CN107735499B - Hcv ns4a/经修饰的ns3多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了经修饰的丙型肝炎病毒多肽。多肽包括HCV NS4a结构域和经修饰的NS3结构域。多肽保留构象表位。还描述了包括多肽的HCV免疫测定。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求提交于2015年3月27日美国临时申请62/139,183的权益。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
不适用。
技术领域
本发明整体涉及丙型肝炎病毒(HCV)构建体和使用其的方法。更具体地,本发明涉及具有NS4a和经修饰的NS3结构域的免疫原性、免疫反应性HCV多肽。经修饰的多肽保留构象表位并因此可用于诊断HCV感染的免疫测定。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是肠胃外非甲型非乙型肝炎(NANBH)的主要原因,其主要通过身体输血和体液交换来传播。该病毒存在于0.4%至2.0%的美国普通人群中。在约50%的感染者中产生慢性肝炎,其中约20%被感染的个体产生肝硬化,有时导致肝细胞癌。因此,研究和控制该疾病在医学上是重要的。
Houghten等人首先鉴定并表征HCV是NANBH的原因。HCV的病毒基因组序列是已知的,用于获得该序列的方法也是已知的。参见例如国际公布WO 89/04669;WO 90/11089;和WO 90/14436。HCV具有9.5kb的正义单链RNA基因组,其是黄病毒家族的成员。基于***发育分析,已鉴定出至少六个不同但相关的HCV基因型(Simmonds等人,J.Gen.Virol.(1993)74:2391-2399)。该病毒编码一个具有多于3000个氨基酸残基的多蛋白(Choo等人,Science(1989)244:359-362;Choo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:2451-2455;Han等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:1711-1715)。多蛋白在翻译的同时或之后被加工成结构和非结构(NS)蛋白这两者。
具体地,由HCV基因组编码几种蛋白质。HCV多蛋白的裂解产物的顺序和命名如下:NH2-C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。宿主蛋白酶催化多蛋白的最初裂解,释放三种结构蛋白,即N-末端核衣壳蛋白(称为“核心”)和两种包膜糖蛋白“E1”(也称为E)和“E2”(也称为E2/NS1),以及含有病毒酶的非结构(NS)蛋白。将NS区称为NS2、NS3、NS4、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b。NS2是具有蛋白水解活性的膜内在蛋白。NS2单独或与NS3组合,切割NS2-NS3酰胺(sissle)键,继而产生NS3N-末端并释放具有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性这两者的大的多蛋白。NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。具体地,HCV NS3蛋白质是630个氨基酸的蛋白质,包含三个功能结构域。丝氨酸样蛋白酶结构域位于氨基末端,而螺旋酶和NTP酶活性处于羧基末端。NS3的丝氨酸蛋白酶负责在NS3/4a、NS4a/b、NS4b/5a和NS5a/b的连接处切割。
已描述了许多可用作HCV的免疫学和诊断试剂的、衍生自HCV多蛋白的一般和特异性多肽。参见例如Houghton等人,欧洲专利公开No.318,216和388,232;Choo等人,Science(1989)244:359-362;Kuo等人,Science(1989)244:362-364;Houghton等人,Hepatology(1991)14:381-388;Chien等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011-10015;Chien等人,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33-39;Chien等人,国际公布No.WO 93/00365;Chien,D.Y.,国际公布No.WO 94/01778。这些出版物通常对HCV和HCV多肽免疫学试剂的制备和使用提供了广泛的背景。因此,为简便起见,这些出版物的公开内容以引用方式并入本文。
用于筛选和鉴定HCV载体和HCV污染的血液或血液制品的灵敏且特异的方法为医学提供重要的进步。在约10%输血的患者中发生输血后肝炎(PTH),而HCV在这些病例中占多达90%。患者护理以及防止HCV通过血液和血液制品或通过密切的个人接触来传播,需要可靠的诊断和预后工具。因此,已开发出几种测定方法用于HCV感染的血清诊断。参见例如Choo等人,Science(1989)244:359-362;Kuo等人,Science(1989)244:362-364;Choo等人,Br.Med.Bull.(1990)46:423-441;Ebeling等人,Lancet(1990)335:982-983;van der Poel等人,Lancet(1990)335:558-560;van der Poel等人,Lancet(1991)337:317-319;Chien,D.Y.,国际公布No.WO 94/01778;Valenzuela等人,国际公布No.WO 97/44469;以及Kashiwakuma等人,美国专利No.5,871,904。
美国专利No.6,630,298(全文以引用方式并入本文)描述了HCV抗原/抗体联合测定,该测定使用HCV核心抗体检测HCV抗原并使用NS3/4a表位检测HCV抗体。NS3/4a表位在氨基末端具有NS3并在羧基末端具有NS4a。NS3结构域的蛋白酶活性保留于该表位中,并且稳定性受所存在的蛋白酶活性负面影响。
美国专利No.6,632,601(全文以引用方式并入本文)描述了组合使用NS3/4a构象表位和多表位融合抗原(MEFA)的免疫测定法。该测定提供用于检测早期HCV血清转化的方法。在酵母中表达并在如美国专利No.6,632,601所述的非变性条件下纯化的NS3/4a具有蛋白酶和螺旋酶两种功能。因为以该方式纯化的NS3/4a保留天然构象,已发现其在早期血清转化抗体检测中比c200或c33c抗原更为敏感。在将NS3/4a和MEFA 7.1用作抗原的抗体测定中,血清转化抗体比当时市场上销售的HCV测定早2-14天检测出。然而,NS3/4a蛋白质由于NS3蛋白酶活性而发生自水解并切割MEFA 7.1。
美国专利No.7,491,808(全文以引用方式并入本文)描述了这样一种与MEFA组合的NS3/4a构象表位:其包括蛋白水解活性减小的突变NS3蛋白酶结构域。
美国专利6,211,338(全文以引用方式并入本文)描述了共价HCV NS4a/NS3复合物,其包括天然HCV NS4a肽的中心疏水结构域、连接子以及HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域。NS4a/NS3复合物通过NMR光谱学可用于结构测定和HCV抑制剂的结合模式的测定。
仍然需要灵敏且精确的诊断和预后工具,以便提供充分的患者护理以及防止HCV通过血液和血液制品或通过密切的个人接触来传播。
发明内容
本发明部分基于以下发现:使用NS4a/经修饰的NS3HCV多肽提供用于检测HCV感染的优异试剂。NS4a/经修饰的NS3多肽保留构象表位并从而保留免疫反应性,并且可因此单独使用或者与用于精确且有效地检测HCV感染存在(特别是HCV特异性抗体的早期检测)的其它HCV试剂组合使用。本文所述测定可用于检测由六个已知HCV基因型中的任一个导致的HCV感染。
因此,在一个实施方案中,本发明涉及一种免疫测定试剂,其包含多肽或与所述多肽具有至少90%氨基酸同源性的多肽,或与所述多肽具有至少90%氨基酸同一性的多肽,所述多肽包括:具有SEQ ID NO:3的丙型肝炎病毒(HCV)NS4a结构域;具有SEQ ID NO:4的经修饰HCV NS3结构域,其中SEQ ID NO:4的一个或多个氨基酸残基被修饰成使得经修饰的丙型肝炎病毒NS3结构域的蛋白酶活性相对于缺乏所述修饰的具有SEQ ID NO:4的丙型肝炎病毒NS3结构域的蛋白酶活性受到抑制;以及将NS4a结构域的羧基末端连接至经修饰的NS3结构域的氨基末端的间插区。NS3结构域相对于天然HCV NS3结构域的修饰在于,SEQ IDNO:4的第15和16位氨基酸残基是赖氨酸(K)而非异亮氨酸(I)。优选地,用于抑制蛋白酶活性的修饰包括SEQ ID NO:4的第55、79和137位氨基酸残基中的一个或多个的置换,优选丙氨酸或甘氨酸的置换。在优选的实施方案中,用于抑制蛋白酶活性的修饰包括丙氨酸对SEQID NO:4的第137位氨基酸残基的置换。
在本发明的多肽的一个优选的实施方案中,间插区是氨基酸三联体SGS,导致多肽包含或更具体地讲由SEQ ID NO:2组成。间插区,优选三肽柔性连接子,被称为“转”序列。转序列使得NS4a结构域能够在NS3结构域的蛋白酶区域内折叠成口袋。
在另一些实施方案中,本发明的免疫测定试剂结合至固体支持体。
在另一些实施方案中,本发明涉及一种检测生物样品中HCV的抗体的方法。该方法包括:(a)提供如上所述的免疫测定试剂;(b)将生物样品与所述免疫测定试剂在使HCV抗体在存在于所述生物样品中时能够与所述多肽结合的条件下合并以形成第一免疫复合物;(c)向得自步骤(b)的第一免疫复合物中加入标记检测剂,其中标记检测剂与免疫复合物反应;以及(d)如果存在,检测标记检测剂与第一免疫复合物之间形成的第二免疫复合物,作为生物样品中HCV抗体存在的指示。优选地,标记检测剂是抗体或抗原。优选地,免疫测定试剂结合至固体支持体。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种检测生物样品中丙型肝炎病毒的抗体和/或丙型肝炎病毒抗原(“组合”或“联合”测定)的方法。该方法包括:(a)提供如上所述的免疫测定试剂;(b)将生物样品与所述免疫测定试剂以及一种或多种抗-HCV抗体以下条件下合并,所述条件允许HCV抗体在存在于所述生物样品中时与所述多肽结合以形成第一免疫复合物,并且还允许HCV抗原在存在于所述生物样品中时与所述抗-HCV抗体结合以形成第二免疫复合物;(c)向得自步骤(b)的第一免疫复合物中加入第一标记检测剂,其中第一标记检测剂与所述第一免疫复合物反应,并且向得自步骤(b)的第二免疫复合物中加入第二标记检测剂,其中第二标记检测剂与第二免疫复合物反应;(d)如果存在,检测第一标记检测剂与第一免疫复合物之间形成的第三免疫复合物,并且如果存在,检测第二标记检测剂与第二免疫复合物之间形成的第四免疫复合物,作为生物样品中HCV的抗体存在和/或HCV抗原存在的指示。优选地,第一标记检测剂和第二标记检测剂各自为标记抗体或标记抗原(它们的任意组合;即两者可均为标记抗体;两者可均为标记抗原;一者可为标记抗体而另一者为标记抗原)。优选地,一种或多种免疫测定试剂和一种或多种抗-HCV抗体结合到相同或不同的固体支持体。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种免疫诊断测试试剂盒,其包括如上所述的免疫测定试剂,以及用于实施免疫诊断测试的说明书。
在另外的实施方案中,本发明涉及一种免疫诊断测试试剂盒,其还包括一种或多种抗-HCV抗体,优选抗-HCV核心抗体。
在另外的实施方案中,本发明涉及一种分离的多肽,其包含氨基酸序列SEQ IDNO:2。在某些实施方案中,多肽由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成。
在另一些实施方案中,本发明提供一种从人生物样品供应源选择生物样品的方法,该方法包括从供应源选择包含与本发明的免疫测定试剂形成抗原-抗体复合物的抗体的那些样品。这可用于鉴定HCV阳性样品以从供应源移除,特别是在供应源为血液供应源时更是如此。未被选择的那些样品可用于制备血液相关的制品。通过鉴定HCV阳性样品,该方法还可用于富集阳性样品。
