CN107739308B - 一种从微生物发酵液或酶转化液中同时提取α-酮戊二酸和丙酮酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从微生物发酵液或酶转化液中同时提取α‑酮戊二酸和丙酮酸的方法，属于生物分离提取技术领域。本发明将含α‑酮戊二酸和丙酮酸的微生物发酵液或酶转化液经离心去除菌体和其他可见固型物、超滤去除大分子杂质、酸化后脱色去除金属离子，用混合有机溶剂梯度洗脱分离α‑酮戊二酸和丙酮酸，将分阶段收集得到的洗脱液含有α‑酮戊二酸的合并在一起旋转蒸发，得到α‑酮戊二酸放入烘箱烘干粉碎获得合格的α‑酮戊二酸产品。将分阶段收集得到的洗脱液含有丙酮酸的合并在一起旋转蒸发，获得合格的丙酮酸产品。本发明具有工艺操作简单高效、费用低、产品纯度高等优点，适合于α‑酮戊二酸和丙酮酸的共提取工业。
Description
技术领域
本发明涉及一种从微生物发酵液或酶转化液中同时提取α-酮戊二酸和丙酮酸的方法，属于生物分离提取技术领域。
背景技术
α-酮戊二酸(KGA)和丙酮酸(PYR)都是重要的有机羧酸，在食品，农业，制药行业都有着广泛的应用。α-酮戊二酸是氨基酸代谢的重要前体物质，也是三羧酸循环中重要的中间代谢产物。丙酮酸在三大营养代谢联系中起着重要的枢纽作用。
目前，工业上合成有机酸主要有两种方法，分别是化学合成法和生物合成法。生物合成法主要是利用微生物发酵将碳源物质转化成目标有机酸。目前提取有机酸的方法主要有离子交换法，减压蒸馏，双膜法，有机溶剂提取法和钙盐沉淀法。因为α-酮戊二酸和丙酮酸化学性质比较相似，离子交换法无法将两种酮酸完全分离开。发酵液或者酶液成分较为复杂，所以减压蒸馏法不适合提取分离α-酮戊二酸和丙酮酸。有机溶剂和双膜法以及钙盐提取法都是趋于获得酮酸盐固体，丙酮酸钠后期需要经过碱性条件和高温才能变成丙酮酸液体，又因为丙酮酸不稳定，易发生聚合反应从而导致丙酮酸的最后纯度和收率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种从微生物发酵液或酶转化液中同时提取α-酮戊二酸和丙酮酸的方法，所述方法是将含有α-酮戊二酸和丙酮酸的微生物发酵液或酶转化液进行浓缩、酸化、脱色除盐、层析，蒸馏、精制。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
1)预处理：将含α-酮戊二酸和丙酮酸微生物发酵液或酶转化液分离去除菌体和其他可见固型物、大分子物质，浓缩使α-酮戊二酸和丙酮酸的浓度均大于200g/L；用浓盐酸将发酵液进行酸化处理，再经阳离子交换树脂脱色，去除高价金属离子，获得含有α-酮戊二酸和丙酮酸预处理液；
2)α-酮戊二酸和丙酮酸的分离：硅胶填料湿法装柱，将预处理液采用湿法上样；具体地，是将处理后的发酵液直接加入到湿法装柱的硅胶填料玻璃层析柱中，静置，然后用混合有机溶剂洗脱分离α-酮戊二酸和丙酮酸；丙酮酸要先于α-酮戊二酸洗脱下来，待洗脱溶剂中不含丙酮酸时，加大洗脱溶剂的极性，洗脱α-酮戊二酸；
3)α-酮戊二酸精品的获取：将收集的α-酮戊二酸溶液减压蒸馏浓缩，烘干、粉碎后获得α-酮戊二酸精品；
4)丙酮酸精品的获取：将收集的丙酮酸粗溶液旋转蒸发，获得丙酮酸精品。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述分离和过滤包括离心分离、超滤、微滤或板框过滤中的一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述用于脱色的阳离子交换树脂是指732阳离子交换树脂。
在本发明的一种实施方式中，所述酸化是调节溶液pH≤1.5。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述湿法上样是指将预处理的浓缩发酵液直接加到玻璃层析柱中。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述湿法装柱是称取α-酮戊二酸和丙酮酸总量15倍、20倍、25倍或30倍质量的200-300目硅胶，加入混合洗脱溶剂中极性最小的一种单一溶剂进行湿法装柱。柱的大小为50mm×500mm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述混合有机溶剂是乙酸乙酯和石油醚，或乙酸乙酯和正己烷，或乙酸乙酯和二氯甲烷。丙酮酸部分的洗脱采用体积比为2:3到1:1之间乙酸乙酯：石油醚的混合溶剂；或者体积比为4:7到5:8之间的乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂；或者体积比为2:9到2:7之间的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂。α-酮戊二酸部分的洗脱所采用的混合溶剂比为大于丙酮酸洗脱溶剂比中的最大比值，或者单独采用乙酸乙酯来洗脱α-酮戊二酸。