CN107739400A - 一种赖氨酸二肽的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种赖氨酸二肽的合成方法，属于化妆品及医药技术领域。该合成方法为：赖氨酸（Lys）用邻苯二甲酸酐保护制得双邻苯二甲酰基保护的赖氨酸，再与酰氯化试剂反应制成相应的酰氯产物，谷氨酸（Glu）或天门冬氨酸（Asp）与六甲基二硅氮烷反应得到谷氨酸或天门冬氨酸的硅烷保护物，然后与酰氯产物反应得到双邻苯二甲酰基保护的二肽，最后在特定条件下脱保护得到赖氨酰谷氨酸或赖氨酰天门冬氨酸二肽。本发明提供的合成方法没有使用缩合剂，原料廉价易得，副产物少，容易得到高纯度的二肽，具有很高的收率，减少了成本，适合批量化生产。

Description

一种赖氨酸二肽的合成方法

技术领域

本发明涉及化妆品及医药技术领域，具体涉及一种赖氨酸二肽的合成方法，尤其涉及一种赖氨酰谷氨酸二肽或赖氨酰天门冬氨酸二肽的合成方法。

背景技术

2000年Khavinson等发现Lys-Glu二肽(Vilon)能抑制小鼠自发性肿瘤的生长并且延长小鼠的寿命。随后又报道，它对CBA小鼠的体重、食物消耗及动情周期无明显影响，但能减少自发性肺腺瘤发生率。它的长期使用是安全的，并不会在动物生长过程中引起不良影响，可作为老年病症的预防。Vilon在衰老过程中还能对消化酶的活性产生积极作用。对膀胱粘膜中肿瘤的早期发作也具有抑制作用，且在一定程度上能保护小鼠胸腺和脾。目前发现其能活化衰老细胞染色体的染色质, 能调节核糖体的形成、装配。Vilon还能在下丘脑细胞中调节白介素 2(IL-2)基因的表达。近年来对Lys-Glu二肽的研究均表明它有助于衰老问题的研究。

文献报道赖氨酰谷氨酸二肽合成的方法（赖氨酰谷氨酸二肽的抗肿瘤活性研究，Chinese Pharmacological Bulletin 2007 Feb；23(2):233～6），是将Lys的α-氨基以及ε-氨基均用叔丁氧羰基（Boc）保护，羧基用N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu）活化与Glu接肽，脱保护HPLC纯化得到Lys-Glu，此方法用到了多种保护基，并且后处理通过非常规方法得到产品，制备成本高，限制了其批量化生产。

赖氨酰谷氨酸二肽合成的方法（N-Trifluoroacyl Lysine Derivatives in theSynthesisof L-Lysyl-L-glutamic Acid，Russian Journal of Organic Chemistry2007, Vol. 43, No. 10, pp. 1427 – 1431），是将Lys的α-氨基以及ε-氨基用三氟乙酰基（TFA）保护，制备酰氯与谷氨酸二甲酯反应，脱保护得到Lys-Glu，此方法Lys用三氟乙酰基保护，容易出现单保护以及双保护的混合物，而且所用三氟乙酸酐或三氟乙酸乙酯价格较高，这种方法制备出来的赖氨酰谷氨酸副产物多，总收率为：26.4%，制备成本高，提纯困难。因此本发明具有降低Lys-Glu或Lys-Asp的成本以及适合批量化生产的优异性，具有重要推广意义。

其中，赖氨酸具有两个氨基，谷氨酸具有两个羧基。因此，对应赖氨酰谷氨酸二肽及其类似物合成存在以下两个难题；第一两个氨基与两个羧基的活性不一致，容易出现保护不完全的产物，如单保护与双保护的混合物；第二由于氨基与羧基较多，容易出现分子内羧基与氨基成环，如通常羧基采用酯化进行保护，而成二肽后谷氨酸上的羧基在脱保护时易与α氨基分子内成环，尤其是在碱性条件下；或者非目标产物的氨基与羧基成肽。总之，对于赖氨酰谷氨酸二肽及其类似物的合成，由于氨基酸特殊的结构导致副反应较多，反应产物难于分离与纯化，一般需要结合多种方式进行纯化，如先采用溶剂法分离出产品，再使用活性炭进行多次脱色纯化，导致最后的收率非常低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简单、副产物少和产物易分离的赖氨酸二肽的合成方法。所述技术方案如下：