本发明还提供一种从人生物样品供应源选择生物样品的方法,该方法包括从供应源选择不包含与本发明的免疫测定试剂形成抗原-抗体复合物的抗体的那些样品。这可用于鉴定可用于制备血液相关制品的生物样品。
参考下述详细说明和附图,本发明的这些和其它方面将变得显而易见。此外,本文列出多份参考文献,它们更详细地描述某些过程或组合物,且因此将这些文献全文以引用方式并入。
根据随后结合附图而考虑的描述,可以使本发明的附加特征和优点显而易见。
附图说明
图1是HCV基因组的图解示意图,示出多蛋白的由其衍生本发明测定试剂(蛋白质和抗体)的各个区域。
图2是酵母表达载体pBS24.1的环形结构图。
图3是本发明的转突变体HCV表达盒的图解示意图。
图4是本发明的转突变体表达质粒pd.4a.t.ns3.1165.KK的环形结构图。
图5示出转突变体表达质粒pd.4a.t.ns3.1165.KK的克隆过程。
图6是使用本发明的免疫测定试剂的代表性免疫测定法的示意图,其中免疫测定试剂被固定于固体支持体上。
图7是使用本发明的免疫测定试剂和抗-HCV抗体的代表性免疫测定法的示意图,其中免疫测定试剂和抗-HCV抗体被固定于固体支持体上。
具体实施方式
除非另有说明,否则本发明的实施将采用所属领域内的化学、生物化学、重组DNA技术及免疫学常规方法。此类技术在文献中全面地阐述。参见例如《基础病毒学》(Fundamental Virology),第2版,第I&II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑);《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology),第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,《蛋白质:结构和分子特性》(Proteins:Structures and Molecular Properties)(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers,Inc.,最新版);Sambrook等人,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989);《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编辑,AcademicPress,Inc.)。
本文引用的所有出版物、专利和专利公布,无论是在上文或在下文,都在此全文以引用方式并入。
必须注意,如在本说明书和所附权利要求中使用,除非内容另有明确指示,否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。因此,例如,提及“抗原”包括两种或更多种抗原等的混合物。
下列氨基酸缩写在全文中使用:
丙氨酸:Ala(A) 精氨酸:Arg(R)
天冬酰胺:Asn(N) 天冬氨酸:Asp(D)
半胱氨酸:Cys(C) 谷氨酰胺:Gln(Q)
谷氨酸:Glu(E) 甘氨酸:Gly(G)
组氨酸:His(H) 异亮氨酸:Ile(I)
亮氨酸:Leu(L) 赖氨酸:Lys(K)
甲硫氨酸:Met(M) 苯丙氨酸:Phe(F)
脯氨酸:Pro(P) 丝氨酸:Ser(S)
苏氨酸:Thr(T) 色氨酸:Trp(W)
酪氨酸:Tyr(Y) 缬氨酸:Val(V)
I.定义
在描述本发明中,使用下列术语且这些术语旨在如下所述而定义。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物,并不限于最小长度的产物。因此,肽、寡肽、二聚物、多聚物等包括在该定义之内。全长蛋白质及其片段均涵盖在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外,就本发明的目的而言,“多肽”指包括对天然序列的修饰,例如缺失、添加和置换(通常性质保守)的蛋白质,只要蛋白质维持所需活性。这些修饰可以是经过设计的,如通过定点诱变,或者可以是偶然的,例如通过产生蛋白质的宿主的突变,或者由于PCR扩增所造成的错误所致。
HCV多肽是一种如上所定义的衍生自HCV多蛋白的多肽。该多肽不需要物理上衍生自HCV,但可合成或重组产生。另外,该多肽可衍生自任何各种HCV株和分离物,例如但不限于来自HCV株1、2、3、4、5或6的任何分离物。在这些病毒株之间有许多保守区和可变区是已知的,并且一般来讲,当对两条序列进行比对时,衍生自这些区域的表位的氨基酸序列将具有高度的序列同源性,例如,大于30%,优选大于40%的氨基酸序列同源性。因此,例如,术语“NS4a/3”多肽是指来自任何各种HCV株的与NS3结合的NS4a、以及NS4a/3类似物、突变蛋白和免疫原性的片段(如下文进一步定义)。许多这些病毒株的完整基因型是已知的。参见例如美国专利No.6,150,087以及GenBank登录号AJ238800和AJ238799。
“衍生自”HCV多蛋白的多肽意指包含参考HCV多蛋白的一个或多个区域或区域的部分的序列的多肽。通常,该多肽由包括表位的区域或区域的部分组成,并且通常具有与参考多肽基本上同源的氨基酸序列,如下所定义。因此,术语“衍生自”用于鉴定分子的初始来源,但不旨在限制该分子的制备方法,所述制备方法可为例如化学合成或重组方法。
术语“类似物”和”突变蛋白”是指在本文所述测定中保持所需活性如免疫反应性的参考分子的生物活性衍生物,或此类衍生物的片段。通常,术语“类似物”是指具有天然多肽序列和结构,并且相对于天然分子具有一个或多个氨基酸添加、置换(通常性质保守,或在经修饰的NS3的各种实施方案的情况下,在活性蛋白水解位点性质不保守)和/或缺失的化合物,只要修饰不破坏免疫原性的活性。术语“突变蛋白”是指具有一个或多个氨基酸样分子的多肽,包括但不限于仅包含氨基和/或亚氨基分子的化合物,包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如,非天然氨基酸等)的多肽,具有取代的键的多肽,以及本领域已知的其它修饰,天然存在和非天然存在的(例如合成)、环化的、支链的分子等等。该术语也包括包含一个或多个N-取代的甘氨酸残基(“类肽”)以及其它合成氨基酸或肽的分子。(对于类肽的描述参见例如,美国专利No.5,831,005;5,877,278;和5,977,301;Nguyen等人,Chem Biol.(2000)7:463-473;以及Simon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:9367-9371)。优选地,类似物或突变蛋白至少具有与天然分子相同的免疫活性。用于制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的并且进一步描述在下文中。
如上所述,类似物通常包括性质上保守的置换,即在与它们的侧链相关的一类氨基酸中发生的那些置换。具体地,氨基酸通常被分为四类:(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸;(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;以及(4)非荷电极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被划分为芳族氨基酸。例如,可以合理地预测分别用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸,用谷氨酸置换天冬氨酸,用丝氨酸置换苏氨酸,或用一个结构相关的氨基酸类似保守置换一个氨基酸,将不对生物活性有重要影响。例如,所关注的多肽可包括至多约5-10个保守性或非保守性氨基酸置换,或者甚至至多约15-25个保守性或非保守性氨基酸置换,或者5-25之间的任意整数,只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的技术人员可参照本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图,容易地确定所关注的分子中可耐受改变的区域。
所谓“经修饰的NS3”意指NS3多肽相对于天然HCV NS3结构域的作出如下修饰:SEQID NO:4的第15和16位氨基酸残基是赖氨酸(K)而非异亮氨酸(I),并且其中SEQ ID NO:4的一个或多个氨基酸残基被修饰成使得经修饰的丙型肝炎病毒NS3结构域的蛋白酶活性相对于缺乏该修饰的具有SEQ ID NO:4的丙型肝炎病毒NS3结构域的蛋白酶活性受到抑制。优选地,用于抑制蛋白酶活性的修饰包括SEQ ID NO:4的第55、79和137位氨基酸残基中的一个或多个的置换,优选丙氨酸或甘氨酸的置换。在优选的实施方案中,用于抑制蛋白酶活性的修饰包括丙氨酸对SEQ ID NO:4的第137位氨基酸残基的置换。
“片段”意指仅由完整的全长多肽序列和结构的一部分组成的多肽。该片段可包括天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失。特定HCV蛋白质的“免疫原性片段”通常包括全长分子的至少约5-10个连续的氨基酸残基,优选全长分子的至少约15-25个连续的氨基酸残基,并且最优选全长分子的至少约20-50个或更多个连续的氨基酸残基,这些氨基酸残基限定了一个表位;或者介于5个氨基酸和全长序列之间的任何整数的氨基酸残基,只要所关心的所述片段在本文所述测定中保留免疫反应性。
如本文所用,术语“表位”是指至少约有3至5个、优选约5至10个或15个并且不超过约1,000个氨基酸(或其间的任意整数)的序列;它定义了一个其自身或作为较大序列的一部分而与响应于此类序列产生的抗体结合的序列。该片段的长度没有严格的上限,它可包含几乎蛋白质序列的全长,或甚至含有HCV多蛋白的两个或更多个表位的融合蛋白。用于本发明的表位并不限于具有衍生其的亲本蛋白质一部分的确切序列的多肽。实际上,病毒基因组处于恒定流动的状态并含有在分离物之间表现出相对高程度可变性的几个可变区域。因此,术语“表位”涵盖与天然序列相同的序列,以及该天然序列的修饰物,诸如缺失、添加和置换(性质通常保守)。
可使用任何数量的本领域熟知的表位作图技术来鉴定包括表位在内的给定多肽的区域。参见例如,Epitope Mapping Protocols,载于Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编辑,1996)Humana Press,Totowa,N.J。例如,可通过例如以下方法确定线性表位:在固体支持体上同时合成大量肽,使肽对应于蛋白质分子的某部分,以及在肽仍然附接到支持体时使肽与抗体反应。此类技术在本领域中为人们所知并且描述于例如,美国专利No.4,708,871;Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002;Geysen等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178-182;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715,全部全文以引用方式并入本文中。用这些技术鉴定了许多HCV的表位。参见例如Chien等人,Viral Hepatitis and Liver Disease(1994)第320-324页,下面将作进一步描述。类似地,通过例如X-射线结晶学和二维核磁共振测定氨基酸的空间构象来容易地鉴定构象表位。参见例如Epitope Mapping Protocols,出处同上。使用标准抗原性图和亲水性图,诸如使用例如从Oxford Molecular Group购得的Omiga 1.0版软件程序计算的那些,也可鉴定出蛋白质的抗原区域。该计算机程序采用Hopp/Woods方法,Hopp等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)78:3824-3828来测定抗原性特征,采用Kyte-Doolittle技术,Kyte等人,J.Mol.Biol.(1982)157:105-132作亲水性图。
