CN107754723A - 一种可用于高通量数字微滴pcr的氟碳表面活性剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可用于高通量数字微滴pcr的氟碳表面活性剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂及其制备方法和应用。所述表面活性剂通过式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电相互作用结合得到：其中，x为2~15，y为15~45，z为2~15，n为20~80，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:1~16。本发明提供的可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂通过式（I）和式（II）所示的阳离子部分和阴离子部分在水油两相界面静电相互作用结合得到，纯度高，且具有良好的生物兼容性和稳定性，可降低水油两相之间的界面张力，阻止液滴之间的融合，得到稳定的液滴。另外，本发明提供的该表面活性剂的制备方法可得到高纯度的氟碳表面活性剂，制备过程简单。

Description

一种可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于表面活性剂领域，具体涉及一种可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂及其制备方法和应用。
背景技术
在生物分析和应用中，所用的油性液体必须要同时满足几个基本的条件：生物无毒性、透气性好、疏水、疏脂。常用的此类液体一般是含有碳氟链的溶剂，碳氟溶剂本身的界面张力较水低很多。这给表面活性剂提出了更加严苛的要求。首先，表面活性剂必须能够稳定液滴；其次，表面活性剂必须是生物惰性，即表面活性剂能在水滴的内表面形成一个生物惰性的内表面，不会对水相中的生物成分造成伤害；最后，表面活性剂还必须是非离子型表面活性剂，否则会与DNA/RNA、蛋白或其他生物分子中的相反电荷发生静电作用。
氟碳表面活性剂是特种表面活性剂中非常重要的品种之一，在许多特殊的领域（比如，消防、皮革、电气工业），其中有很多碳氢表面活性剂不可替代的重要用途（比如：耐高温300 °C以上、抗静电作用等）。氟碳表面活性剂的独特性能常被概括为“三高”“两憎”，即高表面活性、高稳定性和高化学稳定性；含氟烃基既憎水又憎油。氟碳表面活性剂有很高的耐热性和很好的化学稳定性，它可以抵制强氧化剂、强酸和强碱的作用，而且在这些溶液中仍然能够保持良好的表面活性，因此可以用于一些极端条件下的溶液中。氟表面活性剂达到与碳氢表面活性剂同一表面张力的浓度仅是碳氢表面活性剂的0.01~0.1。氟碳表面活性剂现已在化工、机械、纺织、造纸、涂料、玻璃、陶瓷、家庭用品等许多行业广泛应用。
聚合酶链式反应（Polymer Chain Reaction，PCR）是一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的分子快速扩增的方法。微滴式PCR技术利用油包水结构作为PCR 反应的微反应器，进行PCR 扩增。微滴式PCR 最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行PCR扩增，每个液滴都作为其自身PCR 的“微反应器”，彼此之间不产生交叉污染。其关键技术是在PCR 反应前，将包括PCR 所有的反应成分的水溶液注入到高速旋转的油相表面，形成无数稳定的小水滴。表面活性剂对小水滴的稳定性起着决定性的作用。
目前，用于稳定微滴式PCR中的微液滴的氟碳表面活性剂主要是采用化学合成的方式来获得，主要类型包括全氟聚醚或聚醚嵌段非离子表面活性剂等。比如商业采购到的EA表面活性剂（Raindance，美国）， Pico-Surf™（Dolomite，英国）等，这些表面活性剂都可以用来产生具有很好的生物兼容性的液滴，并且这些液滴在PCR升温到95 °C时仍然具有良好的稳定性。但是，这些表面活性剂的商业化产品并不是纯的单一物质，而是以特定的浓度溶解在了碳氟油中，无法满足特殊条件下对纯物质和表面活性剂的浓度要求，尤其是PCR反应须避免杂质对反应的干扰。而纯的氟表面活性剂的合成过程比较繁琐，需要多步反应及严格的产物提纯阶段，严重阻碍了这类表面活性剂的广泛应用以及工业化。
因此，开发一种具有高纯度、良好的生物兼容性和稳定性的碳氟表面活性剂具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中碳氟表面活性剂纯度低的缺陷，提供一种可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂。本发明提供的氟碳表面活性剂纯度高，且具有良好的生物兼容性和稳定性，可降低水油两相之间的界面张力，阻止液滴之间的融合，得到稳定的液滴。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂，所述表面活性剂通过式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电相互作用得到：