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)溶剂洗脱时的流速为4～10mL/min，例如，10mL/min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述硅胶填料是粒径100～400目的硅胶填料，例如300～400目。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述层析柱的高径比为(1：4)～(1：10)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述α-酮戊二酸精品的获取，是将分离收集的α-酮戊二酸溶液旋转蒸发浓缩，烘干、粉碎；所述干燥条件为50～80℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述旋转蒸发收集的丙酮酸溶液，旋转蒸发条件：120rpm，40℃。
在本发明的一种实施方式中，操作步骤如下：
a：将含α-酮戊二酸和丙酮酸的微生物发酵液或酶转化液去除菌体和其他可见固型物；
b：将去除菌体和其他可见固型物后的清液经纳滤膜过滤处理，去除其中的菌体碎片、色素、脂质、蛋白质和多糖等大分子物质，并用少量水洗涤过滤残留液；所述超滤膜组件可为卷式膜、管式膜和板式膜，膜截留分子量为500-3000Da；
c：将超滤液经旋转蒸发浓缩处理，使α-酮戊二酸和丙酮酸的浓度均>200g/L，所述旋转蒸发条件为：120rpm,40℃。
d：将蒸馏后的浓缩液边搅拌边加入浓盐酸调节至pH≤1.5；
e：将酸化后的发酵液通过732阳离子交换树脂去除发酵液中的金属离子，和色素，树脂和浓缩液体积比约为10：3。
f：经过732阳离子交换树脂处理后的发酵液浓缩至220g/L备用；蒸发条件120rpm，40℃。
g：称取α-酮戊二酸和丙酮酸总量15倍、20倍、25倍或30倍的200-300目硅胶，加入混合洗脱溶剂中极性最小的一种单一溶剂进行湿法装柱。柱的大小为50mm×500mm。
h：将混有硅胶的样品缓慢加入玻璃层析柱中，然后加入一定量极性较小的混合洗脱溶剂洗脱丙酮酸部分，洗脱丙酮酸部分的混合溶剂为体积比2:3到1:1之间的乙酸乙酯：石油醚，或者体积比4:7到5:8之间的乙酸乙酯和正己烷；或者，体积比2:9到2:7之间的乙酸乙酯和二氯甲烷。α-酮戊二酸部分的洗脱所采用的混合溶剂比为大于丙酮酸洗脱溶剂比中的最大比值，也可完全采用乙酸乙酯进行洗脱。
i：将上述h-1中所收集的α-酮戊二酸溶液经旋转蒸发仪蒸干，再经过油泵抽3h左右。所述旋转蒸发条件为：120rpm，45℃。然后在50～80℃恒温干燥箱内烘干，粉碎后即可得到固体粉末状α-酮戊二酸产品；
j：将上述h-1中所收集的丙酮酸溶液经旋转蒸发去除有机溶剂和水，即得丙酮酸粗品，所述旋转蒸发条件为：120rpm，40℃。
有益效果：本发明的提取方法有效从微生物发酵或酶转化液中同时提取出生产α-酮戊二酸和丙酮酸，α-酮戊二酸和丙酮酸的纯度均达98％以上，产品质量达到食品级，α-酮戊二酸和丙酮酸的收率在70％-90％之间。本发明相比于其他分离提取方法具有成本低，效率高以及很大的工业化应用潜力等优点。比如公开号为CN106496019A的专利中采取结晶蒸馏法来分离提取微生物发酵或酶转化液中α-酮戊二酸和丙酮酸，需要3-5倍浓缩液的乙酸乙酯萃取，而本发明中不需要此工艺，这也就很大程度的减少生产成本。其次，结晶过程需要2天左右的时间，整个精制过程需要60-72h，而本发明精制工艺中只需要12-24h左右，这也大大的提高了生产的效率。总体而言，本发明只需要一步硅胶柱层析法就可以将α-酮戊二酸和丙酮酸有效分离开。不管是从生产成本或者生产效益的角度来说，本发明都是一种高效的分离α-酮戊二酸和丙酮酸的方法。
附图说明
图1为本发明一种实施方式的提取工艺流程图。
具体实施方式
α-酮戊二酸、丙酮酸的测定方法：高效液相色谱(HPLC)
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column；流动相：5mM H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；紫外检测器波长：210nm。
纯度计算方法：
f1—HPLC检测的标品溶液峰面积；
f2—HPLC检测的试样溶液峰面积；
m1—标品质量，单位为克(g)；
m2—试样质量，单位为克(g)；
p—标品的纯度，数值以％表示。
收率计算方法：
M—提取所得精品总质量；
W—所得的精品的纯度；
C—发酵液中样品的浓度；
V—去除菌体后发酵液的体积。