如本文所用,术语“构象表位”是指全长蛋白质的一部分,或者其类似物或突变蛋白,其具有编码全长天然蛋白质内的表位的氨基酸序列的天然结构特征。天然的结构特征包括但不限于糖基化和三维结构。表位限定序列的长度可经受广泛改变,因为认为这些表位是通过抗原的三维形状形成的(例如折叠)。因此,限定表位的氨基酸可以数量相对较少,但沿着分子的长度广泛地分散,通过折叠形成正确的表位构象。限定表位的残基之间的抗原部分对于表位的构象结构可能不是关键的。例如,这些间插序列的缺失或置换可能不影响构象表位,条件是保留对于表位构象关键的序列(例如涉及二硫键、糖基化位点的半胱氨酸等)。
可用以上讨论的方法容易的鉴定NS4a/3区域中存在的构象表位。此外,给定多肽中构象表位的存在与否可通过用抗体(构象表位的多克隆血清或单克隆抗体)筛选所关注的抗原,并将其反应性与仅保留线性表位(如果存在)的抗原的变性形式的反应性比较来确定。在此类使用多克隆抗体的筛选中,可能有利的是首先用变性抗原吸收多克隆血清,并观察其是否保留针对所关注抗原的抗体。
优选地,重组产生构象表位,并使其在保留其所需结构特征的条件下(例如,表位没有变性)能被分离出来的细胞中表达。此类细胞包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。HCV多蛋白的重组构象表位的表达和分离描述于例如国际公布No.WO 96/04301、WO 94/01778、WO 95/33053、WO 92/08734,其专利申请全文以引用的方式并入本文。另选地,可以表达抗原并在回收后使蛋白质进一步复性。还应当理解化学合成也可提供构象抗原模拟表位,它与天然抗原的构象表位交叉反应。
“抗体”(“Ab”)意指与抗原中存在的所关注表位特异性结合的分子。所谓“特异性结合”意指抗体以“锁钥”型相互作用识别表位并与表位相互作用,以在抗原和抗体间形成复合物,相反,非特异性结合可以在抗体与例如测试底物之间发生。因此,例如,HCV核心抗体是一种与HCV核心蛋白特异性结合的分子。如本文所用,术语“抗体”包括从多克隆和单克隆制备物两者获得的抗体及以下:杂交(嵌合)抗体分子(参见例如,Winter等人(1991)Nature 349:293-299;和美国专利No.4,816,567);F(ab')2和F(ab)片段;Fv分子(非共价异源二聚体,参见例如Inbar等人(1972)Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662;和Ehrlich等人(1980)Biochem 19:4091-4096);单链Fv分子(sFv)(参见例如Huston等人(1988)ProcNatl Acad Sci USA85:5879-5883);二聚和三聚抗体片段构建体;微抗体(参见例如,Pack等人(1992)Biochem 31:1579-1584;Cumber等人(1992)J Immunology 149B:120-126);人源化抗体分子(参见例如Riechmann等人(1988)Nature332:323-327;Verhoeyan等人(1988)Science 239:1534-1536;英国专利公布No.GB 2,276,169,公布于1994年9月21日);以及由此类分子获得的任何功能片段,其中此类片段保留亲本抗体分子的免疫学结合特性。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指具有同源抗体群的抗体组合物。该术语并不限制抗体的物种或来源,也不旨在被其制备方式限制。因此,该术语包括从小鼠杂交瘤获得的抗体,以及用人而非小鼠杂交瘤获得的人单克隆抗体。参见例如Cote等人,MonclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,1985,第77页。
当“分离的”用于提及多肽时意味着所指的分子独立且脱离于该分子天然所在的整个生物体,或者该分子存在于基本上无其它相同类型生物大分子的环境中。
“等效抗原决定簇”意指来自HCV的不同亚种或株的抗原决定簇,例如HCV株1、2或3。更具体地,表位是已知的,例如“5-1-1”,存在于约第1694-1735位,相对于HCV-1多蛋白序列(参见SEQ ID NO:1)编号,并且此类表位在病毒株1、2和3之间变化。因此,这三种不同病毒株的表位5-1-1是等效的抗原决定簇,因而即使它们的序列不相同,它们也是“拷贝”。一般来讲,当对两条序列进行比对时,等效抗原决定簇的氨基酸序列具有高度的序列同源性,例如,大于30%,优选大于40%的氨基酸序列同源性。
“同源性”是指两个多核苷酸或两种多肽部分之间的相似性百分比。当两个DNA或两个多肽序列在规定的分子长度内表现出至少约50%、优选至少约75%、更优选至少约80%-85%、优选至少约90%并最优选至少约95%-98%序列相似性时,这两个序列彼此“基本上同源”。如本文所用,基本上同源也指与特定DNA或多肽序列显示完全相同的序列。
通常,“同一性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的准确的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸的对应。可通过比对序列,计数两条比对序列之间匹配的准确数量,将其除以参比序列的长度,将结果乘以100来直接比较两个分子(参比序列和与参比序列的同一性%未知的序列)之间的序列信息,从而确定同一性百分比。
可以使用易得的计算机程序用于帮助分析同源性和同一性,例如ALIGN,Dayhoff,M.O.,载于M.O.Dayhoff编辑的《蛋白质序列和结构图谱》(Atlas of Protein Sequenceand Structure),增刊5,3:353-358,National biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,该程序采用Smith和Waterman在Advances in Appl.Math.2:482-489,1981中所描述的局部同源性算法进行肽分析。可从Wisconsin序列分析软件包第8版(可得自Genetics Computer Group,Madison,Wis.)获得用于测定核苷酸序列同源性的程序,例如BESTFIT、FASTA和GAP程序,这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。通过制造商推荐和上文提到Wisconsin序列分析包中所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如,可利用Smith和Warerman的同源性算法,采用默认计分表和六个核苷酸位置的空位罚分来测定特定核苷酸序列与参比序列的同源性百分比。
在本发明上下文中建立同源性百分比的另一个方法是使用版权属于爱丁堡大学,由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发,由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,Calif.)发行的MPSRCH程序包。通过该程序包,可以采用Smith-Waterman算法,其中将默认参数用于评分表(例如,空位开放罚分=12,空位延伸罚分=1,并且空位=6)。从这批数据产生的“匹配”值反映了“序列同源性”。用于计算序列之间的同一性百分比或相似性的其它合适的程序在本领域中通常是已知的,例如另一种比对程序是BLAST,也使用默认参数。例如,BLASTN和BLASTP能够用以下默认参数使用:遗传密码=标准;过滤器=无;链=两条;截断值=60;预期值=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;排序=HIGH SCORE;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详情不难获得。
另选地,可如下测定同源性:在同源区域之间形成稳定双链体的条件下进行多核苷酸杂交,接着用单链特异性核酸酶消化,并测定消化的片段的大小。在例如对特定***所定义的严格条件下进行的Southern杂交实验中,可鉴定基本上同源的DNA序列。限定合适的杂交条件在本领域技术范围之内。参见例如Sambroo等人,出处同上;DNA Cloning,出处同上;Nucleic Acid Hybridization,出处同上。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列,是指当处于适当的调控序列的控制下时,能在体外或体内被转录(对于DNA)和翻译(对于mRNA)成一种多肽的核酸分子。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。转录终止序列可位于编码序列的3'端。
“可操作地连接”是指各元件的排列,其中所述组分被装配成得以执行其所需功能。因而,当存在正确的转录因子等时,可操作地连接于编码序列的给定启动子能够实现编码序列的表达。启动子不需要与编码序列接续,只要其起到指导该序列表达的功能即可。因此,例如与可转录的内含子一样,不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间;并且仍可认为启动子序列“可操作地连接”于编码序列。
如本文所用,用于描述核酸分子的“重组体”意指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸,依据其来源或操纵,所述多核苷酸不与所有或部分与其天然结合的多核苷酸结合。术语“重组”用于指蛋白质或多肽时是指通过表达重组多核苷酸而制备的多肽。一般来讲,克隆所关注的基因,然后在转化的生物体中表达,如下进一步所述。宿主生物在表达条件下表达外源基因,从而产生蛋白。
“控制元件”是指帮助与其连接的编码序列表达的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调控结构域、聚腺苷酸化信号、非翻译区域(包括5'-UTR和3'-UTR)、适当时还有前导序列和增强子,这些序列共同提供了编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。
如本文所用,“启动子”指能够结合宿主细胞中的RNA聚合酶并启动与之可操作地连接的下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调控区。出于本发明的目的,启动子序列包括以高于背景值的可检测的水平启动所关注基因的转录所需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列内有转录起始位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子常常(但不总是)包含“TATA”盒和“CAT”盒。
当RNA聚合酶结合启动子序列时,控制序列“指导转录”细胞中的编码序列,并将编码序列转录成mRNA,之后该mRNA被翻译成由该编码序列编码的多肽。
表达盒”或“表达构建体”是指能够指导所关注的序列或基因表达的组件。表达盒包括如上所述的控制元件,例如可操作地连接于所关注序列或基因(以指导其转录)的启动子,该表达盒通常还包括聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方案中,文中所述的表达盒可包含于质粒构建体中。除了表达盒的组分外,质粒构建体还可包含一种或多种选择性标记、使质粒构建体以单链DNA(例如M13复制源)存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制源(例如SV40或腺病毒复制源)。
如本文所用,“转化”是指将外源多核苷酸引入宿主细胞中,而不考虑引入的方法:例如,通过直接摄取、转染、感染等来转化。对于具体转染方法,进一步参见下文。外源多核苷酸可维持为非整合性载体例如附加体,或者另选地可整合进宿主基因组中。