其中，x为2~15，y为15~45，z为2~15，n为20~80，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:1~16。
本发明提供的式（I）所示的阳离子部分和式（II）所示的阴离子部分本身具有一定的表面活性，所以在油水两相共存时，两者的亲水亲油头基分别往两相中运动。当阴离子部分的负电荷在水油界面处碰到阳离子部分的正电荷时，正负电荷在两相界面处通过静电力发生相互作用，形成本发明所述的氟碳表面活性剂。本发明提供的氟碳表面活性剂纯度高，且具有良好的生物兼容性和稳定性，可降低水油两相之间的界面张力，阻止液滴之间的融合，得到稳定的液滴。
优选地，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:2~10。更为优选地，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:8。
优选地，所述x为2~12，y为20~40，z为2~10，n为25~65。更为优选地，所述x为2，y为35，z为4，n为45。
一种上述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分分别溶于水和碳氟油中得水相流体和油相流体，所述水相流体中阳离子部分的质量分数为0.5~4%，所述油相流体中阴离子部分的质量分数为1%~8%；
S2：分别将S1所得的水相流体和油相流体注入到微流控微液滴生成芯片中的对应的流道中；
S3：调节油相流体和水相流体的体积流速，混合即得所述氟碳表面活性剂。
传统的全氟聚醚类表面活性剂的合成过程一般是个两步反应，产率较低，且产物的纯度很难得到保证。此外，由于含氟聚醚在普通有机溶剂中的溶解度较低，且分子量大，活性基团羧基的空间位阻相对较大，在后与胺基的碳氢化合物反应时活性低。且合成过程中必须先何处酰氯后再进行第二步反应，而酰氯的稳定性低，影响下一步产物的纯度。本发明提供的制备方法可通过静电力结合使得阴阳离子部分相结合，得到高纯度的氟碳表面活性剂，制备过程简单。
优选地，所述水相流体中还含有生物试剂，所述水相流体中生物试剂的用量为 10~500 nM。
本发明使用的生物试剂为市场上可售的生物制剂。
优选地，所述生物试剂为蛋白质、hotstart master mix 配合物引物、探针、DNA模板或生物酶中的一种或数种。
市场可售的各类全氟溶剂均可作为碳氟油用于本发明中。
优选地，所述油相流体中碳氟油为FC-40、FC-43、FC-770、HFE-7500或HFE-7100中的一种或数种。
优选地，S2中采用压力注射的方式实现油相流体和水相流体的注入。
S3中油相流体和水相流体的体积流速为常规流速条件即可得到大小适宜的液滴。
优选地，S3中油相流体和水相流体的体积流速分别为100~1200 μL/min和50~800μL/min，所述油相流体和水相流体的体积流速比为1~5:1。更为优选地，所述油相流体和水相流体的体积流速分别为600 μL/min和300 μL/min。
上述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂在数字PCR中或高通量生物分析中的应用也在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂通过式（I）和式（II）所示的阳离子部分和阴离子部分在水油两相界面静电相互作用结合得到，纯度高，且具有良好的生物兼容性和稳定性，可降低水油两相之间的界面张力，阻止液滴之间的融合，得到稳定的液滴。另外，本发明提供的该表面活性剂的制备方法可得到高纯度的氟碳表面活性剂，制备过程简单。
附图说明
图1为实施例1提供的表面活性剂的微流控液滴生成过程示意图；
图2为实施例1提供的表面活性剂中阳离子部分与阴离子部分之间的静电相互作用过程示意图；
图3为本发明实施例1提供的表面活性剂与阳、阴离子部分的红外谱图；
图4为本发明实施例1提供的表面活性剂在不同阶段的液滴显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂
本实施例提供的表面活性剂由式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电相互作用结合得到：
其中，x，y，z，n分别是2、35、4、45，阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:8，由如下步骤制备得到：
（1）将式（I）所示阳离子部分按1%的质量分数溶解在去离子中，用作水相流体；将式（II）所示阴离子部分按8%的质量分数溶解在HFE-7500中，用作油相流体。