本发明公开了一种赖氨酸二肽的合成方法，该方法包括：赖氨酸用邻苯二甲酸酐保护得到双邻苯二甲酰基保护的赖氨酸（中间体A），再与酰氯化试剂反应制成相应的酰氯产物（中间体B），谷氨酸或天门冬氨酸与六甲基二硅氮烷反应得到硅烷保护的谷氨酸或天门冬氨酸（中间体C），然后与中间体B反应得到双邻苯二甲酰基保护的二肽（中间体D），最后脱保护得到赖氨酰谷氨酸或赖氨酰天门冬氨酸二肽（产物E）。其反应方程式如下式：

上式中，其中n=1时，反应原料为天门冬氨酸，合成的二肽为赖氨酰天门冬氨酸（Lys-Asp）；n=2时，反应原料为谷氨酸，合成的二肽为赖氨酰谷氨酸（Lys-Glu）。

本发明实施例提供的赖氨酸二肽的合成方法包括以下步骤：

(1)赖氨酸与邻苯二甲酸酐在非极性溶剂1中，在缚酸剂作用下于回流条件下分水反应，待分出全部水后降温析晶得中间体A，邻苯二甲酸酐与赖氨酸的摩尔比为2.0-3.0:1，缚酸剂用量为赖氨酸质量的1-5%，中间体A的结构式为：

。

(2)中间体A在非极性溶剂2中，于20-80℃下与酰氯化试剂反应得到中间体B，中间体B的结构式为：

。

(3)谷氨酸或天门冬氨酸在非极性溶剂2中，于40-130℃在催化剂的作用下与六甲基二硅氮烷反应得到中间体C，六甲基二硅氮烷与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为1.5-2.5:1，中间体C的结构式为：

；

其中，n=1时，中间体C为天门冬氨酸的硅烷保护物；n=2时，中间体C为谷氨酸的硅烷保护物。

(4)中间体B与中间体C在非极性溶剂2中，于0-40℃反应，反应完成后经后处理后得中间体D，中间体B与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为1.0-1.5:1，水与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为3.0-5.0:1，中间体D的结构式为：

。

(5)中间体D在极性溶剂中与水合肼于60-100℃反应，反应完成后降温至20-40℃并用盐酸调pH至4.1-4.8，过滤，滤液浓缩至油状物，用醇析晶得到产物E，水合肼与中间体D的摩尔比为2.0-4.0:1，产物E的结构式为：

其中n=1时，为赖氨酰天门冬氨酸；n=2时，为赖氨酰谷氨酸。在该过程中，在特定的酸性条件下不但避免了成环，而且副产物（邻苯二甲酰肼）在该pH条件下溶解度非常小，副产物非常容易分离，析晶后采用简单的分离方法（如溶剂纯化法）即可得到高纯度的产品。

其中，步骤(1)包括：

赖氨酸与邻苯二甲酸酐在2-10倍体积的非极性溶剂1中，在缚酸剂的作用下回流分水反应，反应至没有水产生后，降温至0-30℃析晶，过滤、干燥得到中间体A。其中，邻苯二甲酸酐与赖氨酸的摩尔比为2.0-3.0:1.0，缚酸剂选自三甲胺、三乙胺或N、N-二异丙基乙胺等有机碱，缚酸剂用量为赖氨酸质量的1%-5%。

其中，步骤(2)为常规的氯化方法，为本领域的技术人员所熟知，故省略详细描述。分离得到的中间体B加入非极性溶剂2中制成溶剂备用。

其中，步骤(3)包括：

将谷氨酸或天门冬氨酸加入2-8倍体积的非极性溶剂2中，加入催化剂，升温至60-120℃后滴加六甲基二硅氮烷，滴加完毕后保温反应1小时以上，反应完成后降温至0-40℃得到中间体C溶液备用。其中，六甲基二硅氮烷与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为1.5-2.5:1，催化剂选自浓硫酸（70wt%以上）、对甲苯磺酸或硫酸氢铵等，催化剂的用量为谷氨酸或天门冬氨酸质量的0.1%-1.0%。在该步骤中，可以采用六甲基二硅氮烷将谷氨酸或天门冬氨酸上的两个羧基完全保护得到双保护物，该双保护物中与氨解保护后得到的亚氨基还保持非常高的活性，且为了保证保护物的溶解度以使后续反应更容易进行，中间体C无需从反应液中分离，过量的六甲基二硅氮烷在后续步骤采用特殊的条件进行分离。在本步骤中，如果反应温度过低，反应不能完全进行；而温度过高则容易分子内成环，导致副反应较多。

其中，步骤(4)包括：

于0-40℃在步骤(3)得到的中间体C中滴加步骤(2)得到的中间体B，保温反应2小时以上，反应完成后加水淬灭，过滤得到中间体D。其中，中间体B与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为1.0-1.5:1，水与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为3.0-5.0:1。