“宿主细胞”是已被转化的细胞,或者能够用外源DNA序列转化的细胞。
如本文所用,“生物样品”是指从受试者中分离的组织或流体的样品,该样品通常包含由该受试者产生的抗体或受试者中存在的抗原。包括此类抗体和/或抗原的典型样品在本领域中是已知的并且包括但不限于血液、血浆、血清、粪便、尿液、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的分泌物、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、器官、活体组织切片,并且还包括体外细胞培养物组分的样品,包括但不限于在培养基中细胞和组织生长所得的条件培养基,例如重组细胞和细胞组分。
“固体支持体”指这样的固相基质:本免疫测定中所用的HCV多肽(和/或本发明联合测定中的HCV抗原)与其共价结合或通过非共价方式例如疏水性吸附结合。
“免疫学反应性”或“免疫反应性”意指所关心的抗原与来自HCV感染的个体的生物样品中存在的抗-HCV抗体发生特异性反应,并且/或者所关心的抗-HCV抗体与来自HCV感染的个体的生物样品中存在的HCV抗原发生特异性反应。
“免疫原性”意指所关心的抗原在施用于个体时引发免疫反应。
“免疫复合物”意指当抗体与抗原上的表位结合时形成的组合物。
如本文所用,术语“标记”和“可检测标记”是指能够检测的分子,包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光物、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素或肝素)等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内表现出荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体示例包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、丹酰、伞形酮、二甲基吖啶酯(DMAE)、得克萨斯红、鲁米诺、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前,应当理解本发明并不限于特定制剂或方法参数,它们当然是可以改变的。还应当理解本文所用的术语仅旨在描述本发明的具体实施方案而并非旨在进行限制。
虽然与本文所述的那些相似或等同的多种组合物和方法可使用于本发明的实践中,但本文描述了优选的方法和材料。
如上所述,本发明基于以下发现:使用NS4a/经修饰的NS3HCV多肽提供用于检测HCV感染的优异试剂。NS4a/经修饰的NS3多肽保留构象表位并从而保留免疫反应性,并且可因此单独使用或者与用于精确且有效地检测HCV感染存在的其它HCV试剂组合使用。本文所述测定可用于检测由六个已知HCV基因型中的任一个导致的HCV感染。NS4a/经修饰的NS3多肽尤其可用于精确地检测早期HCV感染的诊断方法中。该方法可用于在HCV血清转化的早期阶段期间检测HCV感染,从而增大检测精确度并降低错误结果的发生率。
NS4a/经修饰的NS3多肽可在免疫测定中单独使用或者与其它HCV抗原(来自相同或不同的HCV基因型和分离物,例如HCV核心、E1、E2、NS3、5-1-1、c100-3和NS5序列的主要表位)组合使用。可使用下文所述的任何几种测定形式,例如但不限于利用结合有HCV抗原(和/或抗-HCV抗体)的固体支持体的测定形式,以单次测定方便地实施这些方法。
为了进一步理解本发明,以下将更详细的讨论NS4a/经修饰的NS3多肽以及蛋白质的制备和使用蛋白质的方法。
HCV蛋白质
HCV株的基因组含有约9,000至12,000个核苷酸的单一开放阅读框,其被转录为多蛋白。如图1和表1所示,裂解后HCV多蛋白产生至少十种不同的产物,其次序如下:NH2-核心-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。核心多肽存在于SEQ ID NO:1的第1-191位,其相对于HCV-1编号(关于HCV-1基因组,参见Choo等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451-2455)。进一步加工该多肽产生具有SEQ ID NO:1的约1-173个氨基酸的HCV多肽。包膜多肽E1和E2分别存在于SEQ ID NO:1的约第192-383位和SEQ ID NO:1的第384-746位。P7结构域存在于SEQ ID NO:1的约第747-809位。NS2是具有蛋白水解活性的膜内在蛋白,并且存在于多蛋白的SEQ ID NO:1的约第810-1026位。NS2与NS3(存在于SEQ ID NO:1的约第1027-1657位)组合,切割NS2-NS3的酰胺键,继而产生NS3N-末端并释放具有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性这两者的大的多蛋白。存在于SEQ ID NO:1的约第1027-1207位的NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。解旋酶活性存在于SEQ ID NO:1的约第1193-1657位。NS3释放出NS3辅因子(NS4a,存在于SEQ ID NO:1的约第1658-1711位)、两种蛋白质(NS4b存在于SEQ ID NO:1的约第1712-1972位,NS5a存在于SEQ ID NO:1的约第1973-2420位)和RNA-依赖性RNA聚合酶(NS5b存在于SEQ ID NO:1的约第2421-3011位)。多蛋白熟化的完成由NS3-NS4a连接处的自催化裂解引发,由NS3丝氨酸蛋白酶催化。
本发明的经修饰的NS3多肽相对于天然HCV NS3结构域的突变在于,SEQ ID NO:4的第15和16位氨基酸残基是赖氨酸(K)而非异亮氨酸(I)。该种亲水性氨基酸残基对疏水性氨基酸残基的置换产生更易溶解且更稳定形式的本发明的免疫测定试剂。
本发明的经修饰的NS3多肽也被突变以使蛋白酶活性受到抑制,从而抑制包括经修饰的NS3结构域的多肽(诸如NS4a/3多肽)的进一步裂解以及与经修饰的NS3多肽组合使用的额外的HCV蛋白质的催化裂解。NS3多肽可通过使NS3蛋白酶结构域的全部或部分缺失来进行修饰。另选地,蛋白水解活性可通过置换蛋白酶结构域的活性区域内的氨基酸来抑制。最终,将氨基酸添加到结构域的活性区域(使得催化位点被修饰)也将用于抑制蛋白水解活性。优选地,用于降低或消除蛋白酶活性而作出的修饰不破坏天然NS3或NS4a/3蛋白质的构象表位。
如上所述,蛋白酶活性存在于SEQ ID NO:1的约第1027-1207位氨基酸,其相对于全长HCV-1多蛋白编号(参见Choo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:2451-2455)。NS3蛋白酶和活性位点的结构是已知的。参见例如Lin,“HCV NS3-4A Serine Proteases”,载于“Hepatitis C Viruses:Genomes and Molecular Biology”,S.L.Tan编辑,HorizonBioscience(2006);Kim等人,Cell(1996)87:343-355;Tomei等人,J Virology(1993)67(7):4017-4026;De Francesco等人,Antivir.Ther.(1998)3:99-109;Koch等人,Biochemistry(2001)40:631-640。因此,天然序列的缺失或修饰通常发生在分子的活性位点处或附近。在蛋白酶的活性位点处对催化三联体(即H、D和/或S残基)进行优选的修饰,从而使蛋白酶失活。这些残基分别存在于SEQ ID NO:1的催化三联体的His1083、Asp1107和Ser1165位置,相对于全长HCV-1多蛋白编号(分别为SEQ ID NO:4的55、79和137位)。此类修饰将抑制NS3蛋白酶的蛋白水解裂解活性,同时保持免疫反应性。特别优选的置换在性质上是非保守的并且是中性的,诸如丙氨酸或甘氨酸对一个或多个氨基酸残基的置换通常存在于蛋白酶结构域的SEQ ID NO:1的第1083、1107和1165位(分别为SEQ ID NO:4的第55、79和137位)。本领域技术人员可容易地确定缺失从而破坏活性的NS3蛋白酶部分。
此外,这些位点处其它适当的氨基酸修饰可容易地由本领域技术人员基于HCVNS3蛋白酶的已知结构和功能确定,如描述于例如De Francesco等人,Antivir.Ther.(1998)3(增刊3):99-109;以及Schechter和Berger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157-162。具体地,已知NS3蛋白酶为丝氨酸蛋白酶并且蛋白分解机制基于丝氨酸对靶标肽键的亲核攻击。在多种情况下,基团的亲核特性因组氨酸的存在而得到改善,由天冬氨酸盐保持为“质子受体状态”。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸盐排列的侧链形成了对大部分丝氨酸蛋白酶常见的催化三联体。丝氨酸蛋白酶的活性位点成形为多肽底物在此结合的裂缝。Schechter和Berger,Biochim.Biophys.Res.Commun.(1967)27:157-162标记了多肽底物从N末端到C末端的氨基酸残基(Pi,…,P3,P2,P1,P1',P2',P3',…,Pj)及其相应结合亚位点(Si,…,S3,S2,S1,S1',S2',S3',…,Sj)并且发现在P1与P1'之间催化裂解。NS3蛋白酶采用胰凝乳蛋白酶样折叠并且包括极长的暴露于溶剂的底物结合位点,符合极长肽底物的要求(P6-P4')。NS3蛋白酶优选底物P1位置的半胱氨酸残基。因此,基于如上所述和本领域的已知结构和功能,本领域技术人员可容易地确定用于破坏NS3蛋白酶的蛋白水解活性的其它氨基酸置换、添加和缺失。
NS3蛋白水解活性的存在与否可用本领域技术人员已知的方法确定。例如,蛋白酶活性或其缺乏可使用以下实施例中所述的方法和使用本领域熟知的测定来确定。参见例如Takeshita等人,Anal.Biochem.(1997)247:242-246;Kakiuchi等人,J.Biochem.(1997)122:749-755;Sali等人,Biochemistry(1998)37:3392-3401;Cho等人,J.Virol.Meth.(1998)72:109-115;Cerretani等人,Anal.Biochem.(1999)266:192-197;Zhang等人,Anal.Biochem.(1999)270:268-275;Kakiuchi等人,J.Virol.Meth.(1999)80:77-84;Fowler等人,J.Biomol.Screen.(2000)5:153-158;以及Kim等人,Anal.Biochem.(2000)284:42-48。
已测定了多种HCV株和分离物的核酸和氨基酸序列,包括HCV多蛋白的各种区域的核酸和氨基酸序列,包括核心、NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b基因和多肽。例如,分离物HCV J1.1描述于Kubo等人(1989)Japan.Nucl.Acids Res.17:10367-10372;Takeuchi等人(1990)Gene 91:287-291;Takeuchi等人(1990)J.Gen.Virol.71:3027-3033;以及Takeuchi等人(1990)Nucl.Acids Res.18:4626。两种独立分离物HCV-J和BK的完整编码序列分别通过Kato等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524-9528以及Takamizawa等人,(1991)J.Virol.65:1105-1113描述。