（2）用压力注射泵分别将水相流体和油相流体注入到微流控液滴生成芯片中的对应的流道中（如图1）。
（3）调节油、水两相的体积流速及流速比，得到大小均一，稳定的液滴，如图1。其中油、水两相的体积流速分别为600 μL/min，300 μL/min，流速比为2:1。
本实施例提供的表面活性剂中阳离子部分与阴离子部分之间的静电相互作用过程示意图如图2所示：式（I）所示的阳离子部分和式（II）所示的阴离子部分本身具有一定的表面活性，所以在油水两相共存时，两者的亲水亲油头基分别往两相中运动。当阴离子部分的负电荷在水油界面处碰到阳离子部分的正电荷时，正负电荷在两相界面处通过静电力发生相互作用，形成氟碳表面活性剂，并降低了两相之间的界面张力，阻止了液滴之间的融合，得到了稳定的液滴。
为了对比，我们也通过化学合成的方式合成了阴离子部分与阳离子部分共价结合的物质。图3为本发明提供的表面活性剂、阴离子部分及共价结合的表面活性剂的红外谱图，由图可知，原料阴离子部分的羧酸根COOH中C=O的峰位置在1773 cm-1处。通过共价结合的表面活性剂的酰胺键的C=O的峰位置在1684 cm-1处。而通过静电结合得到的表面活性剂的羧酸根C=O的峰位置偏移到了1715 cm-1处，伯胺的峰位置在1645 cm-1处，说明阳离子部分与阴离子部分通过静电相互作用形成了一种新的表面活性剂。
稳定性测试
本测试通过程序升温至一定温度，验证微流控所得液滴的热稳定性。程序升温过程可以为从室温直接升温至95 °C，也可以是从室温升到55 °C，在55 °C维持30 s后，后从55 °C升至72 °C，并维持 30 s，再升温至95 °C，并在95 °C下维持60 s，以上整个过程重复35次。
用显微镜观察刚收集到的液滴、没有任何处理的放置了11天的液滴以及经过程序升温后的液滴及其大小，判断其热稳定性。相关的显微镜结果图如图4。可知，放置11天以及经上述热循环处理后液滴与初始时的液滴基本无差异，即本实施例提供的表里面活性剂具有较好的热稳定性。
实施例2 可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂
本实施例提供的表面活性剂由式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电力结合得到：
其中，x，y，z，n分别是2、20、10、65，阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:1，由如下步骤制备得到：
（1）将式（I）所示阳离子部分按1.5%的质量分数溶解在去离子中，用作水相流体；将式（II）所示阴离子部分按1.5%的质量分数溶解在HFE-7500中，用作油相流体。
（2）用压力注射泵分别将将水相流体和油相流体注入到微流控液滴生成芯片中的对应的流道中。
（3）调节油、水两相的体积流速及流速比，得到大小均一，稳定的液滴。其中油、水两相的体积流速分别为600 μL/min，500 μL/min，流速比为1.2:1。
同理，阴阳离子部分在两相界面处通过静电力发生相互作用，形成氟碳表面活性剂，并降低了两相之间的界面张力，阻止了液滴之间的融合，得到了稳定的液滴。
实施例3可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂
本实施例提供的表面活性剂由式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电力结合得到：
其中，x，y，z，n分别是12、40、2、25，阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:16，由如下步骤制备得到：
（1）将式（I）所示阳离子部分按0.5%的质量分数溶解在去离子中，用作水相流体；将式（II）所示阴离子部分按8%的质量分数溶解在HFE-7500中，用作油相流体。
（2）用压力注射泵分别将将水相流体和油相流体注入到微流控液滴生成芯片中的对应的流道中。
（3）调节油、水两相的体积流速及流速比，得到大小均一，稳定的液滴。其中油、水两相的体积流速分别为800 μL/min，400 μL/min，流速比为2:1。
同理，阴阳离子部分在两相界面处通过静电力发生相互作用，形成氟碳表面活性剂，并降低了两相之间的界面张力，阻止了液滴之间的融合，得到了稳定的液滴。
实施例4可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂
本实施例提供的表面活性剂由式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电力结合得到：
其中，x，y，z，n分别是2、15、15、80，阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:2，由如下步骤制备得到：
（1）将式（I）所示阳离子部分和牛血清蛋白分别按4%和10 nM的质量分数溶解在去离子中，用作水相流体；将式（II）所示阴离子部分按8%的质量分数溶解在FC-40中，用作油相流体。
