CN107739749A - Dna探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法 - Google Patents

Dna探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DNA探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，包括：预处理、杂交、筛选，通过特定的正向引物与反向引物，经经聚合酶链式反应扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针，将待测试菌株的DNA与DNA探针进行杂交作用，通过显色测试杂交匹配结果筛选出产毒菌株。有益效果为：本发明方法可在8‑10小时内完成90个样品筛选，方法快速高效，特异性强，而且准确性高；本发明方法操作步骤简单，工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为生化试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，分析成本低廉，具有较高的市场前景与经济价值。

Description

DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，尤其是涉及一种DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法。
技术背景
麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish posoning，PSP）在已知赤潮毒素中毒性最强、分布最广、威胁性最大、引发毒害事件最频繁。其主要由石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）及其衍生物组成，属于胍胺类毒素，是典型的钠离子通道阻断剂。目前已发现的PSP同系物多达58种。其生物合成基因为sxt基因簇。STX在赤潮检测、分子生物学、神经生物学、医学诊断、药物开发、军事生化武器战剂等研究中均有重要应用。在医学诊断与药物开发方面，STX独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞Na+通道的重要工具药。其具有抗肿瘤、抗病毒、镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效。其局部麻醉效果比普鲁卡因或***强至少10万倍。
目前，PSP的获得主要通过甲藻的规模化培养及产物提取制备而来。该方法周期长、成本高；且需要特殊的藻培养设备。与甲藻相比，细菌具有基因组小、易培养、遗传操作简单等特性，因此，利用产毒菌株发酵与产物分离制备PSP贝毒，是一条行之有效的替代方法。其关键是产毒菌株的快速筛选。其可通过微生物发酵、代谢产物提取、产物化学分析来完成。但工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产麻痹性贝毒菌株的快速筛选技术。
发明内容
本方法的目的在于提供一种DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，所使用的探针具有与目标DNA特异性结合及杂交快速性，本发明的检测方法具有检测速度快、准确性高、灵敏度高的特性。
本发明方法中所用的亚硫酸杆菌（Sulfitobacter sp.）（CCTCC AB 2016296）、赫夫勒氏菌（Hoeflea sp.）（CCTCC AB 2016294）均购买自中国典型培养物保藏中心；本发明方法中所用的大肠杆菌（Escherichia coli）（ATCC 25922）、宋氏志贺氏菌（Shigellasonnet）（ATCC 29930）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 6538）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（ATCC 23857）、铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 27853）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）（ATCC BB120）、杀鲑弧菌 （Vibriosalmonicida）（ATCC 43839）、腔隙莫拉氏菌（Moraxella lacunata）（ATCC 17952）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）（ATCC 14029）此九种菌株均购买自美国模式培养物集存库(American type culture collection)。
为获得麻痹性贝毒产生细菌的特异性DNA探针，本发明用于扩增麻痹性贝类毒素的生物合成基因sxt基因的DNA探针的特异性引物为：正向引物17a，序列2：TAGTAGGAGTAGCACGCTGCA；反向引物17b，序列3：TCCTTCCTRGACCACGA。通过特定引物序列2和序列3所述的引物，经聚合酶链式反应（PCR）扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针，该DNA探针具有254个碱基，其序列为序列1：GATGTCTGGACTACGTCCCTCCTACTCGCGCTGTCGAACCTGAATATCGATCCGAGGACGCCGGCTGGGGCTTCGCCGACGCGGGCTCGGCGCGCATGGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTGAACGTCGGCAGGACCCTGCAGCACCAAGTCCAGCACCGCACGTTCGTGCAGCAGATCAGCGCCGTTTGAGGGCGAGTTCGCCTCGCATCGCGTCGTGGCAGACGGGATTAGGCAGATCTACAGAAGTC。
为建立基于上述DNA探针的菌落原位杂交方法，本发明采用以下技术方案：DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，包括：预处理、杂交、筛选，具体包括以下步骤：
预处理：制作10cm-12cm×10cm-12cm的硝酸纤维素膜，取待测试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.50-0.52MNaOH溶液8-10分钟，取出自然干燥后夹在两张干滤纸之间，放置于真空烤箱中，78-80℃烘2-2.5小时；在TE缓冲液中加入溶菌酶，放入DNA膜，在36-37℃温度下作用30-32分钟后用TE缓冲液漂洗；将DNA膜置于10-12mL杂交缓冲液中，40-42℃温育1.5-2.0小时；预处理可以固定待测试菌株的DNA，并且除去细菌细胞残留物，方便后续的杂交操作；
