蔗糖需单独灭菌，发酵过程中，向发酵罐中补加蔗糖和氨水，发酵结束后，再取5ml发酵液，煮沸5～10分钟，12000转/分钟离心10～20分钟，利用2倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，12000转/分钟离心10～20 分钟后取沉淀干燥，测定多糖的产量。普鲁兰多糖产量达到127g/L。原始菌株产量30g/L，较原始菌株提高了323％。
实施例5普鲁兰多糖分子量的测定.
对实施例3和实施例4所获得普鲁兰多糖利用凝胶渗透色谱进行分子量测定，分子量小于20万道尔顿，因此本发明筛选获得的诱变菌株能够高效生产低分子普鲁兰多糖。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种高效生产低分子普鲁兰多糖的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)UVMU6-1，菌种保藏编号为CGMCC No.13178。
2.权利要求1所述的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)UVMU6-1在生产普鲁兰多糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取权利要求1所述出芽短梗霉UVMU6-1的种子接种到YPD培养基中培养，然后接种到YPD无糖培养基中，添加灭菌后的生物质糖，培养后获得培养种子；
步骤二：取步骤一获得的培养种子接种到发酵培养基中，调节pH值，并向培养基中持续补加空气和生物质糖，发酵结束后测定多糖的浓度。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤一所述的YPD培养基，含有如下质量百分比的成分：0.8％～1.2％酵母膏，1.5％～2.5％蛋白胨，1.5％～2.5％葡萄糖。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤二所述的发酵培养基包含如下质量百分比的成分：2％～4％生物质糖，0.5％～1％酵母膏和1％～2％蛋白胨。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤二所述的生物质糖，来源于淀粉、秸秆、麦秆、稻草、玉米或米糠。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤二所述生物质糖为葡萄糖或蔗糖。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤一和步骤二中所述的培养的条件为：发酵温度30℃，发酵pH值4，转速400转/分钟，空气流量2L/分钟。
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普鲁兰糖无色素高产菌株的选育研究进展;于林艳等;《中国生化药物杂志》;20151231(第6期);第181-184页 *
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