以下实施例是从含有α-酮戊二酸和丙酮酸的微生物发酵液或酶转化液中同时提取α-酮戊二酸和丙酮酸的方法，分别在以解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica WSH-Z06CCTCC M20714)为发酵菌种获得的发酵液(α-酮戊二酸浓度：丙酮酸浓度＝1：1)为例。其他类似含有KGA和PYR的微生物发酵液或酶转化液，均可按本发明的实施方式进行，并经过简单的改进获得具有较高纯度的KGA和PYR成品。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
以Y.lipolytica WSH-Z06为发酵菌种获得的发酵液为例(α-酮戊二酸浓度：丙酮酸浓度＝1：1)，按如下步骤进行提取：
(1)离心过滤：将含有α-酮戊二酸和丙酮酸的发酵液泵人离心机中，离心去除菌体和其他可见固型物。离心条件：常温，转速8000g。
(2)膜过滤：采用超滤过滤去除杂质，将离心去除菌体和其他可见固型物后的清液经超滤处理，去除发酵液中的菌体碎片、色素、脂质、蛋白质和多糖等大分子物质，并用少量水洗涤过滤残留液以提高超滤过程收益。所用超滤膜组件管式膜组件，膜材料为截留分子量为500～3000Da的聚乙烯膜，超滤条件：常温，操作压力4-10Bar。
(3)浓缩：将超滤过滤液在-0.08Mpa，65℃条件下减压蒸馏，使其中α-酮戊二酸浓度浓度和丙酮酸浓度在200g/L以上。
(4)酸化：在常温条件下，边搅拌边往上述经离子交换柱处理后的浓缩液中加入浓盐酸，将浓缩液pH调节至≤1.5。
(5)离子交换树脂除杂：将732阳离子交换树脂用1mol/LNaOH和1mol/LHCl轮流处理，再分别用去离子水洗至中性，最后再用1mol/LHCl预处理，去离子水洗涤至中性(钠型树脂转化成氢型树脂)，上柱，将浓缩液通过交换树脂处理。此操作目的在于去除浓缩液中的高价阳离子，同时起到脱色的作用。
(6)层析分离：向玻璃层析柱加入120g的200-300目硅胶，湿法装柱(50mm×500mm)，径高比为1：4。再将20mL预处理后的浓缩发酵液加入到层析柱表层，静置30min。用100mL石油醚平衡，接着再用4倍柱体积的乙酸乙酯和石油醚有机溶剂洗脱，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：1，此时，流出的洗脱液中主要是丙酮酸；待层析柱中的溶剂接近硅胶表面时，在加入2-3倍柱体积的乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为2：1，或者极性更大的单一溶剂乙酸乙酯。洗脱流速为7mL/min，室温条件下。
(7)蒸馏：将层析分离后收集的含有丙酮酸部分的洗脱液合并在一起旋转蒸发，将层析分离后收集的含有α-酮戊二酸部分的洗脱液也合并在一起旋转蒸发40℃，120rpm。
(8)α-酮戊二酸的精制：经旋转蒸发后的α-酮戊二酸先经过油泵抽3h左右，然后在65℃恒温干燥箱内烘干，粉碎后得到α-KG精品。经质量检测α-酮戊二酸的纯度为98.7％，收率为86.7％。
(9)丙酮酸检测：经质量检测丙酮酸纯度为99.1％，收率为75.9％。
实施例2
以Y.lipolytica WSH-Z06为发酵菌种获得的发酵液为例(α-酮戊二酸浓度：丙酮酸浓度＝1：1)，实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中的洗脱溶剂为乙酸乙酯和正己烷，体积比为2：3，对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为98.5％，收率为84.9％；丙酮酸：纯度为97.7％，收率为73.3％。
实施例3
以Y.lipolytica WSH-Z06为发酵菌种获得的发酵液为例(α-酮戊二酸浓度：丙酮酸浓度＝1：1)，实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中的洗脱溶剂为乙酸乙酯和二氯甲烷，体积比为1：4。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为99.0％，收率为88.7％；丙酮酸：纯度为98.2％，收率为73.5％。
实施例4
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中洗脱流速为4mL/min。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为99.4％，收率为79％；丙酮酸：纯度为99.8％，收率为75.8％。
实施例5
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中洗脱流速为10mL/min。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为98.8％，收率为81.9％；丙酮酸：纯度为99.3％，收率为73.8％。
实施例6
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中柱的硅胶目数为100-200目。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为99.8％，收率为85.2％；丙酮酸：纯度为99.9％，收率为67.2％。