（2）用压力注射泵分别将将水相流体和油相流体注入到微流控液滴生成芯片中的对应的流道中。
（3）调节油、水两相的体积流速及流速比，得到大小均一，稳定的液滴。其中油、水两相的体积流速分别为1250 μL/min，250 μL/min，流速比为5:1。
同理，阴阳离子部分在两相界面处通过静电力发生相互作用，形成氟碳表面活性剂，并降低了两相之间的界面张力，阻止了液滴之间的融合，得到了稳定的液滴。
实施例5可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂
本实施例提供的表面活性剂由式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电力结合得到：
其中，x，y，z，n分别是15、45、2、20，阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:10，由如下步骤制备得到：
（1）将式（I）所示阳离子部分和ROX-标记的DNA分别按0.5%和500 nM的浓度溶解在去离子中，用作水相流体；将式（II）所示阴离子部分按5%的质量分数溶解在FC-43中，用作油相流体。
（2）用压力注射泵分别将将水相流体和油相流体注入到微流控液滴生成芯片中的对应的流道中。
（3）调节油、水两相的体积流速及流速比，得到大小均一，稳定的液滴。其中油、水两相的体积流速分别为120 μL/min，80 μL/min，流速比为3:2。
同理，阴阳离子部分在两相界面处通过静电力发生相互作用，形成氟碳表面活性剂，并降低了两相之间的界面张力，阻止了液滴之间的融合，得到了稳定的液滴。

Claims (10)

1.一种可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂，其特征在于，所述表面活性剂通过式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分在水油两相界面静电相互作用结合得到：
其中，x为2~15，y为15~45，z为2~15，n为20~80，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:1~16。
2.根据权利要求1所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂，其特征在于，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:2~10。
3.根据权利要求2所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂，其特征在于，所述阳离子部分和阴离子部分的质量比为1:8。
4.根据权利要求1所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂，其特征在于，所述x为2~12，y为20~40，z为2~10，n为25~65。
5.根据权利要求4所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂，其特征在于，所述x为2，y为35，z为4，n为45。
6.一种权利要求1~3任一所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：将式（Ⅰ）所示阳离子部分和式（Ⅱ）所示阴离子部分分别溶于水和碳氟油中得水相流体和油相流体，所述水相流体中阳离子部分的质量分数为0.5~4%，所述油相流体中阴离子部分的质量分数为1~8%；
S2：分别将S1所得的水相流体和油相流体注入到微流控微液滴生成芯片中的对应的流道中；
S3：调节油相流体和水相流体的体积流速，混合即得所述氟碳表面活性剂。
7.根据权利要求4所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述水相流体中还含有生物试剂，所述水相流体中生物试剂的用量为 10~500 nM。
8.根据权利要求4所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述油相流体中碳氟油为FC-40、FC-43、FC-770、HFE-7500或HFE-7100中的一种。
9.根据权利要求4所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂的制备方法，其特征在于，S3中油相流体和水相流体的体积流速分别为100~1200 μL/min和50~800 μL/min，所述油相流体和水相流体的体积流速比为1~5:1。
10.权利要求1~5任一所述可用于高通量数字微滴PCR的氟碳表面活性剂在数字PCR中或高通量生物分析中的应用。
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