杂交：将以地高辛标记的DNA于沸水中煮10-15分钟变性，置冰浴中，取5.0-6.0mL标记DNA加入到2.5-3.0mL杂交缓冲液中，将膜由杂交缓冲液中取出置于塑料薄膜上，加入含地高辛标记DNA探针的杂交缓冲液中，40-42℃下作用2.0-2.5小时；将膜放至盛有2.0-3.0×SSC溶液的平皿内，洗涤2-3次，每次5-6分钟；
筛选：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1-2分钟，弃去洗涤液；加入20-22mL1.0-1.2%的封闭液，室温放置60-70分钟，弃去溶液；加入20-25mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-37℃温育30-35分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3-4次，每次40-50mL；在显色缓冲液中平衡2-3分钟后，倾倒显色缓冲液，将膜置于塑料袋内；加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，有斑点出现，即表示菌株产毒阳性；无斑点，即表示菌株产毒阴性；筛选方法迅速高效，特异性强，准确度高。
作为优选，所用的TE缓冲液的pH为8.0。
作为优选，所用的溶菌酶的用量为每毫升TE缓冲液加入4.8-5.2mg溶菌酶。
作为优选，所用的杂交缓冲液为：5×SSC溶液，50-52mM磷酸缓冲液，1.0-1.1mMEDTA，10-12%硫酸葡聚糖，48-50%去离子甲酰胺，pH7.0-7.1。
作为优选，所用的缓冲液为：0.10-0.11M顺丁烯二酸，0.14-0.15MNaCl，pH7.4-7.5。
作为优选，所用的封闭液为：0.10-0.11MTris-HCl，0.15-0.16MNaCl，0.10-0.11MMgCl2，pH7.9-8.0。
作为优选，所用的冲洗液为：0.10-0.11MTris-HCl，0.15-0.16MNaCl，pH7.4-7.5。
作为优选，所用的显色缓冲液为：0.10-0.11MTris，0.10-0.11MNaCl，50-52mMMgCl2，pH9.3-9.5。
作为优选，所用的显色液为：0.30-0.32mg/mLNBT，0.15-0.16mg/mLBCIP，pH9.0-9.1。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）通过菌落原位斑点分子杂交，DNA探针可特异性检测待测菌株DNA样品中有否有麻痹性贝毒合成sxtA基因核酸的存在，可在8-10小时内完成90个样品筛选，本发明方法快速高效，特异性强，而且准确性高；2）本发明方法操作步骤简单，工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为生化试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，分析成本低廉，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，本方法的敏感性检验包括以下步骤：
1）选择细菌赫夫勒氏菌（Hoeflea sp.）（CCTCC AB 2016294）为待测试样品，其代谢产物化学分析确认产PSP毒素；
2）挑取赫夫勒氏菌菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其DNA样品，将其稀释2-10倍；
3）取2μL稀释样品点于硝酸纤维素滤膜，浸于0.5MNaOH溶液10分钟后，自然干燥后夹在两张干滤纸之间，放置于真空烤箱中，80℃烘2小时，固定DNA；按5mg/mL的量将溶菌酶置于TE缓冲液中，放入DNA膜在37℃下作用30分钟后用TE缓冲液漂洗，除去细菌细胞残留物；
4）将DNA膜置于10mL杂交缓冲液中，42℃温育1.5小时；将地高辛标记的DNA于沸水中煮10分钟变性，置冰浴中，取5mL标记DNA加入2.5mL杂交缓冲液中，将膜由预杂交缓冲液中取出置于塑料薄膜上，加入含地高辛标记DNA探针的杂交缓冲液，42℃下作用2小时。将膜放至盛有2xSSC溶液的平皿内，洗涤2次，每次5分钟；
5）将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟，弃去洗涤液，加入20mL1%封闭液，室温放置60分钟，弃去，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液（使用封闭液进行5000倍稀释），37℃温育30分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3次，每次50mL。在显色缓冲液中平衡2分钟后，倾倒显色液。将膜置于塑料袋内。加入20mLBCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应。观察有无斑点出现。
测试结果显示所有DNA样品稀释液样品均呈杂交阳性；本发明方法具有较高的准确性与敏感性，可以作为麻痹性贝毒产生菌株的筛选。
实施例2：
DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，所用样品为：2株产毒菌：包括亚硫酸杆菌、赫夫勒氏菌；9株非产毒菌：包括大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、哈维氏弧菌、杀鲑弧菌、腔隙莫拉氏菌、类志贺邻单胞菌。本方法的特异性检验包括以下步骤：
取待测菌株的单菌落点于硝酸纤维素滤膜上，浸于0.5MNaOH溶液10分钟后，自然干燥后夹在两张干滤纸之间，放置于真空烤箱中，80℃烘2小时，固定DNA；按照5mg/mL的量将溶菌酶加入TE缓冲液中，放入DNA膜在37℃下作用30分钟，用TE缓冲液漂洗，除去细菌细胞残留物。
将上述制备好的DNA膜置于10mL杂交缓冲液（5×SSC溶液、50mM磷酸缓冲液、1mMEDTA、10%硫酸葡聚糖、50%去离子甲酰胺，pH7.0）中，42℃温育1.5小时。将地高辛标记的DNA于沸水中煮10分钟变性，置冰浴中，取5mL标记DNA加入2.5mL杂交缓冲液中，将膜由预杂交缓冲液中取出置于塑料薄膜上，加入含地高辛标记DNA探针的杂交缓冲液，42℃下作用2小时。将膜放至盛有2×SSC溶液的平皿内，洗涤2次．每次5分钟。