描述HCV-1分离物的出版物包括Choo等人(1990)Brit.Med.Bull.46:423-441;Choo等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451-2455以及Han等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1711-1715。HCV分离物HC-J1和HC-J4描述于Okamoto等人(1991)Japan J.Exp.Med.60:167-177。HCV分离物HCT 18.about.、HCT 23、Th、HCT 27、EC1和EC10描述于Weiner等人(1991)Virol.180:842-848。HCV分离物Pt-1、HCV-K1和HCV-K2描述于Enomoto等人(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.170:1021-1025。HCV分离物A,C,D&E描述于Tsukiyama-Kohara等人(1991)Virus Genes 5:243-254。
根据本发明的NS4a/经修饰的NS3多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。序列从N末端到C末端方向包括N-末端Met,氨基酸2-14为NS4a,接着为间插氨基酸SGS,之后为氨基酸18-646即经修饰的NS3(氨基酸32和33为赖氨酸并且氨基酸154为丙氨酸)。
抗-HCV抗体
抗-HCV抗体(针对相同或不同HCV结构域表位)可包括例如HCV抗-核心抗体。本发明中有用的具体抗-核心抗体的示例包括但不限于以下抗体分子,例如针对存在于SEQ IDNO:1的氨基酸10-53、SEQ ID NO:1的氨基酸10-45、SEQ ID NO:1的氨基酸67-88、SEQ IDNO:1的氨基酸120-130之间的核心区域中的表位的单克隆抗体,或针对以下核心表位中任一种的抗体,这些核心表位在例如美国专利No.6,630,298;美国专利No.6,150,087;美国专利No.6,346,375;Houghton等人,美国专利No.5,350,671;Chien等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011-10015;Chien等人,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33-39;Chien等人,国际公布No.WO 93/00365;以及Chien,D.Y.,国际公布No.WO94/01778中鉴定,其公开内容全文以引用方式并入本文中。
在本发明示于图6中的一个实施方案中,快速捕获配体免疫测定利用NS4a/经修饰的NS3多肽进行。将样品与如下文进一步所述可能存在于固体支持体上的抗原组合。如果用HCV感染样品,则存在于固体支持体上的那些表位的HCV抗体将与固体支持体组分结合。检测是通过可检测标记(如图6所示的辣根过氧化物酶(HRP))与抗原/抗体复合物的成员附接进行的。该附接可能是以共价方式,或通过可检测标记的抗体的随后结合(如在标准夹心测定中),或通过反应产物可检测的酶反应。可检测的标记可包括但不限于发色团、抗体、抗原、酶、酶反应化合物(其裂解产物是可检测的)、罗丹明或罗丹明衍生物、生物素、亲和素、链霉亲和素、荧光化合物、化学发光化合物,例如二甲基吖啶酯(DMAE)、这些标记的衍生物和/或组合。可方便地使用能够检测人IgG分子存在的一种可检测标记的抗人抗体。
在本发明示于图7中的另一个实施方案中,快速捕获配体免疫测定利用NS4a/经修饰的NS3多肽和抗-HCV抗体进行。将样品与如下文进一步所述可能存在于固体支持体上的多肽和抗-HCV抗体组合。如果用HCV感染样品,则存在于固体支持体上的那些表位的HCV抗体将与固体支持体组分结合,并且与固体支持体上的抗体表位发生免疫反应的HCV抗原也将与固体支持体组分结合。检测是通过可检测标记(如图7所示的辣根过氧化物酶(HRP))与抗原/抗体复合物的成员的附接进行的。该附接可能是以共价方式,或通过可检测标记的抗体的随后结合(如在标准夹心测定中),或通过反应产物可检测的酶反应。可检测的标记可包括但不限于发色团、抗体、抗原、酶、酶反应化合物(其裂解产物是可检测的)、罗丹明或罗丹明衍生物、生物素、亲和素、链霉亲和素、荧光化合物、化学发光化合物,例如二甲基吖啶酯(DMAE)、这些标记的衍生物和/或组合。可方便地使用能够检测人IgG分子存在的一种可检测标记的抗人抗体。
此类测定为HCV联合测定,能够检测可存在于感染有HCV的个体的生物样品中的HCV抗原和HCV抗体两者。
HCV抗原的制备
如上所述,通常用重组方法制备本发明的分子。因此,可以用标准分子生物学技术制备用于本发明的编码HCV抗原的多核苷酸。例如,编码上述分子的多核苷酸序列可以用重组方法获得,例如通过筛选来自表达基因的细胞的cDNA和基因组文库,或通过从已知含有该基因的载体中衍生出该基因。此外,用本领域所述的技术,例如Houghton等人的美国专利No.5,350,671中所述的方法,从病毒核酸分子直接分离出所需的基因。也可合成而非克隆制备所关注的基因。可用适当的特定序列的密码子设计该分子。然后从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整的序列,并装配入完整的编码序列中。参见例如Edge(1981)Nature 292:756;Nambair等人(1984)Science 223:1299;以及Jay等人(1984)J.Biol.Chem.259:6311。
因此,特定核苷酸序列可从携带所需序列的载体获得,或用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术完全或部分合成来获得,例如在适当情况下使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。参见例如Sambrook,出处同上。具体地,获得编码所需的序列的核苷酸序列的一个方法是通过使在常规自动多核苷酸合成仪中产生的合成性重叠寡核苷酸的互补物组退火,然后用适当的DNA连接酶连接,并通过PVR扩增连接的核苷酸序列。参见例如Jayaraman等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4084-4088。另外,在本发明中可使用寡核苷酸定向合成(Jones等人,(1986)Nature 54:75-82)、既有核苷酸区域的寡核苷酸定向诱变(Riechmann等人(1988)Nature332:323-327和Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534-1536)以及用T.sub.4DNA聚合酶进行的酶促补平带缺口的寡核苷酸(Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033),以提供抗原结合能力变化或提高的和/或免疫原性降低的分子。
用于产生期望核苷酸序列的突变体或类似物(诸如NS3)或其它HCV抗原的方法是熟知的。参见例如Dasmahapatra等人,美国专利No.5,843,752和Zhang等人,美国专利5,990,276。通过缺失编码所关注多肽的序列的一部分、通过***序列和/或通过置换该序列内的一个或多个核苷酸,可以制备用于免疫测定的经修饰的NS3和其它HCV蛋白质。用于修饰核苷酸序列的技术,例如定点诱变等是本领域技术人员所熟知的。参见例如Sambrook等人,出处同上;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoder等人(1987)BioTechniques 5:786;Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100:468;Dalbie-McFarland等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:6409。
一旦制备或分离了编码序列,就可将此类序列克隆入任何合适的载体或复制子中。对本领域技术人员而言,各种克隆载体是已知的,并且适当的克隆载体的选择只是选择问题。合适的载体包括但不限于:质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或在与适当的控制元件结合时能够复制的病毒。
然后将克隆序列置于合适的控制元件的控制下,这取决于待用于表达的***。因此,可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子的控制下,以便将所关注的DNA序列通过合适的转化体转录成RNA。编码序列可以或不可包含信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工中除去)。参见例如美国专利No.4,431,739;4,425,437;4,338,397。
除了控制序列之外,可能还需要加入允许相对于宿主细胞的生长而调控序列表达的调控序列。调控序列是本领域的技术人员已知的,并且示例包括响应于化学或物理刺激(包括存在的调控化合物)而引起基因表达的开启或关闭的那些。其它类型的调控元件也可存在于载体中。例如,增强子元件可在本文用于增大构建体的表达水平。示例包括SV40早期基因增强子(Dijkema等人(1985)EMBO J.4:761),衍生自劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子(Gorman等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)和衍生自人CMV的元件(Boshart等人(1985)Cell41:521),诸如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利5,688,688)。表达盒还可包括在合适的宿主细胞中自主复制的复制起点、一种或多种可选择的标记、一个或多个限制性位点、高拷贝数的潜能和强启动子。
构建表达载体,使得特定编码序列位于具有适当调控序列的载体中,与控制序列有关的编码序列的位置和取向使得编码序列在控制序列的“控制”下转录(即与控制序列处的DNA分子结合的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码所关注分子的序列进行修饰来实现此目的。例如,在一些情况中可能需要修饰该序列,从而使其可附接到适当取向的控制序列,即维持阅读框。在***到载体中之前,控制序列和其它调控序列可能连接于编码序列。另选地,可将编码序列直接克隆到已包含控制序列和合适的限制性位点的表达载体中。
所述分子可以在各种***中表达,包括都是本领域熟知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达***。例如,昆虫细胞表达***如杆状病毒***是本领域技术人员已知的,并且描述于如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station BulletinNo.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达***的材料和方法可以试剂盒形式商购获得,尤其可从Invitrogen,San Diego Calif.(“MaxBac”试剂盒)购得的。类似地,细菌和哺乳动物细胞表达***是本领域熟知的,并且描述于例如Sambrook等人(出处同上)。酵母表达***也在本领域中是已知的并且描述于例如Yeast Genetic Engineering(Barr等人编辑,1989)Butterworths,London。
许多用于以上***的适当宿主细胞也是已知的。例如,哺乳动物细胞系是本领域已知的,并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖化细胞系,例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞等。类似地,在本发明表达构建体中也可使用细菌宿主,诸如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。可用于本发明的酵母宿主特别包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆弱克鲁维酵母菌(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。可与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞特别包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