实施例7
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)硅胶目数为300-400目。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为98.1％，收率为87.1％；丙酮酸：纯度为99.4％，收率为76.4％。
实施例8
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中柱的径高比1：5.5。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为98.3％，收率为83.6％；丙酮酸：纯度为98.4％，收率为73.2％。
实施例9
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中柱的径高比1:7。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为98.7％，收率为74.9％；丙酮酸：纯度为99.0％，收率为69.3％。
实施例10
实施方式同实施例1，其区别在于，步骤(6)中柱的径高比1:10。对制备获得的α-酮戊二酸和丙酮酸含量进行检测，α-酮戊二酸：纯度为98.7％，收率为72.9％；丙酮酸：纯度为99.0％，收率为66.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种从微生物发酵液或酶转化液中同时提取α-酮戊二酸和丙酮酸的方法，其特征在于，将含有α-酮戊二酸和丙酮酸的微生物发酵液或酶转化液进行浓缩、酸化、脱色除盐、层析，蒸馏、精制；
包括如下步骤：
1)预处理：将含α-酮戊二酸和丙酮酸微生物发酵液或酶转化液分离去除菌体和其他可见固型物、大分子物质，浓缩使α-酮戊二酸和丙酮酸的浓度均大于200g/L；用浓盐酸将发酵液进行酸化处理，再经阳离子交换树脂脱色，去除高价金属离子，获得含有α-酮戊二酸和丙酮酸预处理液；
2)α-酮戊二酸和丙酮酸的分离：将步骤(1)所得预处理液直接加入到湿法装柱的硅胶填料玻璃层析柱中，静置，然后用混合有机溶剂洗脱分离α-酮戊二酸和丙酮酸，混合有机溶剂是乙酸乙酯和石油醚，或乙酸乙酯和正己烷，或乙酸乙酯和二氯甲烷；丙酮酸要先于α-酮戊二酸洗脱下来，丙酮酸部分的洗脱采用体积比为2:3到1:1之间乙酸乙酯：石油醚的混合溶剂；或者体积比为4:7到5:8之间的乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂；或者体积比为2:9到2:7之间的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂，待洗脱溶剂中不含丙酮酸时，加大洗脱溶剂的极性，洗脱α-酮戊二酸，α-酮戊二酸部分的洗脱所采用的混合溶剂比为大于丙酮酸洗脱溶剂比中的最大比值，或者单独采用乙酸乙酯来洗脱α-酮戊二酸；溶剂洗脱时的流速为4～10mL/min；
3)α-酮戊二酸精品的获取：将收集的α-酮戊二酸溶液减压蒸馏浓缩，烘干、粉碎后获得α-酮戊二酸精品；
4)丙酮酸精品的获取：将收集的丙酮酸粗溶液旋转蒸发，获得丙酮酸精品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述分离和过滤包括离心分离、超滤、微滤或板框过滤中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述用于脱色的阳离子交换树脂是指732阳离子交换树脂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述酸化是调节溶液pH≤1.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述湿法装柱是称取α-酮戊二酸和丙酮酸总量15倍、20倍、25倍或30倍质量的200-300目硅胶，加入混合洗脱溶剂中极性最小的一种单一溶剂进行湿法装柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述α-酮戊二酸精品的获取，是将分离收集的α-酮戊二酸溶液旋转蒸发浓缩，烘干、粉碎；所述干燥条件为50～80℃；步骤(4)所述旋转蒸发收集的丙酮酸溶液，旋转蒸发条件：120rpm，40℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述α-酮戊二酸精品的获取，是将分离收集的α-酮戊二酸溶液旋转蒸发浓缩，烘干、粉碎；所述干燥条件为50～80℃；步骤(4)所述旋转蒸发收集的丙酮酸溶液，旋转蒸发条件：120rpm，40℃。
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