将膜放至盛有缓冲液（0.1M顺丁烯二酸、0.15MNaC1，pH7.5）的平皿中洗1分钟。弃去洗涤液，加入20mL1%封闭液（0.1MTris-HCl、0.15MNaCl、0.1MMgCl2，pH8.0)，室温放置60分钟。弃去，加入20mL碱性磷酸酶（AP）标记抗地高辛抗体溶液（使用封闭液进行5000倍稀释），37℃温育30分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液（0.1MTris-HCl、0.15MNaCl，pH7.5）洗涤3次，每次50mL。在显色缓冲液中（0.1MTris、0.1MNaCl、50mMMgCl，pH9.5）中平衡2分钟后，倾倒显色液。将膜置于塑料袋内，加入20mLBCIP/NBT显色液（0.3mg/mLNBT、0.16mg/mLBCIP，pH9.0）中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，观察有无斑点出现。特异性检验结果如表1所示：
表1.特异性检验
菌株 编号 杂交结果
亚硫酸杆菌（Sulfitobacter sp.） CCTCC AB 2016296 +
赫夫勒氏菌（Hoeflea sp.） CCTCC AB 2016294 +
大肠杆菌（Escherichia coli） ATCC 25922 -
宋氏志贺氏菌（Shigella sonnet） ATCC 29930 -
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 6538 -
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） ATCC 23857 -
铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） ATCC 27853 -
哈维氏弧菌（Vibrio harveyi） ATCC BB120 -
杀鲑弧菌 （Vibrio salmonicida） ATCC 43839 -
腔隙莫拉氏菌（Moraxella lacunata） ATCC 17952 -
类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides） ATCC 14029 -
由表1可以看出，包括亚硫酸杆菌、赫夫勒氏菌此2株产毒菌株均有斑点反应，其它9株菌株均无斑点出现，以上经斑点杂交检测显示为阳性的菌株，均通过其发酵代谢产物的化学分析，确认其产PSP毒素；而经斑点杂交检测为阴性的菌株，则其发酵代谢产物化学分析确认其不产PSP毒素，表明本方法的特异性强，检测结果准确、可靠。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于，所述的DNA探针为经地高辛标记含有254个碱基序列1所述的单链DNA探针，所述的序列1为：
GATGTCTGGACTACGTCCCTCCTACTCGCGCTGTCGAACCTGAATATCGATCCGAGGACGCCGGCTGGGGCTTCGCCGACGCGGGCTCGGCGCGCATGGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTGAACGTCGGCAGGACCCTGCAGCACCAAGTCCAGCACCGCACGTTCGTGCAGCAGATCAGCGCCGTTTGAGGGCGAGTTCGCCTCGCATCGCGTCGTGGCAGACGGGATTAGGCAGATCTACAGAAGTC。
2.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的DNA探针为通过特定的正向引物17a与反向引物17b，经聚合酶链式反应（PCR）扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针。
3.根据权利要求2所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的正向引物17a，序列为：TAGTAGGAGTAGCACGCTGCA；所述的反向引物17b，序列为：TCCTTCCTRGACCACGA。
4.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的方法包括：
1）预处理：制作并固定待测试菌株的DNA；
2）杂交：将待测试菌株的DNA与DNA探针进行杂交作用；
3）筛选：通过显色测试杂交匹配结果。
5.根据权利要求4所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的预处理步骤为：制作10cm-12cm×10cm-12cm的硝酸纤维素膜，取待测试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.50-0.52MNaOH溶液8-10分钟，取出自然干燥后夹在两张干滤纸之间，放置于真空烤箱中，78-80℃烘2-2.5小时；在TE缓冲液中加入溶菌酶，放入DNA膜，在36-37℃温度下作用30-32分钟后用TE缓冲液漂洗；将DNA膜置于10-12mL杂交缓冲液中，40-42℃温育1.5-2.0小时。
6.根据权利要求4所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的杂交步骤为：将以地高辛标记的DNA于沸水中煮10-15分钟变性，置冰浴中，取5.0-6.0mL标记DNA加入到2.5-3.0mL杂交缓冲液中，将膜由杂交缓冲液中取出置于塑料薄膜上，加入含地高辛标记DNA探针的杂交缓冲液中，40-42℃下作用2.0-2.5小时；将膜放至盛有2.0-3.0×SSC溶液的平皿内，洗涤2-3次，每次5-6分钟。
7.根据权利要求4所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的筛选步骤为：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1-2分钟，弃去洗涤液；加入20-22mL1.0-1.2%的封闭液，室温放置60-70分钟，弃去溶液；加入20-25mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-37℃温育30-35分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3-4次，每次40-50mL；在显色缓冲液中平衡2-3分钟后，倾倒显色缓冲液，将膜置于塑料袋内；加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，有斑点出现，即表示菌株产毒阳性；无斑点，即表示菌株产毒阴性。
8.根据权利要求5所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的预处理步骤中的溶菌酶的用量为每毫升TE缓冲液加入4.8-5.2mg溶菌酶；杂交缓冲液为：5×SSC溶液、50-52mM磷酸缓冲液、1.0-1.1mMEDTA、10-12%硫酸葡聚糖、48-50%去离子甲酰胺，pH7.0-7.1。
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