可用本领域熟知的各种基因送递技术,将包含所关注核苷酸序列的核酸分子稳定地整合进宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中稳定的游离基因的元件上维持。参见例如美国专利5,399,346。
根据所选的表达***和宿主,在表达蛋白质的条件下,通过使如上所述的表达载体转化的宿主细胞生长来产生该分子。然后从宿主细胞分离出表达的蛋白质并纯化。如果表达***将蛋白质分泌到生长培养基中,则可直接从培养基中纯化产物。如果没有分泌,可从细胞裂解物中分离产物。适当的生长条件和回收方法的选择都是本领域技术人员能力之内的。
已描述了各种HCV抗原的重组制备。参见例如国际公布No.WO 94/01778、WO 93/00365、WO 04/00547和WO 01/38360;美国专利No.5,350,671、5,683,864、6,346,375、6,150,087、6,514,731、6,428,792和6,632,601;Chien等人,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33-39;Chien,D.Y.,国际公布No.WO 94/01778;Chien等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011-10015;其公开内容全文都以引用方式并入本文中。下文描述了产生NS4a/经修饰的NS3多肽的优选方法。
免疫诊断测定
一旦制备出HCV抗原,就可将其实际用于采用已知的抗原检测抗体的任何测定形式中。所有这些测定的共同特征是将该抗原与怀疑含有HCV抗体的生物样品在允许抗原与样品中存在的任何此类抗体结合的条件下接触。此类条件通常是生理温度、pH和离子强度(使用过量抗原)。将抗原与样本一起培养,然后检测由抗原构成的免疫复合物。
免疫测定的设计可以作出大量改变,许多形式都是本领域所熟知的。例如,方案可使用固体支持体或免疫沉淀。大多数测定涉及使用标记的抗体或多肽;这些标记可为例如酶、荧光素、化学发光标记、放射性或染料分子,如下文详细讨论的那样。扩增来自免疫复合物的信号的测定也是已知的,其示例为使用生物素及亲和素的测定以及酶标记的其介导的免疫测定,如ELISA测定。
免疫测定可为但不限于异源或同源形式,以及标准或竞争性类型。在异源形式中,通常将多肽结合到固体基质或支持体,以利于在培养后将样品与多肽分离。就本发明的目的而言,固体支持体可为任何材料,它是不溶性的基质,并可具有刚性或半刚性的表面。示例性的固体支持体包括但不限于基质如硝化纤维素(例如以膜或微量滴定孔形式);聚氯乙烯(例如板或微量滴定孔);聚苯乙烯胶乳(例如珠或微量滴定板);聚偏氟乙烯;重氮化纸;尼龙膜;活化的小珠、磁力感应小珠等。具体的支持体包括板、小球、盘、毛细管、中空纤维、针、钉、固体纤维、纤维素珠、微孔玻璃珠、硅胶、聚苯乙烯珠(任选地与二乙烯基苯交联)、接枝的共聚珠、聚丙烯酰胺珠、胶乳珠、二甲基丙烯酰胺珠(任选地与N-N'-二-丙烯酰乙烯二胺交联)和用疏水聚合物包膜的玻璃颗粒。
如果需要,可容易地将待加入固体支持体的分子官能化,以产生苯乙烯或丙烯酸酯部分,从而能够让该分子掺入聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或其它聚合物诸如聚酰亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚乙烯基、聚二乙炔、聚苯撑-乙烯撑、多肽、多糖、聚砜、聚吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、环氧树脂、石英玻璃、硅胶、硅氧烷、多磷酸盐、水凝胶、琼脂糖、纤维素等中。
如果在测定中使用多于一种抗原,例如NS4a/经修饰的NS3多肽和另一种HCV抗原,则抗原可设置在相同的固体基质上或在测定中组合的不同固体基质上。因此,例如,抗原可作为离散实体存在于例如板上,或者可存在于例如用于所关注测定的一起加入的单个微珠上。
在一种情况下,如图6所示,首先在使分子充分地固定于支持体的合适的结合条件下,使固体支持体与HCV抗原诸如NS4a/经修饰的NS3多肽(在本文总称为“固相组分”)反应。有时,可通过首先将抗原与具有较好固相结合特性的蛋白质偶联,提高在支持体上的固定。合适的偶联蛋白包括但不限于大分子诸如血清白蛋白,包括:牛血清白蛋白(BSA)、钥孔戚血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和本领域技术人员熟知的其它蛋白质。可用于将分子与支持体结合的其它试剂包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物等。此类分子和将这些分子与抗原偶联的方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如Brinkley,M.A.(1992)Bioconjugate Chem.3:2-13;Hashida等人(1984)J.Appl.Biochem.6:56-63;以及Anjaneyulu和Staros(1987)International J.of Peptideand Protein Res.30:117-124。
在使固体支持体与固相组分反应后,通过洗涤从支持体上移除任何未固定的固相组分,然后在适合的结合条件下,将支持体结合的组分与怀疑含有HCV抗体(本文将其总称为“配体分子)的生物样品接触。如果HCV抗体存在于样品中,其将与HCV抗原形成复合物。在洗涤移除任何未结合的配体分子后,加入可检测标记的抗体诸如抗异源(如抗人)抗体,其识别抗-HCV抗体上的表位。这些抗体因形成复合物而结合。
在本领域熟知的进一步测定形式中,链霉亲和素包被的固体支持体与结合经修饰的NS3的生物素标记的抗体反应。在合适的结合条件下加入生物样品。如果HCV抗体存在于样品中,其将与HCV抗原形成复合物。在洗涤移除任何未结合的配体分子后,加入如上所述的可检测标记的抗体。
测试样品以匀质形式与溶液中的抗原组合温育。例如,这可在使形成的任何抗原-抗体复合物沉淀的条件下进行。匀质测定用的标准和竞争性方式也是本领域已知的。
在标准形式中,直接监测形成抗体-抗原复合物的HCV抗体的量。这可以通过如下方式实现:确定识别抗-HCV抗体上的表位的标记的抗异种(例如抗人)抗体是否因复合物形成而结合。在竞争性形式中,通过监测对复合物中已知量的标记的抗体(或其它竞争性配体)的结合的竞争性影响,推导样品中HCV抗体的量。
更具体地,根据形式,通过许多已知技术中的任何一种检测所形成的含抗-HCV抗体(或在竞争性测定的情况下,竞争抗体的量)的复合物。例如,可以用与标记(例如酶标记)复合的抗异源Ig的缀合物来检测复合物中未标记的HCV抗体。在免疫沉淀或凝集测定形式中,HCV抗原和抗体之间的反应形成从溶液或悬浮液沉淀的网络,并形成可见层或沉淀膜。如果在生物样品中不存在抗-HCV抗体,则不形成可见的沉淀物。如上所述的测定试剂(包括具有结合的抗体和抗原以及与捕获样品反应的抗体和抗原的免疫测定固体支持体)可提供于试剂盒中,并附有合适的说明书和其它必需的试剂,从而进行如上所述的免疫测定。试剂盒通常在分开的容器中包含抗原和/或抗体的组合(其可结合到固体支持体或与用于使它们与固体支持体结合的试剂分开)、对照抗体和/或抗原制剂(阳性和/或阴性)、标记的抗体和/或抗原(当测定形式需要其时)和产生信号的试剂(例如酶底物)(如果标记不直接产生信号)。实施测定的说明书(例如书面文字、磁带、VCR、CD-ROM等)通常包括在试剂盒中。试剂盒还可视所用的特定免疫测定而定,包含其它包装的试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可利用这些试剂盒实施标准免疫测定法,例如如上所述的那些。
同样,抗-HCV抗体事实上也可用于任何测定形式中,所述测定形式组合采用检测抗原的已知抗体和检测抗体的已知抗原。如图7所示,使固体支持体与HCV抗原(示为NS4a/经修饰得NS3多肽)反应,并且也与抗-HCV核心抗体反应。
III.实验
下文是用于实施本发明的具体的实施方案的实施例。实施例仅为了进行示意性的说明,而不意欲以任何方式限制本发明的范围。
尽管力求使所用数值(例如量、温度等)达到精确,但当然应允许某些实验误差及偏差。
NS4a/经修饰的NS3多肽构象抗原的克隆、表达和纯化使用于早期检测丙型肝炎病毒特异性抗体的免疫测定的灵敏度提高。
HCV NS4a/NS3.KK突变体丝氨酸蛋白酶被基因工程改造成在酿酒酵母(S.cerevisiae)(AD3菌株)中直接表达。将表达盒克隆到pBS24.1酵母表达载体中(图2)。pBS24.1酵母穿梭载体包含在酵母中自主复制的2μ序列和酵母基因leu2-d和URA-3作为选择性标记。细菌中质粒复制需要β-内酰胺酶基因和复制的ColE1起点。抗原/蛋白质在杂合ADH2/GAPDH启动子的控制下表达。NS4a/NS3.KK突变体抗原(参见图3)利用通过柔性SGS(Ser-Gly-Ser)序列附接到NS3的N-末端的NS4a蛋白质(称为最小结构域)的13aa片段。该序列使得NS4a能够在蛋白酶内折叠成口袋以形成酶促活性分子。为避免归因于NS3蛋白酶活性的自水解,蛋白酶的催化三联体的(SEQ ID NO:1的)Ser1165突变成Ala,如前在US 7,491,808B2中所述。此外,将一对带电Lys残基引入蛋白酶的N末端(SEQ ID NO:1的HCV aa1043和1044),替代Ile残基,以改善经纯化NS4a/NS3分子的溶解度。US 7,491,808B2中所述的NS3结构域在Tyr1428Pro和Ser1429Ile处包含突变(参照SEQ ID NO:1)(缩写为PI突变,引入以消除蛋白酶裂解位点)。在本文的NS4a/NS3.KK突变体中消除这些PI突变并且返回于天然HCV1a序列,Tyr1428和Ser1429,原因是丝氨酸蛋白酶的活性已被消除。SEQ ID NO:1第1428位的Pro置换可能对NS4a/NS3分子的构象有去稳定效应。
图4示出表达质粒pd.4a.t.ns3.1165.KK(SEQ ID NO:2)的环形结构图。
克隆
质粒pd.4a.t.ns3.1165.KK编码具有三个突变(Ile1043Lys、Ile1044Lys、Ser1165Ala)的NS4a-转-NS3,在如下在四步过程中产生。
首先,将以下DNA片段连接在一起:(a)Avr2-ClaI去磷酸化载体,由pSP72.HindIII-Cla.4a.t.ns3.1165#14制得,如US 7,491,808中所述。(803bp HindIII-ClaI***序列提供序列SEQ ID NO:5:ACAAAACAAA,起始子ATG之后为NS4的aa 1678至1690的密码子、Ser-Gly-Ser转序列和NS3aa1029至1274(参照SEQ ID NO:1)。氨基酸1165由Ser突变为Ala。pSP72为得自Promega(Madison,WI)、GenBank/EMBL登录号X65332的商业载体);(b)合成寡核苷酸(AB-1和AB-2),具有Avr2-BglI限制性末端,编码HCV aa 1040至1046并引入期望的Ile1043Lys和Ile1044Lys突变;(c)683bp BglI-ClaI DNA片段,由pSP72.HindIII-Cla.4a.t.ns3.1165#14凝胶纯化;BglI-ClaI片段编码HCV NS3aa 1046至1274。
AB-1
SEQ ID NO:6:CTAGGGTGCAAGAAGACCAGCCTAAC
AB-2
SEQ ID NO:7:AGGCTGGTCTTCTTGCACC
将连接混合物转化到HB101-感受态细胞中,并铺在含有100ug/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上。单个克隆的少量制备物分析鉴定了推定的阳性,将其扩增和测序。具有正确序列的克隆被命名为pSP72.HindIII-Cla.4a.t.ns3.1165.KK#1。将等分试样的质粒随后转化到大肠杆菌菌株SCS110中,以避免阻断后续克隆步骤所需的ClaI限制性位点的dam甲基化。(pT7HCV不同于Choo等人HCV SEQ ID NO:1之处仅在于,9位氨基酸残基为R而非K并且11位氨基酸残基为T而非N。)
第二,出于克隆ClaI-SalI片段的目的,将为天然HCV1a序列(SEQ ID NO:1)的NS3aa 1274-1657提供密码子的以下DNA片段连接在一起:(a)HindIII-SalI去磷酸化载体,由pSP72制得;(b)803bp HindIII-ClaI限制性片段,由pSP72.HindIII-Cla.4a.t.ns3.1165#14制得;(c)1121bp ClaI-AvaIII限制性片段,编码NS3aa 1274至aa1647,由pT7HCV制得,其包含整个HCV1a基因组(参见SEQ ID NO:1)的pUC18构建体,如US 7,449,566B2中所述(另参见:Michael Vajdy等人,J of General Virology,2006:87,第2253-2262页);(d)两个AvaIII-SalI寡核苷酸,avsal-1和avsal-2,其形成至aa 1657的NS3序列并且还编码两个终止密码子。
avsal-1
SEQ ID NO:8:TGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGTGATAAG
avsal-2
SEQ ID NO:9:
TCGACTTATCACGTGACGACCTCCAGGTCGGCCGACATGCA
将连接混合物转化到HB101-感受态细胞中,并铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上。对单个克隆的少量制备物的分析鉴定出了推定的阳性,将其扩增和测序。具有正确序列的克隆被命名为pSP72.4a.t.ns3.1165#2。将等分试样的质粒随后转化到大肠杆菌菌株SCS110中,以避免阻断ClaI限制性位点的dam甲基化。
第三,为了将整个4a.t.ns3.1165.KK编码序列克隆到亚克隆载体中,将以下DNA片段连接在一起(因为将其直接克隆到酵母表达载体中的尝试并未取得成功):(a)HindIII-SalI去磷酸化载体,由pSP72制得;(b)803bp HindIII-ClaI片段,得自pSP72.HindIII-Cla.4a t.ns3.1165.KK#1;(c)1158bp ClaI-SalI片段,得自pSP72.4a.t.ns3.1165#2。将连接混合物转化到HB101-感受态细胞中,并铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上。对单个克隆的少量制备物的分析鉴定出了阳性克隆,命名为pSP72.4a.t.ns3.1165.KK#3。
最终,将以下DNA片段连接在一起以形成酵母表达质粒:(a)BamHI-SalI去磷酸化pBS24.1酵母表达载体;(b)用于酵母杂合启动子ADH2/GAPDH的1366bp BamHI-HindIII片段;(c)1961bp HindIII-SalI片段,得自pSP72.4a.t.ns3.1165.KK#3。将连接混合物转化到HB101-感受态细胞中。在小筛选分析之后,具有3325bp的预期BamHI-SalI限制性片段的克隆被鉴定为pd.4a.t.ns3.1165.KK#7(图4)。
酵母转化
利用S.c.EasyComp转化试剂盒(得自Invitrogen,Carlsbad,CA),采用pd.4a.t.ns3.1165.KK#7转化酿酒酵母菌株AD3(MATa,leu2,ura3-52,prb1-1122,pep4-3,prc1-407,gal2,[cir0],::pDM15(pGAP/ADR1::G418R),::Yip5ΔleuAD)。将在缺乏尿嘧啶的琼脂平板(具有8%葡萄糖的Ura-琼脂平板)上生长的转化体划线成单个菌落,并盖到Leu-8%葡萄糖琼脂平板上,以增加质粒拷贝数。在30℃下使含7.1%葡萄糖的Leu-液体起始培养物生长24小时,然后以1:20稀释到YEPD(1%酵母提取物,2%细菌蛋白胨,2%葡萄糖)培养基中。使细胞在30℃和25℃生长48小时。在裂解缓冲液中用玻璃珠裂解等分试样的细胞,用于表达测试。根据考马斯蓝染色检测,在酵母中高水平表达重组蛋白质,并使用单克隆抗体抗-C33C 4D-1,通过免疫印迹分析证实。(抗体描述于Sansan Lin等人,Journalof Clinical Microbiology,2005年8月,第3917-3924页。)
重组HCV 4a.t.NS3.1165.KK蛋白质的纯化(对于转突变体KK为“TMKK”)
TMKK蛋白质(NS4a/经修饰的NS3多肽)如下纯化:收获得到表达NS4a.t.NS3.1165KK转突变体的酿酒酵母细胞并使其悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA,Roche完全蛋白酶抑制剂片剂),并用玻璃珠以1:1:1的细胞:缓冲液:0.5mm玻璃珠的比率在Dyno-Mill(Wab Willy A.Bachofon,Basel,Switzerland)或等同装置中裂解。在裂解35分钟之后,通过显微术在视觉上检查裂解物的样品,以证实细胞破裂完成至少95%。收集裂解物并在4℃和17,700×g下离心30分钟。并将含有不溶性蛋白质的沉淀添加到提取缓冲液(50mM Tris-Cl pH 8.0,1M NaCl,10mM EDTA;2ml/g起始细胞沉淀重量)中,并在烧瓶中于室温搅拌30分钟。使悬浮液在4℃和30,100×g下离心30分钟,并且收集包含可溶TMKK的上清液以供进一步纯化。
将固体硫酸铵添加到上清液至30%的浓度并在冰上搅拌三小时。通过在4℃和30,100×g下离心30分钟来收集沉淀。将沉淀重悬于1×PBS(0.5ml/gm起始沉淀重量),在室温小搅拌30分钟,然后用稀释缓冲液#1(50mM Tris-Cl pH 7.5,50mM NaCl,5mM DTT,10%甘油)稀释4倍。将经稀释的悬浮液在4℃下轻轻搅拌过夜。
在搅拌过夜之后,将悬浮液在4℃和30,100×g下离心。收集上清液,用稀释缓冲液#2(50mM MES pH 6.0,5mM DTT,0.02%Tween-20,10%甘油)稀释两倍并施加到SP琼脂糖快速流式离子交换柱(GE Healthcare)。在装载完成之后,用SP柱缓冲液(50mM MES pH6.0,37.5mM NaCl,5mM DTT,0.02%Tween-20,10%甘油)洗涤柱,从柱缓冲液中NaCl梯度增加至多0.7M的柱中洗脱出TMKK。基于考马斯亮蓝染色的SDS PAGE凝胶的视觉检测,对级分进行合并。
将包含SP琼脂糖纯化的TMKK的合并物用稀释缓冲液#3(50mM Tris-Cl pH 8.0,5mM DTT,10%甘油)稀释2倍并将pH调节至8.0。将样品施加到用柱缓冲液(50mM Tris-ClpH 8.0,150mM NaCl,5mM DTT,0.02%Tween-20,10%甘油)平衡的羟基磷灰石II型柱(Bio-Rad)中。在装载完成之后,将柱用包含200mM NaCl的柱缓冲液洗涤。收集负载和洗涤的级分,直至在280nm处测量的吸光度返回至基线。用再生缓冲液(500mM NaPO4pH 7.0,150mMNaCl,5mM DTT,0.02%Tween-20,10%甘油)解吸柱。通过SDS-PAGE分析级分,并合并包含经纯化TMKK蛋白质的流出物和洗涤级分。利用30kD截断浓缩器将合并物浓缩至1至2mg/ml,然后在-80℃下储存。
试剂(1)的制备
碱性缓冲溶液通过将1.627g/L磷酸氢二钠、1.162g/L磷酸二氢钾、29.22g/L氯化钠、0.336g/L依地酸二钠、1.0g/L酪蛋白酸钠和0.5ml/L ProClin添加到纯化水中,并将pH调节至约7.3来制备。样品稀释剂通过将5mL/L TWEEN20TM、20mL/L SDS溶液(1%)、0.5g/L酵母提取物和10g/L BSA溶液(30%)添加到合适量的上述碱性缓冲溶液中,将pH调节至6.4,并使所得溶液通过0.22μm膜过滤器来制备。
以相同的方式,标记缓冲溶液通过将3.28g/L磷酸二氢钠、13.28g/L磷酸钾、17.56g/L氯化钠、0.372g/L依地酸二钠、10g/L葡聚糖T2000、10g/L蔗糖、10g/L PVP(k=30)、0.5mL/L ProClin、20g/L BSA、3g/L酪蛋白酸钠、20mL/L灭活的马血清、10mL/L灭活的小鼠血清、10mL/L TRITON X-100TM、3g/L C14APS和2g/L C16TAB添加到纯化水中,将pH调节至约7.2,并使所得溶液通过0.22μm膜过滤器来制备。
底物缓冲溶液通过将4.936g/L无水柠檬酸以及6.895g/L磷酸氢二钠溶解于纯化水中,将pH调节至约4.9,并使所得溶液通过0.22μm膜过滤器来制备。底物试剂通过将邻苯二胺二盐酸盐的13mg片剂溶解于6mL的底物缓冲溶液中制备。
作为反应终止剂,使用4N硫酸。
清洁缓冲溶液通过将1.09g/L磷酸二氢钠、0.31g/L磷酸氢钾、8.2g/L氯化钠、1ml/L Tween20和0.5mL/L ProClin添加到纯化水中,并使所得溶液通过0.22μm膜过滤器来制备。
用于抗原固化的包被缓冲溶液通过将5.45g/L磷酸二氢钠、1.55g磷酸氢钾和0.744g/L依地酸二钠添加到纯化水中制备。向包被缓冲溶液添加各自为2.0μg/mL的HCVTMKK重组抗原或c200重组抗原。
阻断缓冲溶液通过将合适量的磷酸盐缓冲溶液、10g/L酪蛋白酸钠和30g/L蔗糖添加到纯化水中来制备。
作为标记,使用购自Institute of Immunology(Tokushu Meneki Kenkyusho)的小鼠抗人IgG单克隆抗体(2AHIGG2),其利用“(LK11)过氧化物酶标记试剂盒NH2(DojinKagaku Kenkyusho)”采用HRP进行标记。
实施例1
将用于固化抗原的包被缓冲溶液(包含HCV TMKK重组抗原)以200μL/孔的量分配,并且在4℃静置一整夜。在移除孔中的液体之后,将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤一次。然后,将阻断缓冲溶液以300μL/孔的量分配,并且在室温下静置多于四小时。在移除孔中的液体之后,将孔用清洁缓冲溶液洗涤一次,然后干燥以制备固相板。
分别将175μL/孔的样品稀释剂和25μL的各个样品(U.S.ProMedDx的市售人血清)分配到固相板中,用板混合器对其进行搅拌并在37℃下温育一小时。在移除孔中的液体之后,将孔用清洁缓冲溶液洗涤五次。接着,将用标记稀释缓冲溶液稀释5,000倍的含有标记的液体(即,HRP标记的小鼠抗人IgG单克隆抗体)以200μL/孔的量分配,将其在37℃下温育30分钟。在移除孔中的液体之后,将孔用清洁缓冲溶液洗涤五次。然后,将通过将过氧化氢(30%)以0.1%的量添加于底物缓冲溶液中而制备的底物液体以200μL/孔的量分配,并且在室温下反应30分钟。在反应终止溶液以50μL/孔的量分配之后,使用读板机(MolecularDevices的SpectraMax340PC)通过双波长测量(490nm主波长和650nm次波长)来测量吸光度。测量值在表2中示出。
比较例1
光度测定以与实施例1相同的方法实施,不同之处是使用包含c200重组抗原的液体而非使用HCV TMKK重组抗原作为用于抗原固化的包被缓冲溶液。测量值在表2中示出。
比较例2
根据说明书手册,使用RIBA3(Ortho Diagnostic Systems)来检测得自以上样品的抗体。结果在表2中示出。在表中,括号中的样品号是ProMedDx指定的样品号。“NHS”是正常人血清并且用作阴性对照。