其中，步骤(5)包括：

将中间体D加入1-8倍体积的极性溶剂中，再加入水合肼，于60-100℃反应2小时以上，反应结束后降温至20-40℃并用盐酸调pH至4.1-4.8，过滤，滤液浓缩至油状物，滴加油状物1-9倍体积的醇进行析晶。其中，醇选自甲醇、乙醇、异丙醇等中的一种或者多种，过滤得到产物E的粗品，水合肼与中间体D的摩尔比为2.0-4.0:1。粗品通过重结晶法等简单的纯化方法即可得到纯度大于99%的产品。

其中，步骤(5)中使用的极性溶剂选自水、甲醇、乙醇等中的一种或者多种构成的混合溶剂。

其中，步骤(1)中使用的非极性溶剂1选自甲苯（在回流条件下只有少数几种分水溶剂才行）等。

其中，步骤(2)、(3)和(4)中使用的非极性溶剂2选自二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯等，该三个步骤中使用的溶剂可以相同或者不同，为了便于操作优选为相同。

本发明提供的合成方法没有使用缩合剂，原料廉价易得，副产物少，收率高（总收率在68%-75%）容易得到高纯度（纯度大于99%）的二肽，减少了成本，适合批量化生产。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限于以下所述内容。

实施例1：赖氨酰天门冬氨酸合成

1、合成苯酐赖氨酸：

在500mL三口瓶中加入50g（0.34mol）赖氨酸、101.3g（0.68mol）邻苯二甲酸酐、5g三乙胺以及350mL甲苯升温至回流反应，反应过程中分出水，反应至没有水滴下，降温至20℃，保温2小时，抽滤，滤饼烘干得135.1g二苯酐赖氨酸，HPLC纯度98.5%，收率97.2%。

2、合成酰氯：

在500mL反应瓶中加入135.0g（0.33mol）二苯酐赖氨酸、300mL氯仿，升温至60℃，滴加43.5g（0.37mol）二氯亚砜，滴加完毕后保温反应3小时，减压浓缩至干，加入270mL氯仿溶解备用。

3、天门冬氨酸硅烷保护：

在500mL反应瓶中加入41.2g（0.31mol）天门冬氨酸，100mL氯仿，0.2g浓硫酸，升温至回流，滴加85.1g（0.53mol）六甲基二硅氮烷，滴加完毕后升温至100℃，反应4小时，降温至20℃备用。

4、苯酐赖氨酰天门冬氨酸的制备：

将步骤3中制备好的天门冬氨酸硅烷保护液，降温至0-10℃滴加步骤2中制备好的酰氯，滴加完毕后保温反应4小时，滴加17.0g（0.94mol）水淬灭反应，抽滤，固体干燥得到二苯酐赖氨酰天门冬氨酸：148.7g，HPLC纯度为：96.3%，收率：92.1%。

5、赖氨酰天门冬氨酸的制备：

在500mL反应瓶中加入145g（0.28mol）二苯酐赖氨酰天门冬氨酸、200mL水、44g（0.69mol）80%水合肼，升温至80℃保温反应4小时，降温至35℃，用浓盐酸调pH至4.1-4.8，抽滤，母液浓缩至油状物，随后滴加500mL甲醇析晶，抽滤，固体干燥得到66.2g赖氨酰天门冬氨酸粗品，HPLC纯度：95.3%，经过一次精制得到55.8g赖氨酰天门冬氨酸，HPLC纯度：99.4%，收率：76.2%。

实施例2：赖氨酰谷氨酸合成

1、合成苯酐赖氨酸：

在500mL三口瓶中加入50g（0.34mol）赖氨酸、110.6g（0.75mol）邻苯二甲酸酐、10gN、N-二异丙基乙胺以及400mL甲苯升温至回流反应，反应过程中分出水，反应至没有水滴下，降温至10℃，保温3小时，抽滤，滤饼烘干得135.4g二苯酐赖氨酸，HPLC纯度98.0%，收率97.3%。

2、合成酰氯：

在1000mL反应瓶中加入135.0g（0.33mol）二苯酐赖氨酸、400mL甲苯，升温至70℃，滴加47.6g（0.40mol）二氯亚砜，滴加完毕后保温反应3小时，减压浓缩至干，加入300mL甲苯溶解备用。

3、谷氨酸硅烷保护：

在500mL反应瓶中加入45g（0.31mol）谷氨酸，150mL甲苯，0.45g硫酸氢铵，升温至90℃，滴加六甲基二硅氮烷，滴加完毕后反应5小时，降温至30℃备用