如表2中所示,用实施例1中的TMKK检测或量化丙型肝炎病毒示出比用比较例1的c200更高的灵敏度。具体地,丙型肝炎病毒抗体的检测用比较例2中的样品4至23加以确认。然而,用比较例1中的c200定量示出的灵敏度不合理的低(特别是对于样品4、5和14),而用实施例1的TMKK定量则示出高检测灵敏度。不存在丙型肝炎病毒抗体的样品,例如样品1至3甚至在实施例1中表现出了较低的量化值。检测或量化的精度没有问题。需注意,样品10的RIBA的c33c阳性结果可能是由于交叉反应。
实施例2
光度测定以与实施例1相同的方法实施,不同之处是使用通过基因筛选确认丙型肝炎病毒感染的血清转化组(ZeptoMetrix)的组“6212”、“6215”和“9058”中的样品。测量值在表3至5中示出。随着样品(例如“-1”、“-2”)的分支编号增大,其表示样品的后期血液采集数据,即代表更快发展的丙型肝炎病毒感染。各个样品的RIBA3测量的已知结果也在表3至5中示出。
比较例2
光度测定以与比较例1相同的方法实施,不同之处是使用血清转化组(ZeptoMetrix)的组“6212”、“6215”和“9058”中的样品。测量值在表3至5中示出。
对处于感染早期阶段的样品(如表3所示的组6212-02和6212-03中),用实施例2中的TMKK检测抗体取得成功,而用比较例2中的c200和用RIBA3却失败。此外,使用实施例2中的TMKK和比较例2中的c200检测组6212-04和6212-05上的抗体取得成功,然而,使用实施例2中的TMKK的检测灵敏度更高。
如表4中所示,用实施例2中的TMKK检测组6215-04上的抗体取得成功,然而,用比较例2中的c200检测却失败。因为本发明试剂的灵敏度等于或大于已知具有相对较高检测灵敏度的核心抗原(C22),可以证实如果使用本发明的试剂,则与核心抗原组合使用并不总是必须的。
如表5中所示,用实施例2中的TMKK和用RIBA3检测处于感染早期阶段的样品(例如组9058-04)上的抗体取得成功,但用比较例2中的c200失败。样品是如RIBA3结果所示的核心抗体血清转化,表明与已知具有相对较高检测灵敏度的核心抗原(C22)组合使用的适用性。此外,用实施例2中的TMKK和比较例2中的c200两者检测组9058-05上的抗体取得成功。然而,使用实施例2中的TMKK的灵敏度更高。
试剂(2)的制备
除了以下所述试剂之外,使用以上提及的“试剂(1)的制备”中所制备的试剂。
样品稀释剂通过将5mL/L TWEEN20TM、20mL/L SDS溶液(1%)、0.5g/L酵母提取物、10g/L BSA溶液(30%)、5g/L LDAO和1mM DTT添加到合适量的上述碱性缓冲溶液中,将pH调节至7.3,并使所得溶液通过0.22μm膜过滤器来制备。
用于抗体固化的包被缓冲溶液通过将5.85g/L氯化钠、5.18g乙酸酐钠、2.2mL/L乙酸和114g/L硫酸铵添加到纯化水中,并将pH调节至约4.8来制备。向包被溶液分别添加1.8μg/mL的c11-3单克隆抗体和c11-7单克隆抗体。
作为标记,“HCV核心Ag ELISA试剂盒(Ortho Diagnostic Systems)”中包括的标记抗体用于抗原检测,而通过利用“(LK11)过氧化物酶标记试剂盒NH2(Dojin KagakuKenkyusho)”采用HRP标记的HCV TMKK重组抗原则用于抗体检测。
实施例3
将以上用于抗体固化的包被缓冲溶液以200μL/孔的量分配到96孔微板(Corninghigh-bind type)中,并且在室温下静置六小时。在移除孔中的液体之后,将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。接着,将以上用于抗原固化的包被缓冲溶液以200μL/孔的量分配,并在4℃放置一夜。在移除孔中的液体之后,将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤一次。然后,将阻断缓冲溶液以300μL/孔的量分配,并且在室温下静置多于四小时。在移除孔中的液体之后,将孔用清洁缓冲溶液洗涤一次,然后干燥以制备固相板。
分别将150μL/孔的量的样品稀释剂和50μL的量的血清转化组(ZeproMetrix)“6212”和“6224”作为样品分配到固相板中,用板混合器对其进行搅拌并在37℃下温育一小时。在移除孔中的液体之后,将孔用清洁缓冲溶液洗涤五次。接着,将标记(即,HRP标记的HCV TMKK重组抗原)的用标记稀释缓冲溶液稀释40,000倍的液体,以及其中标记(即,HRP标记的抗-HCV核心抗体)用标记稀释缓冲溶液稀释100倍的液体以200μL/孔的量分配,将其在37℃下温育30分钟。在移除孔中的液体之后,用清洁缓冲溶液将孔洗涤五次。然后,通过将过氧化氢(30%)以0.1%的量添加至底物缓冲溶液而制备的底物液体以200μL/孔的量分配,并且在室温下反应30分钟。在反应终止溶液以50μL/孔的量分配之后,光度测定使用读板机(Molecular Devices的SpectraMax 340PC)通过双波长测量(490nm主波长和650nm次波长)测量吸光度来进行。结果在表6和7中示出。各个样品的RIBA3测量的已知结果也在表6和7中示出。表中的COI是通过测量10个单位的HCV抗体阴性样品并应用截断值计算的值,其中OD平均值增加10SD。
作为比较例3,光度测定以与实施例3相同的方法实施,不同之处在于:使用“Monolisa HCV Ag-Ab(Bio-Rad)”,市售HCV抗原-抗体检测试剂盒而非本发明的量化试剂;根据试剂盒的说明书手册进行测试;并且测定OD和COI。作为比较例4,各个样品的“HCV Ag/Ab Combo(ABBOTT)”的已知COI示于表6和7中。此外,作为比较例5,根据说明书手册使用“LUMIPULSETM Ortho HCV抗原(Ortho Diagnostic Systems)”在各个样品中的抗体量测量结果示于表6和7中。各个样品的RIBA3测量的已知结果也在表6和7中示出。
如表6所示,对处于感染早期阶段的样品(例如组6212-01和6212-02),用实施例3中的抗HCV核心Abs和TMKK检测HCV取得成功,在比较例4中失败,在比较例4中成功但灵敏度相比于比较例3较低。此外,如组6212-05和6212-06中所示,在抗原量减小的阶段,样品中的HCV检测在比较例5中失败,然而,使用实施例3中的抗HCV核心Abs和TMKK进行HCV检测是可能的。
如表7中所示,对处于感染早期阶段的样品(例如组6224-01至6224-03),用实施例3中的抗HCV核心Abs和TMKK检测HCV取得成功,并且灵敏度高于比较例3。此外,如组6224-04中所示,在抗原量减小的阶段,样品中的HCV检测在比较例4中失败,然而,使用实施例3的抗HCV核心Abs和TMKK却成功。
虽然已经显示出本发明的具体实施方案,但是当然要理解的是,本发明并不限于此,因为本领域普通技术人员可以在前面教导的启示下作出各种改变。在不脱离本发明的实质的情况下,在本发明前面公开内容的范围内可能有合理的变化和改变。
表1
结构域 | 近似边界* |
C(核心) | SEQ ID NO:1的1-191 |
E1 | SEQ ID NO:1的192-383 |
E2 | SEQ ID NO:1的384-746 |
P7 | SEQ ID NO:1的747-809 |
NS2 | SEQ ID NO:1的810-1026 |
NS3 | SEQ ID NO:1的1027-1657 |
NS4a | SEQ ID NO:1的1658-1711 |
NS4b | SEQ ID NO:1的1712-1972 |
NS5a | SEQ ID NO:1的1973-2420 |
NS5b | SEQ ID NO:1的2421-3011 |
*相对于HCV-1编号。参见Choo等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451-2455。
表2 TMKK c200
表3 TMKK c200
表4 TMKK c200
表5 TMKK c200
表6 combo:抗HCV核心Abs+TMKK
表7 combo:抗HCV核心Abs+TMKK
Claims (15)
1.一种包含多肽的免疫测定试剂,所述多肽包含:
具有SEQ ID NO:3的丙型肝炎病毒NS4a结构域;
具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的经修饰的丙型肝炎病毒NS3结构域,其中SEQ ID NO:4在137位的氨基酸残基置换为丙氨酸,使得所述经修饰的丙型肝炎病毒NS3结构域的蛋白酶活性相对于缺乏所述置换的具有SEQ ID NO:4的丙型肝炎病毒NS3结构域的蛋白酶活性受到抑制;以及
间插区,其将所述NS4a结构域的羧基末端连接至所述经修饰的NS3结构域的氨基末端。
2.根据权利要求1所述的免疫测定试剂,其中所述多肽的间插区具有氨基酸序列SGS。
3.根据权利要求1所述的免疫测定试剂,其中所述多肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的免疫测定试剂,其结合至固体支持体。
5.权利要求1-4中任一项所述的免疫测定试剂在制备用于检测生物样品中的丙型肝炎病毒抗体的免疫测定试剂中的用途,所述检测包括:
(a)提供根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定试剂;
(b)将生物样品与所述免疫测定试剂在允许丙型肝炎病毒抗体在存在于所述生物样品中时与所述免疫测定试剂结合的条件下合并,以形成第一免疫复合物;
(c)向得自步骤(b)的所述第一免疫复合物中加入标记检测剂,其中所述标记检测剂与所述第一免疫复合物反应;
(d)如果存在,检测所述标记检测剂与所述第一免疫复合物之间形成的第二免疫复合物,作为所述生物样品中丙型肝炎病毒抗体存在的指示。
6.根据权利要求5所述的用途,其中所述标记检测剂是标记抗体或标记抗原。
7.根据权利要求5所述的用途,其中所述免疫测定试剂结合至固体支持体。
8.权利要求1至4中任一项所述的免疫测定试剂在制备用于检测生物样品中丙型肝炎病毒抗体和/或丙型肝炎病毒抗原的免疫测定试剂中的用途,所述检测包括:
(a)提供根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定试剂;
(b)将生物样品与所述免疫测定试剂以及一种或多种抗-HCV抗体在下述条件下合并,所述条件允许丙型肝炎病毒抗体在存在于所述生物样品中时与所述免疫测定试剂结合以形成第一免疫复合物,并且还允许丙型肝炎病毒抗原在存在于所述生物样品中时与所述抗-HCV抗体结合以形成第二免疫复合物;
(c)向得自步骤(b)的所述第一免疫复合物中加入第一标记检测剂,其中所述第一标记检测剂与所述第一免疫复合物反应,并且向得自步骤(b)的所述第二免疫复合物中加入第二标记检测剂,其中所述第二标记检测剂与所述第二免疫复合物反应;
(d)如果存在,检测所述第一标记检测剂与所述第一免疫复合物之间形成的第三免疫复合物,并且如果存在,检测所述第二标记检测剂与所述第二免疫复合物之间形成的第四免疫复合物,作为所述生物样品中丙型肝炎病毒抗体和/或丙型肝炎病毒抗原存在的指示。
9.根据权利要求8所述的用途,其中所述第一标记检测剂和所述第二标记检测剂各自为标记抗体或标记抗原。
10.根据权利要求8所述的用途,其中一种或多种所述免疫测定试剂和所述一种或多种抗-HCV抗体结合到相同或不同的固体支持体。
11.一种免疫诊断测试试剂盒,其包括根据权利要求1-4中任一项所述的免疫测定试剂,以及用于实施所述免疫诊断测试的说明书。
12.根据权利要求11所述的免疫诊断测试试剂盒,其还包括一种或多种抗-HCV抗体。
13.根据权利要求12所述的免疫诊断测试试剂盒,其中所述一种或多种抗-HCV抗体是抗-HCV核心抗体。
14.一种分离的多肽,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。
15.一种分离的多肽,其由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成。
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