4、苯酐赖氨酰谷氨酸的制备：

步骤3中制备的谷氨酸硅烷保护液，25-35℃滴加步骤2中制备好的酰氯，保温反应2小时，滴加22g（1.22mol）水淬灭反应，滴加完毕后抽滤，固体干燥得到150.3g二苯酐赖氨酰谷氨酸，HPLC纯度：95.6%，收率：90.5%。

5、赖氨酰谷氨酸的制备：

在反应瓶中加入150.0g（0.28）二苯酐赖氨酰谷氨酸、300mL甲醇、50g（0.8mol）80%水合肼，升温至65℃，保温反应6小时，降温至30℃，用浓盐酸调pH至4.1-4.8，抽滤，母液浓缩至油状物，滴加400mL乙醇析晶，抽滤，固体干燥得到70.2g赖氨酰谷氨酸粗品，HPLC纯度：94.9%，经过一次精制得到59.4g，HPLC纯度：99.3%，收率：77.0%。

如上所述，以上描述仅在于展示本发明的多个实施例，显而易见，本领域的技术人员在不违背本发明的前提下，可进行部分修改和变更，上文的描述提及的内容仅作为说明性的例证，并非作为对本发明的限制；具有本文所述技术特征的合成方法均落入本专利保护范围。

Claims (8)

1.一种赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)赖氨酸与邻苯二甲酸酐在非极性溶剂1中，在缚酸剂作用下于回流条件下分水反应，待分出全部水后降温析晶得中间体A，中间体A的结构式为：

(2)中间体A在非极性溶剂2中，于20-80℃下与酰氯化试剂反应得到中间体B，中间体B的结构式为：

(3)谷氨酸或天门冬氨酸在非极性溶剂2中，于40-130℃在催化剂的作用下与六甲基二硅氮烷反应得到中间体C，中间体C的结构式为：

其中n=1时，为天门冬氨酸的硅烷保护物，n=2时，为谷氨酸的硅烷保护物；

(4)中间体B与中间体C在非极性溶剂2中，于0-40℃反应，后处理后得中间体D，中间体D的结构式为：

(5)中间体D在极性溶剂中与水合肼于60-100℃反应，反应完成后降温至20-40℃并用盐酸调pH至4.1-4.8，过滤，滤液浓缩至油状物，分离纯化得到产物E，产物E的结构式为：

其中n=1时，为赖氨酰天门冬氨酸，n=2时，为赖氨酰谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

赖氨酸与邻苯二甲酸酐在非极性溶剂1中，在缚酸剂的作用下回流分水反应，反应至没有水产生后，降温至0-30℃析晶，过滤、干燥得到中间体A；所述邻苯二甲酸酐与赖氨酸的摩尔比为2.0-3.0:1，所述缚酸剂选自三甲胺、三乙胺或N、N-二异丙基乙胺，所述缚酸剂用量为赖氨酸质量的1%-5%。

3.根据权利要求2所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：

将谷氨酸或天门冬氨酸加入非极性溶剂2中，加入催化剂，升温至60-120℃后滴加六甲基二硅氮烷，滴加完毕后保温反应1小时以上，反应完成后降温至0-40℃得到中间体C备用，所述六甲基二硅氮烷与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为1.5-2.5:1，所述催化剂选自浓硫酸、对甲苯磺酸或硫酸氢铵，所述催化剂的用量为谷氨酸或天门冬氨酸质量的0.1%-1.0%。

4.根据权利要求3所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述步骤(4)包括：

于0-40℃在步骤(3)得到的中间体C中滴加步骤(2)得到的中间体B，保温反应2小时以上，反应结束后加水淬灭，过滤得到中间体D，所述中间体B与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为1.0-1.5:1，所述水与谷氨酸或天门冬氨酸的摩尔比为3.0-5.0:1。

5.根据权利要求4所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述步骤(5)包括：

将中间体D和水合肼加入极性溶剂中，于60-100℃反应2小时以上，反应完成后降温至20-40℃用盐酸调pH至4.1-4.8，过滤，滤液浓缩至油状物，滴加醇进行析晶，所述醇选自甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或者多种，过滤得到产物E的粗品，所述水合肼与中间体D的摩尔比为2.0-4.0:1。

6.根据权利要求5所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述极性溶剂选自水、甲醇、乙醇中的一种或者多种。

7.根据权利要求1所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述非极性溶剂1选自甲苯。

8.根据权利要求1所述的赖氨酸二肽的合成方法，其特征在于，所述非极性溶剂2选自二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯。