CN107735026A - 测量泪液样品中泪液成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种方法，其中该方法将受试者分类为患有干眼症，该方法由以下组成：a.获得人口统计数据，其由受试者的年龄和性别组成；b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白的水平；c.由确定的人血清白蛋白的水平，为确定的人血清白蛋白的量分配分数；以及d.由分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数：其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则受试者具有干眼症。

Description

测量泪液样品中泪液成分的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月1日提交的美国临时专利申请序列号62/156,072、2015年5月1日提交的美国临时专利申请序列号62/156,079、2015年5月1日提交的美国临时专利申请序列号62/156,087、2015年5月1日提交的美国临时专利申请序列号62/156,093、2016年1月14日提交的美国临时专利申请序列号62/278,805以及2016年1月14日提交的美国临时专利申请序列号62/278,814的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体涉及诊断方法和装置，并且更具体地涉及用于诊断干眼综合症的方法和装置。
背景技术
干眼综合症是由泪液缺乏引起的泪膜障碍，其导致睑间眼表面不适和损伤。泪液是覆盖角膜上皮和结膜上皮的表面上皮细胞的细胞外液。泪膜的功能包括润滑眼睛表面和眼睑，优化前段的折射功能，并提供一种从眼表面去除环境污染物的手段。
正常泪膜由三层组成：由睑板中的睑板腺产生的外部脂质层(约0.1μm厚)、由主泪腺和副泪腺产生的中心水性层(约7-10μm厚)以及结膜中杯状细胞产生的内粘蛋白层(约0.2-1.0μm厚)。4-8泪液组成列表包括水、电解质、脂质和蛋白质(例如脂质运载蛋白(lipocalin，脂笼蛋白)、乳铁蛋白、粘蛋白和溶菌酶)以及各种免疫球蛋白、生长因子和细胞因子。当泪液的质量或数量受到这些组分的不平衡或分解而受到损害时，会严重影响眼睛并导致或加剧干眼综合症。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该方法将受试者分类为患有干眼症，该方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白的水平；
c.由确定的人血清白蛋白的水平，为确定的人血清白蛋白的量分配分数(score)；以及
d.由分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数(cutoff probabilityscore)：
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则受试者具有干眼症。
在一个实施例中，该方法具有50％的截止概率分数，并且77％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且30％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一个实施例中，该方法具有60％的截止概率分数，并且68％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且63％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一个实施例中，确定人血清白蛋白的水平使用免疫化学反应进行，所述免疫化学反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中人血清白蛋白的量成比例，并且其中根据颜色的强度来分配分数。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于确定人血清白蛋白水平的装置，所述装置包括：
a.测试条，其配置为从患者接收泪液样品；以及
b.包含对人血清白蛋白特异的试剂的试剂垫，所述试剂在与泪液样品接触时进行反应，所述反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中的人血清白蛋白的量成比例，并且其中测试条配置为将泪液样品递送到试剂垫(pad)。
在一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该方法将受试者分类为患有干眼症，该方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的水平；
c.由确定的人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶水平，为确定的人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶量分配分数；以及
d.由分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数：
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则受试者具有干眼症。
在一个实施例中，该方法具有50％的截止概率分数，并且88％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且76％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一个实施例中，该方法具有55％的截止概率分数，并且84％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且80％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一个实施例中，该方法具有60％的截止概率分数，并且81％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且86％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于确定选自由人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶组成的群组的至少一种泪液成分的水平的装置，所述装置包括：
a.测试条，其配置为从患者接收泪液样品；以及
b.多个试剂垫，其中第一单个试剂垫包含对人血清白蛋白特异的试剂，第二试剂垫包含对溶菌酶特异的试剂，以及第三试剂垫包含对乳铁蛋白特异的试剂，其中在第一试剂垫、第二试剂垫和第三试剂垫中的试剂在与泪液样品接触后进行反应，所述反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中的人血清白蛋白、溶菌酶和乳铁蛋白的量成比例，并且其中测试条配置为将泪液样品递送到所述多个试剂垫。
附图说明
图1显示了使用根据本发明的一些实施例的乳铁蛋白测定获得的测试线强度的相关性。
图2显示了使用根据本发明的一些实施例的乳铁蛋白测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。
图3显示了使用根据本发明的一些实施例的人血清白蛋白测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。
图4显示了使用根据本发明的一些实施例的溶菌酶测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。
图5显示了使用根据本发明的一些实施例的粘蛋白测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。
图6显示了根据本发明一些实施例的装置。
具体实施方式
为了清楚说明本公开而非限制，将本发明的具体说明分成描述或阐明本发明的某些特征、实施例或应用的以下子部分。
在整个说明书和权利要求中，除非上下文另外明确指出，否则以下术语采用本文明确关联的意思。虽然可能，但是在文中使用的短语“在一个实施例中”和“在一些实施例中”不一定指相同的实施例。此外，虽然可能，但是在文中使用的短语“在另一个实施例中”和“在一些其它实施例中”不一定指不同的实施例。因此，如下所述，在不脱离本发明的范围或精神下，可以将本发明的各种实施例轻易地组合。
另外，如本文所使用的，术语“或”是包含性的“或”作用词(operater)，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确指出。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的附加因素，除非上下文另有明确指出。另外，在整个说明书中，“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”的意思包括复数指代。“在……中”的意思包括“在……中(in)”和“在……上(on)”。
如本文所用，术语“干眼病”是指由泪液缺乏引起的泪膜障碍，其导致睑间眼表面不适和损伤。在本发明方法的一些实施例中，干眼病可以由环境条件恶化、生活方式选择或药物引起，但不限于此。
如本文所用，当用于描述本文公开的本发明的实施例的一些方法中收集的泪液时，术语“有效体积”是指足以在经受特定化学或物理测试时提供确定结果的体积。因此，“有效体积”将取决于正在进行的特定测试。
如本文所用，术语“溶菌酶”是指由泪腺的腺泡合成和分泌的蛋白质。正常泪液中存在的溶菌酶量为0.6-2.6mg/ml，其通过降解泪膜中细菌的细胞壁组分而充当抗菌剂。
如本文所用，术语“轻度干眼症”是指由患者和/或医学专业人员(例如但不限于医生、护士等)诊断的、不需要治疗的疾病的暂时性症状或体征。对于被认为是中等程度的干眼症，患者必须经历对简单治疗措施(例如，但不限于将眼药水施用于干眼)有反应的体征或症状。
如本文所用，术语“半定量强度测量”是指从测定获得的结果，其中测定包括固定的运行时间和由医学专业人员使用的配置为接收包含至少一种泪液成分(例如溶菌酶)的泪液的测试条，并且其中医学专业人员将测试条(即，泪液分析条)的线强度与包含含有多个线强度的线强度板(例如，如图1和2中所示)(文中称为“标度板”)的对照印刷图片进行比较以确定试纸条的强度结果是否指示受试者患有干眼病。这种半定量强度测量可以用于与其它测试(例如Schirmer测试、TFBUT、OSDI、角膜染色或其任何组合)进行比较和相关。在一些实施例中，标度板是多个颜色线强度的印刷图片。
如本文所用，术语“泪液”是指覆盖角膜和结膜上皮的表面上皮细胞的细胞外液，其中泪膜代表眼表面的最后一道防线。泪膜的主要功能是润滑表面和眼睑、优化前段的折射功能和提供一种从眼表面去除环境污染物的手段。正常泪膜由三层组成：由睑板中睑板腺产生的外部脂质层(约0.1μm厚)，由主和副泪腺产生的中心水层(约7-10μm厚)以及结膜中杯状细胞产生的内粘蛋白层(约0.2-1.0μm厚)。
如本文所用，术语“泪液组分”是指泪液中的分子，并且包括但不限于水、电解质、抗微生物分子、免疫球蛋白、粘蛋白、脂质、生长因子或其任何组合。当泪液的质量或数量由这些组分中的任一种的不平衡或分解而受到损害时，结果可能是导致或加剧干眼综合症。
在本发明的方法的一些实施例中，以下是本文使用的术语的列表和所述术语的随附缩写：
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，其中该方法将受试者分类为患有干眼症，所述方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定选自由人血清白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶和粘蛋白组成的群组的至少一种泪液成分的水平；
c.由确定的量，为至少一种泪液成分的水平分配分数；以及
d.由至少一种泪液成分的分数，计算截止概率分数，
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则受试者具有干眼症。
在一些实施例中，确定至少一种泪液成分的水平使用免疫化学反应进行，所述免疫化学反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中至少一种泪液成分的量成比例，并且其中根据颜色的强度来分配分数。
在一些实施例中，分数选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，其中该方法将受试者分类为患有干眼症，所述方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白的水平；
c.由确定的人血清白蛋白水平，为确定的人血清白蛋白量分配分数；以及
d.由分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数：
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则受试者具有干眼症。
在一些实施例中，该方法具有50％的截止概率分数，并且77％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且30％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一些实施例中，该方法具有60％的截止概率分数，并且68％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且30％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一些实施例中，确定人血清白蛋白的水平使用免疫化学反应进行，所述免疫化学反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中人血清白蛋白的量成比例，并且其中根据颜色的强度来分配分数。
在一些实施例中，分数选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，其中该方法将受试者分类为患有干眼症，所述方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的水平；
c.由确定的人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的水平，为确定的人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的量分配分数；以及
d.由分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数：
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则受试者具有干眼症。
在一些实施例中，该方法具有50％的截止概率分数，并且88％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且76％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一些实施例中，该方法具有55％的截止概率分数，并且84％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且80％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一些实施例中，该方法具有60％的截止概率分数，并且81％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且86％的时间正确地将受试者分类为健康的。
在一些实施例中，分数选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
在一些实施例中，泪液样品的体积是1至25微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是1微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是2微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是4微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是6微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是8微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是10微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是12微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是14微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是16微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是18微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是20微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是21微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是22微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是23微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是24微升。在一些实施例中，泪液样品的体积是25微升。
根据本发明的一些实施例的泪液样品中成分的测量
在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中至少一种泪液成分的量的方法，所述泪液成分选自由溶菌酶、乳铁蛋白、粘蛋白、人血清白蛋白及其任何组合组成的群组。在一些实施例中，该方法是一种多分析测试。
在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中人血清白蛋白的量的方法。
在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中人血清白蛋白和乳铁蛋白的量的方法。
在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的量的方法。
根据本发明的一些实施例的泪液样品中人血清白蛋白(HSA)的测量：在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中人血清白蛋白(HSA)的量的方法，其包括：从受试者收集含有一定量HSA的泪液样品，其中泪液样品的HSA量用于通过以下来产生HSA的半定量强度测量：从受试者收集含有一定量HSA的泪液样品；使来自受试者的含有一定量HSA的泪液样品与泪液分析条接触，其中泪液分析条含有0.4μg的至少一种抗HSA抗体(例如单克隆抗HSA克隆M12619HS3，Fitzgerald Industries International，30Sudbury Road，Suite1A North Acton，MA 01720USA)，其以0.4μg/ml抗体与526nm下OD1胶体的比例与胶体金缀合，其中一定量的至少一种抗HSA抗体(例如单克隆抗HSA克隆M12619HS1，FitzgeraldIndustries International，30Sudbury Road，Suite 1A North Acton，MA 01720USA)，以1mg/ml的浓度分配在硝基纤维素纸上，以在泪液分析条上孵育(incubate)来自受试者的一定量的HSA，从而产生HSA的线强度；以及利用HSA的线强度来确定HSA的半定量强度量度；其中HSA的半定量强度测量选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
图3说明使用根据本发明一些实施例的人血清白蛋白测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的现有测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
参考图3，在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.1的强度与0μg/ml的人血清白蛋白的浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.25的强度与0.1μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.5的强度与0.5μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.75的强度与0.75μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.0的强度与1μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.25的强度与1.1μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.5的强度与1.2μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.75的强度与6μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，2.0的强度与10μg/ml的人血清白蛋白浓度相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的人血清白蛋白(比如，例如，0至0.1μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试检测到较低结果相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的人血清白蛋白(比如，例如，0至0.1μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试检测到更高结果相关。
根据本发明的一些实施例的泪液样品中的乳铁蛋白的测量：在一些实施例中，本发明提供了一种用于定量泪液样品中乳铁蛋白的量的方法，所述方法包括：从受试者收集含有一定量的乳铁蛋白的泪液样品，其中泪液样品的乳铁蛋白的量用以产生乳铁蛋白的半定量强度测量，其方法是：从受试者收集含有一定量乳铁蛋白的泪液样品；使来自受试者的含有一定量乳铁蛋白的泪液样品与泪液分析条接触，其中泪液分析条结合至与生物素结合的一定量的豌豆凝集素(PSA)和一定量的小扁豆凝集素(LCA)(其中至少PSA与泪液分析条的硝基纤维素结合)，其中一定量的与生物素结合的PSA以每1光学密度(OD)/ml的与抗生蛋白链菌素(streptavidin)结合的胶体金对2.5μg/ml至10μg/ml与生物素结合的PSA的比率与胶体金缀合，将来自受试者的一定量的乳铁蛋白在泪液分析条上孵育，以产生乳铁蛋白的线强度；并利用乳铁蛋白的线强度以测定乳铁蛋白的半定量强度测量；其中乳铁蛋白的半定量强度测量选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对2.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对3μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对3.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对4μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对4.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对5.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对6μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对6.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对7μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对7.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对8μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对8.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对9μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对9.5μg/ml与生物素结合的PSA。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对10μg/ml与生物素结合的PSA。
图2说明使用根据本发明的一些实施例的乳铁蛋白测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的现有测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
参照图2，在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.1的强度与1μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.25的强度与4μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.5的强度与12.5μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.75的强度与25μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.0的强度与50μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.25的强度与75μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.5的强度与100μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.75的强度与150μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，2.0的强度与200μg/ml的乳铁蛋白浓度相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的乳铁蛋白(比如，例如1至4μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测到的较低结果相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的乳铁蛋白(比如，例如1至4μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测到的较高结果相关。
根据本发明的一些实施例的泪液样品中溶菌酶的测量：在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中溶菌酶的量的方法，其包括：从受试者收集含有一定量的溶菌酶的泪液样品，其中泪液样品中溶菌酶的量用于通过以下产生溶菌酶的半定量强度量度：利用稀释缓冲液稀释泪液样品；使来自受试者的含有一定量的溶菌酶的稀释的泪液样品与泪液分析条接触，其中泪液分析条含有一定量的第一抗体(比如，例如，但不限于绵羊或兔抗溶菌酶抗体)和一定量的第二抗体(比如，例如，但不限于兔抗溶菌酶抗体)，其中该量的第一抗体以每1光学密度(OD)/ml的胶体金对2.5μg/ml至10μg/ml的比率与胶体缀合，并且将1.5mg/ml第二抗体作为捕获线(capture line)包埋在泪液分析条上，将来自受试者的一定量的溶菌酶在泪液分析条上孵育得到溶菌酶的线强度；并利用溶菌酶的线强度确定溶菌酶的半定量强度量度；其中溶菌酶的半定量强度量度选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对2.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对3μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对3.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对4μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对4.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对5.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对6μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对6.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对7μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对7.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对8μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对8.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对9μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对9.5μg/ml第一抗体。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对10μg/ml第一抗体。
图4说明使用根据本发明的一些实施例的溶菌酶测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的现有测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
参考图4，在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.1的强度与0μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.25的强度与1μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.5的强度与3μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.75的强度与12μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.0的强度与25μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.25的强度与40μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.5的强度与70μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.75的强度与100μg/ml的溶菌酶浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，2.0的强度与150μg/ml的溶菌酶浓度相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的溶菌酶(比如，例如0至1μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测到的较低结果相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的溶菌酶(比如，例如0至1μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测到的较高结果相关。
根据本发明的一些实施例的泪液样品中粘蛋白的测量：在一些实施例中，本发明是一种用于定量泪液样品中粘蛋白的量的方法，其包括：从受试者收集含有一定量的粘蛋白的泪液样品，以及其中泪液样品中粘蛋白的量用于通过以下来产生粘蛋白的半定量强度量度：从受试者收集含有一定量粘蛋白的泪液样品；使来自受试者的含有一定量粘蛋白的泪液样品与泪液分析条接触，其中泪液分析条与一定量的与生物素结合的木菠萝凝集素及一定量的麦胚凝集素(WGA)结合，其中一定量的与生物素结合的木菠萝凝集素以每1光学密度(OD)/ml的胶态金对2.5μg/ml至10μg/ml的比率与胶体金缀合，将来自受试者的一定量的粘蛋白在泪液分析条上孵育，从而得到粘蛋白线强度；并利用粘蛋白线强度确定粘蛋白的半定量强度量度；其中粘蛋白的半定量强度量度选自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0组成的群组。
在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对2.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对3μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对3.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对4μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对4.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对5.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对6μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对6.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对7μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对7.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对8μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对8.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对9μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对9.5μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。在一些实施例中，比率是每1OD/ml的与抗生蛋白链菌素结合的胶体金对10μg/ml与生物素结合的木菠萝凝集素。
图5说明使用根据本发明的一些实施例的粘蛋白测定获得的测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的现有测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
参照图5，在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.1的强度与0μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.25的强度与0.1μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.5的强度与0.5μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，0.75的强度与1μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.0的强度与3μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.25的强度与6μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.5的强度与12μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，1.75的强度与25μg/ml的粘蛋白浓度相关。在一些实施例中，在根据本发明的一些实施例的测试分析中观察到，2.0的强度与50μg/ml的粘蛋白浓度相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的粘蛋白(比如，例如0至1μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测到的较低结果相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中较低量的粘蛋白(比如，例如0至1μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测到的较高结果相关。
根据本发明的一些实施例的装置
在一些实施例中，本发明提供了一种用于确定选自由人血清白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶和粘蛋白组成的群组中的至少一种泪液成分的水平的装置，所述装置包括：
a.测试条，其配置为从患者接收泪液样品；以及
b.包含对人血清白蛋白特异的试剂的试剂垫，所述试剂在与泪液样品接触时进行反应，所述反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中的人血清白蛋白的量成比例，并且其中测试条配置为将泪液样品递送到试剂垫。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于确定选自由人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶组成的群组中的至少一种泪液成分的水平的装置，所述装置包括：
a.测试条，其配置为从患者接收泪液样品；以及
b.多个试剂垫，其中第一单个试剂垫包含对人血清白蛋白特异的试剂，第二试剂垫包含对溶菌酶特异的试剂，以及第三试剂垫包含对乳铁蛋白特异的试剂，其中在第一试剂垫、第二试剂垫和第三试剂垫中的试剂在与泪液样品接触后进行反应，所述反应配置为产生颜色，其中颜色的强度与泪液样品中存在的人血清白蛋白、溶菌酶和乳铁蛋白的量成比例，并且其中测试条配置为将泪液样品递送到所述多个试剂垫。
在一些实施例中，配置为产生颜色的反应是免疫化学反应。在一些实施例中，配置为产生颜色的反应是结合反应。
图6显示了根据本发明的一些实施例的装置的非限制性示例性实施例。该装置包括一个或多个包含化学或生物试剂的垫，所述试剂与泪液接触后，与测试的分析物发生免疫化学识别，并将复合物迁移至限定的区域。因此，观察到彩色线。诊断可以在预定义的时间后进行，例如，完成免疫化学反应后。该诊断基于将观察到的装置反应区上的线的颜色强度与颜色线强度的参考印刷图像进行比较。颜色线强度的印刷图像，其中每个颜色强度代表用于诊断DES的一个或多个特征。这样的特征可以是但不限于(a)至少一种物质的浓度，其浓度已知与DES相关(非限制性实例包括溶菌酶)，至少一种预定义蛋白质水平和电解质(如钠、钾等)的浓度、(b)同渗容摩、(c)粘度和表面张力，和(d)pH。
在本发明的方法的一些实施例中，该装置也可以用于收集其量足以进行基于泪水的相关特征的医学诊断的泪液。在一些实施例中，装置因此可以提供定性的、定量的(例如但不限于使用条状读取器)、半定量和多因素诊断。在一些实施例中，该装置因此可以提供半定量诊断。
在一些实施例中，本发明的方法包括提供两种凝集素，例如豌豆凝集素(“PSA”)和小扁豆凝集素(“LCA”)[均由Medicago AB制造，Medicago AB在：Da nmark Berga 13，SE-755 98乌普萨拉，瑞典，或由VECTOR LABORATORIES，INC制造：30Ingold Road，Burlingame，CA 94010，USA]，其中PSA与金颗粒缀合。在一些实施例中，生物素与PSA结合，产生生物素-PSA，并且生物素-PSA与抗生蛋白链菌素-金缀合物结合。在一些实施例中，将凝集素放置在测试条上。在一些实施例中，至少一种凝集素与金颗粒缀合(“免疫金标记的”)。在一些实施例中，金颗粒是胶体金颗粒。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在50-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在100-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-100nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-50nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-40nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-60nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在40-60nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在50-100nm范围内。
在一些实施例中，本发明的方法包括提供溶菌酶抗体(抗溶菌酶)，其中抗溶菌酶是缀合的。在一些实施例中，将抗溶菌酶抗体置于测试条上。在一些实施例中，抗溶菌酶抗体得自绵羊(即，绵羊抗溶菌酶和/或兔抗溶菌酶；其中绵羊抗溶菌酶可由Seramun GmbH[Spreenhagener Str.Heidesee 115754，德国]提供，或者是由Nordic MUbio[Rangeerweg5A 6114BC Susteren The Netherlands]提供的兔抗溶菌酶)。在一些实施例中，抗溶菌酶抗体与金颗粒缀合(“免疫金标记的”)。在一些实施例中，抗绵羊抗体与金颗粒缀合(4μg抗体与1ml OD 1的40nm金颗粒缀合)。在一些实施例中，金颗粒是胶体金颗粒。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在50-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在100-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-100nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-50nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在50-100nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-60nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在40-60nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-40nm范围内。
在一些实施例中，本发明的方法包括提供两种凝集素，例如豌豆凝集素(“PSA”)和小扁豆凝集素(“LCA”)，其中PSA与金颗粒缀合。在一些实施例中，生物素与PSA结合，产生生物素-PSA，并且生物素-PSA与抗生蛋白链菌素-金缀合物结合。在一些实施例中，将凝集素放置在测试条上。在一些实施例中，至少一种凝集素与金颗粒缀合(“免疫金标记的”)。在一些实施例中，金颗粒是胶体金颗粒。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在50-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在100-125nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-100nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-50nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-60nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在20-40nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在40-60nm范围内。在一些实施例中，胶体金颗粒可以在50-100nm范围内。
在一些实施例中，测试条包括硝基纤维素(例如，但不限于，来自AdvancedMicrodevices PVT的Whatman FF120或CNPH-N-SS60)。
在一些实施例中，测试条包含游离的[即未缀合的]绵羊抗溶菌酶抗体，其中这些游离抗体可以验证测试敏感度。
在一些实施例中，本发明的方法包括比较步骤，其中溶菌酶的半定量强度量度与Schirmer方法的结果相关。根据Schirmer方法，使用纸条测量在五分钟内产生的泪液量。将该条放置在下眼睑的中间和外侧三分之一的接合处，在眼球与眼睑之间。测试在环境光线下进行。指示患者在测试过程期间向前看并正常眨眼。采用在5分钟内润湿超过10mm的纸张来表明眼睛产生正常量的泪液。Schirmer方法的特异性(即，测试识别正常个人的能力)通常在90％左右。Schirmer测试以整个DED疑似群体的20％的比率提供了对DED疑似个人的真正识别。Schirmer测试在润湿小于5mm时提供真阳性结果，而当润湿水平在10mm以上时提供真阴性结果，并且当润湿水平在5mm与10mm之间时可提供假阳性结果。当湿润水平在5mm与10mm之间时，患者疑似患有DES，但结果不能被认为是结论性的。
在一些实施例中，本发明的方法包括比较步骤，其中乳铁蛋白的半定量强度量度与Schirmer方法的结果相关。根据Schirmer方法，使用纸条测量在五分钟内产生的泪液量。将该条放置在下眼睑的中间和外侧三分之一的接合处，在眼球与眼睑之间。测试在环境光线下进行。指示患者在测试过程期间向前看并正常眨眼。采用在5分钟内润湿超过10mm的纸张来表明眼睛产生正常量的泪液。Schirmer方法的特异性(即，测试识别正常个人的能力)通常在90％左右。Schirmer测试以整个DED疑似群体的20％的比率提供了对DED疑似个人的真正识别。Schirmer测试在润湿小于5mm时提供真阳性结果，而当润湿水平在10mm以上时提供真阴性结果，并且当润湿水平在5mm与10mm之间时可提供假阳性结果。当湿润水平在5mm与10mm之间时，患者疑似患有DES，但结果不能被认为是结论性的。
在一些实施例中，本发明的方法包括比较步骤，其中粘蛋白的半定量强度量度与Schirmer方法的结果相关。根据Schirmer方法，使用纸条测量在五分钟内产生的泪液量。将该条放置在下眼睑的中间和外侧三分之一的接合处，在眼球与眼睑之间。测试在环境光线下进行。指示患者在测试过程期间向前看并正常眨眼。采用在5分钟内润湿超过10mm的纸张来表明眼睛产生正常量的泪液。Schirmer方法的特异性(即，测试识别阴性结果的能力)通常在90％左右。Schirmer测试以整个DED疑似群体的20％的比率提供了对DED疑似个人的真正识别。Schirmer测试在润湿小于5mm时提供真阳性结果，而当润湿水平在10mm以上时提供真阴性结果，并且当润湿水平在5mm与10mm之间时可提供假阳性结果。当湿润水平在5mm与10mm之间时，患者疑似患有DES，但结果不能被认为是结论性的。
现在参考以下实例，其与以上描述一起以非限制的方式说明本发明的一些实施例。
实例
实例1：根据本发明的一些实施例的泪液样品中乳铁蛋白的测量
在健康受试者和符合轻度至中度干眼症的一个或多个标准的受试者中检查了主要泪液成分的水平。以下实验说明了用于干眼症评估的基准测试与泪液成分的定量量度之间的比较。用于定量测量至少一种泪液成分的测试的实例是角膜染色、Schirmer测试、TFBUT和包括OSDI问卷和Ora-CalibraTM眼部不适分数的提供的症状评估。OSDI是一个12个问题的评估，其已经成为干眼症状的标准。用于不适的Ora-CalibraTM评估也通过允许患者回答问题来提供对症状的量度，其中与OSDI相比，问题的数量减少。使用毛细管收集泪液样品，然后分析泪液成分。测得的泪液成分是乳铁蛋白。
泪液成分测定和测量方法
使用快速测试条(泪液分析条)和试剂以利用半定量技术测量乳铁蛋白水平；其中对于每种类型的测定，半定量技术遵循固定的运行时间，使用HP扫描仪型号Scanjet 200扫描该条。使用功能变亮/变暗优化扫描图：加亮-(-)50；阴影-(-)69；中色调-(-)50；γ-1.7，然后记录信号强度(如图2所示)。与一系列对照线的强度相比，使用强度测试线的半定量估计来进行泪液成分的确定。
实验设计
受试者群体：用于研究的受试者包括符合下表中列出的纳入和排除标准的18岁以上的任何人。研究群体包括两组受试者(组A，如表1所示，组B，如表2所示)，每组的数量大致相等(每组约100个受试者)：
表1：A组-健康的眼睛
表2：B组-疑似干眼症
本发明方法的一个示例性实施例是由约200名受试者组成的前瞻性单中心单次访问平行组数据和泪液收集研究。有一次定期的研究访问，筛选受试者；将那些符合资格标准的人招募到这项研究中。
泪液样品收集：收集泪液样品的程序如下：
1.将裂隙灯设置为低强度光束。
2.将眼睛的下眼睑缩回，并将玻璃毛细管置于接触泪液表面的颞侧。
3.接触泪液表面并允许收集6-25微升泪液。
4.一旦收集到足够的体积(例如，但不限于6-25微升)，将玻璃毛细管的内容物取出并倒入小瓶中。如果泪液体积低于6微升，则将另一个样品从另一只眼睛取出倒入另一个干净的小瓶中。
5.小瓶上标有赞助商提供的指定受试者标签。
6.将小瓶储存在2℃-8℃的温度下。在进一步分析乳铁蛋白的水平前，将泪液样品转移到赞助商实验室进行自收集起长达48小时的初始制备。
7.使用小体积的移液管在取样后的48小时内测量泪液体积。将两个样品体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS X 1)加入收集的样品中，然后短旋涡(20秒)进行混合。将稀释的样品放回到2℃-8℃的温度下用以储存。
乳铁蛋白测定：该测定允许使用侧流免疫层析测定、用乳铁蛋白(即，一种糖蛋白)的糖基团的特异性检测直接检测人泪液中的乳铁蛋白。首先，将20μl以1:2000稀释的泪液样品置于样品垫上。然后，将额外的40μl洗涤溶液置于样品垫上以使泪液样品迁移并润湿缀合物垫。缀合物垫包含通过生物素抗生物素蛋白相互作用缀合至与金颗粒缀合的抗生蛋白链菌素(其由Arista Biologicals Inc.1101Hamilton Street，Allentown，PA 18101制造)的第一凝集素(例如豌豆凝集素(“PSA”))。缀合的凝集素结合来自泪液样品中的乳铁蛋白，并通过硝基纤维素膜向芯(wick)迁移。当金缀合物/乳铁蛋白复合物到达测试区时，金缀合物/乳铁蛋白结合至固定于膜表面(即测试线)的第二凝集素(例如，小扁豆凝集素(“LCA”))。结合至测试线的金缀合物/乳铁蛋白的积累形成粉红色的可视线。然后过量的复合物迁移到含有结合抗生蛋白链菌素金缀合物的生物素BSA的第二区域。形成第二线(对照线)。对照线表示测试有效性。剩余量的缀合物和泪液样品从硝基纤维素膜迁移到芯垫中。
如下制备测试条：将1mg/ml(0.75-1.5mg/ml)LCA浸渍到硝基纤维素的层析膜上(例如，Whatman硝基纤维素膜，FF120，但也可以是mdi C PH-N-5560膜)。将LCA浸渍到呈1mm宽线条形状的测试条上。LCA溶液额外地包含以下：(1)缓冲液，例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水或pH值6.5-9.0的Tris、HEPES、Borax或MES缓冲液；(2)2％海藻糖或蔗糖，浓度为1％-4％；(3)1-4％乙醇(例如，但不限于1％、2％、3％、4％乙醇)。将LCA浸渍的硝基纤维素在50℃下干燥10分钟以使蛋白质与硝基纤维素结合。LCA与硝基纤维素的结合也可以在37-60℃下进行5至24小时，其中较高的温度将允许较短的孵育时间。通过以例如但不限于11：1、22：1或33：1的比率将生物素与PSA缀合使生物素与PSA结合。生物素-PSA以5μg/ml生物素-PSA(但可以在1μg/ml至7μg/ml浓度范围内)和OD0.5/ml-OD2.0/ml，例如但不限于OD1/ml金-抗生蛋白链菌素的比率与抗生蛋白链菌素-金缀合物结合。反应复合物也可以包括洗涤试剂，其从硝基纤维素膜上清除过量的金缀合物。洗涤试剂可以包含以下：(1)pH 7.4的PBS x 1(可以在pH 7.0-9.0范围内)；(2)1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(0.5％-3.0％)；(3)0.1％吐温20(可以在0.05％-2.0％范围内)；(4)0.05％十二烷基硫酸钠(可以在0.01％-1％范围内)，或其任何组合。关于图1，当以50μg/ml测量乳铁蛋白时，形成1的线强度(即，显示线强度与乳铁蛋白浓度之间的等效性)。
泪膜破裂时间测试：TFBUT的步骤包括：
1.医学专业人员向每只眼睛的下结膜穹窿中滴入5μL 2％无防腐剂荧光素钠溶液。为了将荧光素与泪膜充分混合，指示受试者眨眼数次。为了获得最大的荧光，在评估TFBUT前，医学专业人员在滴注后等待约30秒。
2.在裂隙灯的帮助下，医学专业人员监测泪膜的完整性，注意从打开眼睛时形成胶束所需的时间。用秒表以秒为单位测量TFBUT，依次对右眼和左眼用数字图像记录***测量。使用Wratten#12黄色过滤器来提高TFBUT评分的能力。
3.对于每只眼睛，取两个测量值并取平均值，除非这两个测量值相差大于2秒并且每个少于10秒，在这种情况下，取第三个测量值，并将三个测量值中最接近的两次取平均值。
角膜荧光素染色：用于角膜荧光素的步骤包括：
1.为了获得最大的荧光，医学专业人员在滴注后等待约3-5分钟，然后评估荧光素染色。使用Wratten#12黄色过滤器来增强荧光素染色分级的能力。
2.分级并记录睑间组织，使用5点等级(例如，具有代表一度强度等级的线强度的扫描条/板图)对结膜和角膜上皮细胞进行染色。轻轻抬起上眼睑，将整个角膜表面分级。对于结膜，当受试者向鼻观察时，进行颞区域分级；通过向颞观察进行经鼻分级。
3.使用Ora CalibraTM角膜和结膜染色分级对结膜和角膜染色进行分级并记录。
未麻醉的Schirmer测试：按照以下步骤进行Schirmer泪液测试：
1.使用无菌的泪液Flo Schirmer测试条(例如，购自RoseEnterprises，但不限于此)，条的弯曲与条的凹槽一致。
2.指示受试者注视。
3.将Schirmer测试条置于每只眼睛的下颞脸边缘，使测试条紧密贴合。指示受试者闭上眼睛。
4.5分钟后，取出Schirmer条。记录每只眼睛的润湿区域的长度(mm)。
Ora CalibraTM眼部不适分级：在一个示例性实施例中，根据以下等级，由受试者主观上分级眼部不适分数，分别对每只眼睛进行评分。所用的等级如下所示，范围是0-4：
0＝没有不适
1＝间歇性意识
2＝持续意识
3＝间歇性不适
4＝持续不适
Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷：受试者对以下每种症状的严重程度评分，关于眼睛感觉如何，总体来说-总体眼部不适、灼烧、干燥、沙砾感和刺痛，根据以下6-点(0-5)等级，其中0＝无，5＝最大。
对于研究方案依从性，遵循保护受试者的眼部安全性的专业护理标准。符合入选标准的受试者提供人口统计信息，医疗和眼部病史以及人工泪液使用(如果适用)。临床工作人员确认受试者在研究前一小时内没有使用人工泪液，然后指导受试者通过以下步骤：
1.受试者完成问卷和Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷。
2.受试者和工作人员检查了来源文件，以基于当前药物和病史确认受试者符合所有的纳入/排除标准。
3.临床工作人员使用毛细血管从受试者右眼收集6-25微升泪液。工作人员用受试者筛选号标记收集小瓶，并将毛细管内容物倒入小瓶中。
4.在从右眼收集的泪液体积低于6微升的情况下，从左眼抽取样品，将毛细管内容物倒入另一个标有相同受试者筛选号的干净小瓶中。
5.临床工作人员对收集眼进行泪膜破裂时间测试。
6.临床工作人员进行角膜荧光染色，并检查收集眼的眼表面。
7.如果从右眼收集6或更多微升，但是受试者右眼不符合泪膜破裂时间或荧光素染色纳入标准，则对左眼重复步骤3-6。
8.临床工作人员对收集眼进行未麻醉的Schirmer测试。
9.临床工作人员审查结果，基于根据项目3-8收集的数据确定患者是否符合所有纳入/排除标准。
10.符合所有标准的患者被分配一个受试者研究号，并根据对健康或疑似干眼症患者的诊断对标签进行分类。
11.如果适用，记录不良事件。
使用以下参数处理和测试样品：
1.使用微量移液管测量收集的泪液体积。添加两倍测量体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，最终稀释度为1：3。
2.利用PBS将稀释的泪液进一步连续稀释至以下稀释度：1:50、1:100和1:200。
3.将两微升的稀释样品与18微升金缀合物混合物在微管中混合。将相关测试条蘸入混合物中4分钟。
4.将额外的25微升洗涤溶液加入管中，以从反应区中清除过量的染料。
5.显色6分钟后，用薄纸将测试条轻轻吸干，并用台式扫描仪扫描。
6.根据图2所示的强度等级，对测试强度进行量化。
能力分析：表3给出了所选样品量的能力。
表3
使用精确二项式方法估计能力，其中考虑了两个协同的主要疗效指标(灵敏度和特异性)，并且其中“N”表示仅正值(或仅负值)情况的数目。因此，整个样品量加倍。
表4说明了“精确度”参数，其被定义为置信区间(CI)的一半长度。CI是群体参数的区间估计。CI是观察到的区间(即从观察结果计算出)，原则上样品间不同，如果重复实验，通常包括感兴趣的参数。
表4
结果与分析
研究的主要结果是用于干眼症的基准测试(例如TFBUT、角膜染色、Schirmer测试和OSDI问卷)与泪膜成分(例如乳铁蛋白)的测试结果的比较。
分析中包括从符合入选标准的患者眼睛获得的所有收集的样品。这项研究的目标是开发一个评估工具以比较用于干眼症的基准测试和测试泪膜化合物乳铁蛋白的试剂盒。数据分布从最低值到最高值，并与其它参数进行比较，以确定正和负相关性。图2说明了测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中的乳铁蛋白的较低量(比如，例如1至4μg/ml)与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测的较高结果相关。
在这个初步研究中的样品量(总共198只眼睛，每组99只)不是基于任何能力分析，而是基于足以构建用于区分健康泪液和疑似干眼症泪液并利用不同测试参数评估基准测试的模型的眼睛数量的近似值。
不良事件(AE)包括在泪液收集过程和眼表面评估步骤中报告的任何事件。该临床研究涉及TFBUT、角膜染色和用于成分分析的眼泪收集。在这些测试中，参与者可能已经感觉到异物感。在泪液收集期间，可能出现由于运动而与眼睛直接接触的情况，导致角膜磨损或眼睛发红。任何这样的事件被记录和如下分级：
轻微：通常是短暂的体征或症状，不需要特殊治疗，一般不会干扰正常的活动。
中度：可能通过简单的治疗措施改善的体征或症状；可能会干扰正常的活动。
严重：强烈或虚弱的体征或症状，干扰正常的活动。恢复通常借助于治疗措施。
总共198个受试者完成研究，包括126个女性和72个男性。下表5中列出了根据入选标准A或B的受试者分类。符合入选标准的那些人在本研究中不匹配年龄或性别。
表5
男性 女性 平均年龄
A组健康的 41 59 45.5
B组疑似DE 31 67 58.6
在每个研究组中招募的受试者符合健康或疑似干眼症的入选标准。唯一显示出两组间显著差异的人口统计标准是年龄；初步分析显示两组之间的任何泪液度量(metric)无显著差异。另外，两组都显示了基准测试参数的一系列值。根据这一观察，将所有受试者合并到单个组中，并使用群体四分位数进行分析，假设抽样群体代表了干眼症严重程度的连续区。使用这个概念，对每个基准测试的测量结果进行排名，并将4个四分位数中每一个的平均值与泪液诊断的测量值进行比较。
四分位数分析：用于TFBUT、劣质染色和Schirmer测试的四分位数分析总结在表6中。这种方法的重点在于极值，四分位数1和4，因为这些代表了每个度量具有最大差异的那些患者。在所有三个测量中，Q1是具有正常患者预期值的四分位数，而Q4是具有干眼症有关值的四分位数。例如，Q1中的那些具有12.80秒的平均TFBUT，因此将被认为是正常的，而Q4中的那些具有2.34秒的平均TFBUT，这与中度干眼病的诊断一致。当比较每个TFBUT定义的四分位数中测试参数的平均值时，出现了破裂时间度量与泪液成分动力学之间的关联。Q1与Q4之间TFBUT的减少伴随着乳铁蛋白的增加。劣质染色从Q1增加到Q4，并且这种增加与乳铁蛋白的增加显著相关。由Schirmer分数定义的四分位数显示出显著的负相关性：平均Schirmer分数从Q1下降到Q4的同时，乳铁蛋白值增加，并显示了Q1与Q4之间的显著差异。这种负相关性是由于Schirmer分数的性质，其中较高值(Q1)表明健康的泪液产生。
表6显示了用于TFBUT、劣质染色和Schirmer测试的四分位数分析。T检验值在显著的情况下(小于0.05)用粗体突出显示。
表6
第二轮四分位数分析使用相同的方法来确定由泪液成分值定义的四分位数是否显示与干眼症的体征和症状的其他度量的类似相关性。这些数据显示在表7中。表7.乳铁蛋白的四分位数分析。T检验值在显著的情况下(<0.05)用粗体突出显示。
表7
与泪腺蛋白乳铁蛋白相关的四分位数显示出对于角膜染色测量的显著差异，其中劣质和整个角膜染色显示与蛋白质水平从Q1增加到Q4的正相关性。
讨论
目前的研究说明最初招募用于分析的两个受试者群体的异质性。尽管其纳入基于症状学、TFBUT和角膜染色的差异标准，但是在泪液成分分析中没有识别到两个群体之间的显著差异。
在一些实施例中，本发明的方法提供了一种用于测量干眼症的方法，包括泪液成分分析。在一些实施例中，本发明的方法提供了一种用于测量干眼症的方法，包括泪液成分分析，并将泪液成分分析与诸如但不限于Schirmer测试、TFBUT等的测试进行比较，以便获得信息来治疗被诊断为干眼病的患者。
四分位数分析显示了传统度量与作为泪液成分的一部分的测试参数之间的关系。一个例外是TFBUT，其只表现出与任何测量的泪液成分的适度相关性。相比之下，角膜染色的措施(例如劣质染色，表6)与测试参数的变化密切相关。这与蒸发性干眼症的诊断一致，其中泪液的含水量降低将导致所有泪液成分的浓度明显增加。或者，泪液成分浓度的增加可能归因于眼表面窘迫的炎症反应，其引起严重到粘液泪液分泌物的比率的改变。此外，更大量的乳铁蛋白与更大染色和更低Schirmer分数相关；此外，乳铁蛋白显示出与较低的TFBUT的显著相关性。
在一些实施例中，本发明的方法包括使用至少一个诊断测试。在一些实施例中，在进行健康和干眼病受试者的泪液成分的这种比较中，获得乘法效应。在一些实施例中，使用试剂盒来提供严重患者与健康受试者之间的评估。
实例2：根据本发明的一些实施例的泪液样品中溶菌酶的测量
在健康受试者和符合轻度至中度干眼症的一个或多个标准的受试者中检查了主要泪液成分的水平。以下实验说明了用于干眼症评估的基准测试与泪液成分的定量测量之间的比较。用于定量测量至少一种泪液成分的测试的实例是角膜染色、Schirmer测试、TFBUT、以及包括OSDI问卷和Ora-CalibraTM眼部不适分数的提供的症状评估。OSDI是一个12个问题的评估，其已经成为干眼症状的标准。用于不适的Ora-CalibraTM评估也通过允许患者回答问题来提供对症状的测量，其中与OSDI相比，问题的数量减少。使用毛细管收集泪液样品，然后分析泪液成分。测量的泪液成分是溶菌酶。
泪液成分测定和测量方法
使用快速测试条(泪液分析条)和试剂以利用半定量技术测量乳铁蛋白水平；其中对于每种类型的测定，半定量技术遵循固定的运行时间，使用HP扫描仪型号Scanjet 200扫描条带。使用功能变亮/变暗优化扫描图：加亮-(-)50；阴影-(-)69；中色调-(-)50；γ-1.7，然后记录信号强度(如图4所示)。与一系列对照线的强度相比，使用强度测试线的半定量估计来进行泪液成分的测定。
实验设计
受试者群体：用于研究的受试者包括符合下表中列出的纳入和排除标准的18岁以上的任何人。研究群体包括两组受试者(组A，如以上实例1中表1所示，组B，如以上实例1中表2所示)，每组的数量大致相等(每组约100个受试者)：
本发明方法的一个示例性实施例是由约200名受试者组成的前瞻性单中心单次访问平行组数据和泪液收集研究。有一次定期的研究访问，筛选受试者；将那些符合资格标准的人招募到这项研究中。
泪液样品收集：泪液样品收集的步骤根据以上实例1中所述的方法。
溶菌酶测定：测定允许使用识别酶的特异性抗体直接检测人泪液中的溶菌酶。测试条采用半定量侧流免疫层析技术。将泪液样品用磷酸盐盐水缓冲液1:200稀释(即进一步至泪液的1:3初始稀释度)，将10μl 1:200稀释的样品置于样品垫上。额外的40μl洗涤溶液允许泪液样品迁移，润湿缀合物垫。与金颗粒缀合的特异性绵羊多克隆抗体结合溶菌酶。与溶菌酶结合的缀合抗体流过硝基纤维素膜。当金缀合物/溶菌酶复合物到达测试区时，其与固定在膜表面的二级绵羊抗溶菌酶抗体反应。硝基纤维素上的第二区域被浸渍(例如，用山羊抗绵羊抗体)并配置为结合绵羊抗溶菌酶-金缀合物。形成第二条线并被称为对照线。对照线表示测试有效性。值得注意的是，两种抗溶菌酶抗体(即，绵羊抗溶菌酶或兔抗溶菌酶)可以识别酶上的不同表位。
在一个示例性实施例中，将1.5mg/ml(0.75-2.5mg/ml)绵羊抗溶菌酶浸渍到具有高蛋白结合能力的硝基纤维素的层析膜上(例如，但不限于，mdi C PH-N-5560)。通过例如但不限于肉眼观察浸渍，呈1mm宽的线。抗体溶液包含以下：a.缓冲液，例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水或pH值6.5至9.0的Tris、HEPES、Borax或MES缓冲液；b.2％海藻糖(也可以是蔗糖)，也可以在1％至4％糖范围内；C.2％乙醇，也可以在1％至4％范围内。
将抗体浸渍的硝基纤维素在50℃下干燥10分钟以使蛋白质固定在硝基纤维素上。在一个实施例中，通过温度调节，结合可以在60℃至37℃之间进行5至24小时(例如，在较高温度下更快的结合)。
在一个示例性实施例中，绵羊抗溶菌酶以528nm下每OD1/ml胶体金4μg蛋白质的比率与金颗粒(例如20nm、40nm、60nm或100nm)缀合。缀合在pH7与pH9之间的pH条件下进行，例如pH8。
金缀合物的有效浓度范围可以是OD 0.5/ml至OD 2/ml。将30μg/ml游离绵羊抗溶菌酶(也可使用兔抗溶菌酶)加入缀合物溶液中以调节测试灵敏度。如图4所示，目测估计(即半定量测量)线强度。当溶菌酶浓度为25μg/ml时，形成1的线强度(显示例如线强度与溶菌酶浓度之间的等效性)。反应混合物也包括洗涤试剂(WR)，其提供化学环境以及从硝基纤维素膜上清除金残留物。WR包含以下：(a)PBS X 1pH 7.4(可以在7至9范围内)，(b)1％牛血清白蛋白(BSA)可以在0.5至3％范围内且不含脂肪酸)，(c)0.05％至2％吐温20，例如，但不限于0.1％吐温20，(d)0.05％N-月桂酰肌氨酸和0.4％PEG以减少与硝基纤维素膜的非特异性结合，其中N-月桂酰肌氨酸的浓度为0.01-1％。
泪膜破裂时间测试：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
角膜荧光素染色：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
未麻醉的Schirmer测试：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
Ora CalibraTM眼部不适分级：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷：根据上述实例1中所述的方法进行问卷。
对于研究方案依从性，遵循保护受试者的眼部安全性的专业护理标准。符合入选标准的受试者提供人口统计信息，医疗和眼部病史以及人工泪液使用(如果适用)。临床工作人员确认受试者在研究前一小时内没有使用人工泪液，然后指导受试者通过以下步骤：
1.受试者完成问卷和Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷。
2.受试者和工作人员检查了来源文件，以基于当前药物和病史确认受试者符合所有的纳入/排除标准。
3.临床工作人员使用毛细血管从受试者右眼收集6-25微升泪液。工作人员用受试者筛选号标记收集小瓶，并将毛细管内容物倒入小瓶中。
4.在从右眼收集的泪液体积低于6微升的情况下，从左眼抽取样品，将毛细管内容物倒入另一个标有相同受试者筛选号的干净小瓶中。
5.临床工作人员对收集眼进行泪膜破裂时间测试。
6.临床工作人员进行角膜荧光染色，并检查收集眼的眼表面。
7.如果从右眼收集6或更多微升，但是受试者右眼不符合泪膜破裂时间或荧光素染色纳入标准，则对左眼重复步骤3-6。
8.临床工作人员对收集眼进行未麻醉的Schirmer测试。
9.临床工作人员审查结果，根据项目3-8收集的数据确定患者是否符合所有纳入/排除标准。
10.符合所有标准的患者被分配一个受试者研究号，并根据对健康或疑似干眼症患者的诊断对标签进行分类。
11.如果适用，记录不良事件。
使用以下参数处理和测试样品：
1.使用微量移液管测量收集的泪液体积。添加两倍测量体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，最终稀释度为1：3。
2.利用PBS将稀释的泪液进一步连续稀释至以下稀释度：1:50、1:100和1:200。
3.将两微升的稀释样品与18微升金缀合物混合物在微管中混合。将相关测试条蘸入混合物中4分钟。
4.将额外的25微升洗涤溶液加入管中，以从反应区中清除过量的染料。
5.显色6分钟后，用薄纸将测试条轻轻吸干，并用台式扫描仪扫描。
6.根据图4所示的强度等级，对测试强度进行量化。
能力分析：表8给出了所选样品量的能力。
表8
使用精确二项式方法估计能力，其中考虑了两个协同的主要疗效指标(endpoint)(灵敏度和特异性)，并且其中“N”表示仅正值(或仅负值)情况的数目。因此，整个样品量加倍。
表9说明了“精确度”参数，其被定义为置信区间(CI)的一半长度。CI是群体参数的区间估计。CI是观察到的区间(即从观察结果计算出)，原则上样品间不同，如果重复实验，通常包括感兴趣的参数。
表9
结果与分析
研究的主要结果是用于干眼症的基准测试(例如TFBUT、角膜染色、Schirmer测试和OSDI问卷)与泪膜成分(例如溶菌酶)的测试结果的比较。
分析中包括从符合入选标准的患者眼睛获得的所有收集的样品。这项研究的目标是开发一个评估工具以比较用于干眼症的基准测试和测试泪膜化合物溶菌酶的试剂盒。数据分布从最低值到最高值，并与其它参数进行比较，以确定正和负相关性。图4说明了测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中的较低量(比如，例如0至1μg/ml)的溶菌酶与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测的较低结果相关。
在这个初步研究中的样品量(总共198只眼睛，每组99只)不是基于任何能力分析，而是基于足以构建模型用于区分健康泪液和疑似干眼症泪液并利用不同测试参数评估基准测试的模型的眼睛数量的近似值。
不良事件(AE)包括在泪液收集过程和眼表面评估步骤中报告的任何事件。该临床研究涉及TFBUT、角膜染色和用于成分分析的眼泪收集。在这些测试中，参与者可能已经感觉到异物感。在泪液收集期间，可能出现由于运动而与眼睛直接接触的情况，导致角膜磨损或眼睛发红。任何这样的事件被记录和如下分级：
轻微：通常是短暂的体征或症状，不需要特殊治疗，一般不会干扰正常的活动。
中度：可能通过简单的治疗措施改善的体征或症状；可能会干扰正常的活动。
严重：强烈或虚弱的体征或症状，干扰正常的活动。恢复通常借助于治疗措施。
总共198个受试者完成研究，包括126个女性和72个男性。下表10中列出了根据入选标准A或B的受试者分类。符合入选标准的那些人在本研究中不匹配年龄或性别。
表10
男性 女性 平均年龄
A组健康的 41 59 45.5
B组疑似DE 31 67 58.6
在每个研究组中招募的受试者符合健康或疑似干眼症的入选标准。唯一显示出两组间显著差异的人口统计标准是年龄；初步分析显示两组之间的任何泪液度量无显著差异。另外，两组都显示了基准测试参数的一系列值。根据这一观察，将所有受试者合并到单个组中，并使用群体四分位数进行分析，假设抽样群体代表了干眼症严重程度的连续区。使用这个概念，对每个基准测试的测量结果进行排名，并将4个四分位数中每一个的平均值与泪液诊断的测量结果进行比较。
四分位数分析：用于TFBUT、劣质染色和Schirmer测试的四分位数分析总结在表11中。这种方法的重点在于极值，四分位数1和4，因为这些代表了每个度量具有最大差异的那些患者。在所有三个测量中，Q1是具有正常患者预期值的四分位数，Q4是具有干眼症有关值的四分位数。例如，Q1中的那些具有12.80秒的平均TFBUT，因此将被认为是正常的，而Q4中的那些具有2.34秒的平均TFBUT，这与中度干眼病的诊断一致。当比较每个TFBUT定义的四分位数中测试参数的平均值时，出现了破裂时间度量与泪液成分动力学之间的关联。Q1与Q4之间TFBUT的减少伴随着溶菌酶的减少。劣质染色从Q1增加到Q4，并且这种增加与溶菌酶的增加显著相关。由Schirmer分数定义的四分位数显示出显著的负相关性：平均Schirmer分数从Q1下降到Q4的同时，溶菌酶值增加，并显示了Q1与Q4之间的显著差异。这种负相关性是由于Schirmer分数的性质，其中较高值(Q1)表明健康的泪液产生。
表11显示了用于TFBUT、劣质染色和Schirmer测试的四分位数分析。T检验值在显著的(<0.05)情况下用粗体突出显示。
表11
第二轮四分位数分析使用相同的方法来确定由泪液成分值定义的四分位数是否显示与干眼症的体征和症状的其它度量的类似相关性。这些数据显示在表12中。
表12.溶菌酶的四分位数分析。T检验值在显著的(<0.05)的情况下用粗体突出显示。
表12
溶菌酶四分位数显示出对于角膜染色测量的显著差异，其中劣质和整个角膜染色显示与蛋白质水平从Q1增加到Q4的正相关性。
讨论
目前的研究说明最初招募用于分析的两个受试者群体的异质性。尽管其纳入基于症状学、TFBUT的差异标准，但是在泪液成分分析中没有识别到两个群体之间的显著差异。观察到角膜染色和Schirmer测试的显著差异。
在一些实施例中，本发明的方法提供了用于测量干眼症的方法，包括泪液成分分析。在一些实施例中，本发明的方法提供了用于测量干眼症的方法，包括泪液成分分析，并将泪液成分分析与诸如但不限于Schirmer测试、TFBUT等的测试进行比较，以便获得信息来治疗被诊断为干眼病的患者。
四分位数分析显示了传统度量与作为泪液成分的一部分的测试参数之间的关系。一个例外是TFBUT，其只表现出与任何测得的泪液成分的适度相关性。相比之下，角膜染色量度(例如劣质染色，表11)与测试参数的变化密切相关。这与蒸发性干眼症的诊断一致，其中泪液的含水量降低将导致所有泪液成分的浓度明显增加。或者，泪液成分浓度的增加可能归因于眼表面窘迫的炎症反应，其引起严重到粘液泪液分泌物的比率的改变。此外，溶菌酶与更大染色和更低Schirmer分数相关；此外，溶菌酶没有显示出与TFBUT的显著相关性。
在一些实施例中，本发明的方法包括使用至少一个诊断测试。在一些实施例中，在进行健康和干眼病受试者的泪液成分的这种比较中，获得乘法效应。在一些实施例中，使用试剂盒来提供严重患者与健康受试者之间的评估。
实例3：根据本发明的一些实施例的泪液样品中溶菌酶的测量
在健康受试者和符合轻度至中度干眼症的一个或多个标准的受试者中检查了主要泪液成分的水平。以下实验说明了用于干眼症评估的基准测试与泪液成分的定量测量之间的比较。用于定量测量至少一种泪液成分的测试的实例是角膜染色、Schirmer测试、TFBUT、以及包括OSDI问卷和Ora-Calibra TM眼部不适分数的提供的症状评估。OSDI是一个12个问题的评估，其已经成为干眼症状学的标准。用于不适的Ora-Calibra评估也通过允许患者回答问题来提供对症状的测量，其中与OSDI相比，问题的数量减少。使用毛细管收集泪液样品，然后分析泪液成分。测得的泪液成分是粘蛋白。
泪液成分测定和测量方法
使用快速测试条(泪液分析条)和试剂以利用半定量技术测量乳铁蛋白水平；其中对于每种类型的测定，半定量技术遵循固定的运行时间，使用HP扫描仪型号Scanjet 200扫描条带。使用功能变亮/变暗优化扫描图：加亮-(-)50；阴影-(-)69；中色调-(-)50；γ-1.7，然后记录信号强度(如图5所示)。与一系列对照线的强度相比，使用强度测试线的半定量估计来进行泪液成分的测定。
实验设计
受试者群体：用于研究的受试者包括符合下表中列出的纳入和排除标准的18岁以上的任何人。研究群体包括两组受试者(组A，如以上实例1中表1所示，组B，如以上实例1中表2所示)，每组的数量大致相等(每组约100个受试者)：
本发明方法的一个示例性实施例是由约200名受试者组成的前瞻性单中心单次访问平行组数据和泪液收集研究。有一次定期的研究访问，筛选受试者；将那些符合资格标准的人招募到这项研究中。
泪液样品收集：泪液样品收集的步骤根据以上实例1中所述的方法。
粘蛋白测定：该测定允许使用侧流免疫层析测定通过检测粘蛋白(一种糖蛋白，即包含至少一个糖部分)的糖基团来检测人泪液中的粘蛋白。首先，将稀释的泪液样品置于样品垫上。然后，将额外数滴洗涤溶液置于样品垫上以使泪液样品迁移并润湿缀合物垫。缀合物垫包含通过生物素-抗生物素蛋白(Avidin)相互作用而被缀合至金颗粒的第一凝集素(例如木菠萝素(Jacalin))。缀合的凝集素结合泪液样品中的粘蛋白，并通过硝基纤维素膜向芯迁移。当金缀合物/粘蛋白复合物到达测试区时，金缀合物/粘蛋白与固定于膜表面(即测试线处)的第二凝集素(例如，麦胚凝集素(“WCA”))反应。结合至测试线的金缀合物/粘蛋白的积累形成粉红色的可视线。然后过量的复合物迁移到含有生物素BSA的第二区域，并结合抗生蛋白链菌素金缀合物，形成第二线(对照线)。对照线表明测试有效性。剩余量的缀合物和泪液样品从硝基纤维素膜迁移到芯垫中。
如下制备测试条：将1mg/ml(0.75-1.5mg/ml)WGA浸渍到硝基纤维素的层析膜上(例如，Whatman纸，FF120)。浸渍呈1mm宽线条形状。凝集素溶液额外地包含以下：(1)缓冲液，例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水或pH值6.5-9.0的Tris、HEPES、Borax或MES缓冲液；(2)2％海藻糖或蔗糖，浓度为1％-4％；(3)1-4％乙醇(例如，但不限于1％、2％、3％、4％乙醇)。将WGA浸渍的硝基纤维素在50℃下干燥10分钟以使蛋白质与硝基纤维素结合。WGA与硝基纤维素的结合也可以在37-60℃下进行5至24小时，其中较高的温度将允许较短的孵育时间。通过以例如但不限于11：1、22：1或33：1的比率将生物素与木菠萝素缀合使生物素与木菠萝素结合。生物素-木菠萝素以5μg/ml生物素-木菠萝素和OD0.5/ml-OD2.0/ml，例如但不限于OD1/ml金-抗生蛋白链菌素的比率与抗生蛋白链菌素-金缀合物结合。反应复合物也可以包括洗涤试剂，其从硝基纤维素膜上清除过量的金缀合物。洗涤试剂可以包含以下：(1)pH7.4的PBS x 1(可以在pH 7.0-9.0范围内)；(2)1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(0.5％-3.0％)；(3)0.1％吐温20(可以在0.05％-2.0％范围内)；或其任何组合。此外，可将0.05％的十二烷基硫酸钠以0.01％至1.0％的浓度加入洗涤试剂中。关于图5，当粘蛋白被测量为12μg/ml时，形成1的线强度。
泪膜破裂时间测试：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
角膜荧光素染色：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
未麻醉的Schirmer测试：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
Ora CalibraTM眼部不适分级：根据上述实例1中所述的方法进行该步骤。
Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷：根据上述实例1中所述的方法进行问卷。
对于研究方案依从性，遵循保护受试者的眼部安全性的专业护理标准。符合入选标准的受试者提供人口统计信息，医疗和眼部病史以及人工泪液使用(如果适用)。临床工作人员确认受试者在研究前一小时内没有使用人工泪液，然后指导受试者通过以下步骤：
1.受试者完成问卷和Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷。
2.受试者和工作人员检查了来源文件，以基于当前药物和病史确认受试者符合所有的纳入/排除标准。
3.临床工作人员使用毛细血管从受试者右眼收集6-25微升泪液。工作人员用受试者筛选号标记收集小瓶，并将毛细管内容物倒入小瓶中。
4.在从右眼收集的泪液体积低于6微升的情况下，从左眼抽取样品，将毛细管内容物倒入另一个标有相同受试者筛选号的干净小瓶中。
5.临床工作人员对收集眼进行泪膜破裂时间测试。
6.临床工作人员进行角膜荧光染色，并检查收集眼的眼表面。
7.如果从右眼收集6或更多微升，但是受试者右眼不符合泪膜破裂时间或荧光素染色纳入标准，则对左眼重复步骤3-6。
8.临床工作人员对收集眼进行未麻醉的Schirmer测试。
9.临床工作人员审查结果，根据项目3-8收集的数据确定患者是否符合所有纳入/排除标准。
10.符合所有标准的患者被分配一个受试者研究号，并根据对健康或疑似干眼症患者的诊断对标签进行分类。
11.如果适用，记录不良事件。
使用以下参数处理和测试样品：
1.使用微量移液管测量收集的泪液体积。添加两倍测量体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，最终稀释度为1：3。
2.利用PBS将稀释的泪液进一步连续稀释至以下稀释度：1:50、1:100和1:200。
3.将两微升的稀释样品与18微升金缀合物混合物在微管中混合。将相关测试条蘸入混合物中4分钟。
4.将额外的25微升洗涤溶液加入管中，以从反应区中清除过量的染料。
5.显色6分钟后，用薄纸将测试条轻轻吸干，并用台式扫描仪扫描。
6.根据图5所示的强度等级，对测试强度进行量化。
能力分析：表13给出了所选样品量的能力。
表13
使用精确二项式方法估计能力，其中考虑了两个协同的主要疗效指标(灵敏度和特异性)，并且其中“N”表示仅正值(或仅负值)情况的数目。因此，整个样本量加倍。
表14说明了“精确度”参数，其被定义为置信区间(CI)的一半长度。CI是群体参数的区间估计。CI是观察到的区间(即从观察结果计算出)，原则上样品间不同，如果重复实验，通常包括感兴趣的参数。
表14
结果与分析
研究的主要结果是用于干眼症的基准测试(例如TFBUT、角膜染色、Schirmer测试和OSDI问卷)与泪膜成分(例如粘蛋白)的测试结果的比较。
分析中包括从符合入选标准的患者眼睛获得的所有收集的样品。这项研究的目标是开发一个评估工具以比较用于干眼症的基准测试和测试泪膜化合物粘蛋白的试剂盒。数据分布从最低值到最高值，并与其它参数进行比较，以确定正和负相关性。图5说明了测试线强度与分析物浓度的相关性。在一些实施例中，降低的测试线强度与用于干眼症的测试(例如，Schirmer测试、角膜染色、OSDI等)相关。
在一些实施例中，测试线的相关性表明根据本发明的一些实施例的测试分析中的较低量(比如，例如0至1μg/ml)的粘蛋白与通过选自由Schirmer测试、角膜染色测试、ODSI和TFBUT组成的群组中的至少一种测试所检测的较低结果相关。
在这个初步研究中的样本量(总共198只眼睛，每组99只)不是基于任何能力分析，而是基于足以构建模型用于区分健康泪液和疑似干眼症泪液并利用不同测试参数评估基准测试的模型的眼睛数量的近似值。
不良事件(AE)包括在泪液收集过程和眼表面评估步骤中报告的任何事件。该临床研究涉及TFBUT、角膜染色和用于成分分析的眼泪收集。在这些测试中，参与者可能已经感觉到异物感。在泪液收集期间，可能出现由于运动而与眼睛直接接触的情况，导致角膜磨损或眼睛发红。任何这样的事件被记录和如下分级：
轻微：通常是短暂的体征或症状，不需要特殊治疗，一般不会干扰正常的活动。
中度：可能通过简单的治疗措施改善的体征或症状；可能会干扰正常的活动。
严重：强烈或虚弱的体征或症状，干扰正常的活动。恢复通常借助于治疗措施。
总共198个受试者完成研究，包括126个女性和72个男性。下表15中列出了根据入选标准A或B的受试者分类。符合入选标准的那些人在本研究中不匹配年龄或性别。
表15
男性 女性 平均年龄
A组健康的 41 59 45.5
B组疑似DE 31 67 58.6
在每个研究组中招募的受试者符合健康或疑似干眼症的入选标准。唯一显示出两组间显著差异的人口统计标准是年龄；初步分析显示两组之间的任何泪液度量无显著差异。另外，两组都显示了基准测试参数的一系列值。根据这一观察，将所有受试者合并到单个组中，并使用群体四分位数进行分析，假设抽样群体代表了干眼症严重程度的连续区。使用这个概念，对每个基准测试的测量结果进行排名，并将4个四分位数中每一个的平均值与泪液诊断的测量结果进行比较。
四分位数分析：用于TFBUT、劣质染色和Schirmer测试的四分位数分析总结在表16中。这种方法的重点在于极值，四分位数1和4，因为这些代表了每个度量具有最大差异的那些患者。在所有三个测量中，Q1是具有正常患者预期值的四分位数，Q4是具有干眼症有关值的四分位数。例如，Q1中的那些具有12.80秒的平均TFBUT，因此将被认为是正常的，而Q4中的那些具有2.34秒的平均TFBUT，这与中度干眼病的诊断一致。当比较每个TFBUT定义的四分位数中和/或角膜染色的测试参数的平均值时，出现了破裂时间度量与泪液成分动力学之间的关联。Q1与Q4之间TFBUT的减少伴随着粘蛋白的减少。由Schirmer分数定义的四分位数显示出负相关性，例如，当平均Schirmer评分从Q1降低至Q4时，粘蛋白的量增加。粘蛋白定义的四分位数显示出与角膜染色分数的显著相关性，并且也表现出与症状分数OSDI和Ora Calibra眼部不适分数的相关性。增加的粘蛋白值与更大的症状分数、更强的角膜染色分数和降低的Schirmer分数相关。
表16显示了用于TFBUT、劣质染色和Schirmer测试的四分位数分析。T检验值在显著的(<0.05)情况下用粗体突出显示。
表16
第二轮四分位数分析使用相同的方法来确定由泪液成分值定义的四分位数是否显示与干眼症的体征和症状的其它度量的类似相关性。这些数据显示在表17中。
表17.粘蛋白的四分位数分析。T检验值在显著的(<0.05)情况下用粗体突出显示。
表17
与泪腺蛋白粘蛋白有关的四分位数显示出对于角膜染色测量的显著差异，其中劣质和整个角膜染色以及Schimer测试显示与蛋白质水平从Q1增加到Q4的正相关性。
讨论
目前的研究说明最初招募用于分析的两个受试者群体的异质性。尽管其纳入基于症状学、TFBUT和劣质角膜染色的差异标准，但是在泪液成分分析中没有识别到两个群体之间的统计学上的显著差异。
在一些实施例中，本发明的方法提供了用于测量干眼症的方法，包括泪液成分分析。在一些实施例中，本发明的方法提供了用于测量干眼症的方法，包括泪液成分分析，并将泪液成分分析与诸如但不限于Schirmer测试、TFBUT等的测试进行比较，以便获得信息来治疗被诊断为干眼病的患者。
四分位数分析显示了传统度量与作为泪液成分的一部分的测试参数之间的关系。一个例外是TFBUT，其只表现出与任何测得的泪液成分的适度相关性。相比之下，角膜染色的量度(例如劣质染色，表16)与测试参数的变化密切相关。这与蒸发性干眼症的诊断一致，其中泪液的含水量降低将导致所有泪液成分的浓度明显增加。或者，泪液成分浓度的增加可能归因于眼表面窘迫的炎症反应，其引起严重到粘液泪液分泌物的比率的改变。
在一些实施例中，本发明的方法包括使用至少一个诊断测试。在一些实施例中，在进行健康和干眼病受试者的泪液成分的这种比较中，获得乘法效应。在一些实施例中，使用试剂盒来提供严重患者与健康受试者之间的评估。
实例4：根据本发明的一些实施例的泪液样品中多种成分的测量
开发用于DES的更可靠诊断的一种方法是健康受试者和DES受试者中的主要泪液成分的比较检查。测量多种泪液组成的目的是确定哪些量度或量度的组合可能显示与DES的已建立的量度的可靠的相关性，因此代表新的诊断模式的基础。在对健康和DES患者的泪液成分进行这种比较时，观察到组合的测定可能提供潜在的乘法诊断效果。
在本实例中概述的研究中，受试者接受常用的基准测试，包括角膜染色、Schirmer测试、TFBUT和使用OSDI问卷的症状评估。这些基准测试用来根据在用于其它干眼综合征诊断产品的在先FDA监管批准程序中使用的已建立的评分矩阵来分级每个受试者疾病的严重程度。从每个受试者收集的泪液样品使用针对5种泪液成分的测定进行分析，目的是区分健康受试者的泪液与具有干眼综合症的受试者的泪液。对泪液样品进行溶菌酶、乳铁蛋白、基质金属蛋白酶9、白蛋白和粘蛋白的定量分析，每个按照0.1至2的顺序尺度(ordinalscale)进行评分，增量为0.25。测定结果由两个独立读取器读取作为内部对照；在98％以上的情况下，读取器之间的差异是不显著的。
本实例中概述的这项研究的目的是基于用于其它干眼综合症产品的在先FDA监管批准程序中的FDA定义，评估所开发测定在健康受试者以及干眼症受试者的泪液中的有效性(见以下的纳入和排除标准)。
这是一个前瞻性单中心单次访问平行组数据和泪液收集研究。有一次定期的研究访问，筛选受试者，如果他们符合资格标准则被招募到这项研究中。源文件作为所收集研究数据的CRF。在这项研究中没有测试制品。
在开始本方案指定的任何程序(包括筛选程序)前，从受试者获得书面知情同意。原始签署的知情同意保留所有受试者的受试者记录。对于研究方案依从性，遵循保护受试者的眼部安全性的专业护理标准。
研究群体的选择
将研究群体分成两组：
A组：眼睛健康的受试者(对照；约30名受试者)
B组：干眼综合症受试者(1-4等级；约40名受试者)。
纳入和排除标准
纳入：为了有资格纳入，受试者是：
1.至少30岁，可以是任何种族和性别；
2.能够阅读、签名和注明IRB批准的知情同意的日期。此外，知情同意必须由同意该课题的个人签字并注明日期；
3.同意允许从双眼收集泪液样本；
4.愿意遵守研究程序和访问日程；
5.符合阴性对照、1级、2级或3-4级的适用严重等级标准；
排除：如果以下情况，则排除受试者：
1.受试者对局部麻醉剂或荧光素染料过敏；
2.受试者在过去3个月内具有眼部损伤、创伤或眼部手术史；
3.受试者已知具有泪道***的阻塞；
4.受试者目前进行过例如青光眼、***反应或结膜炎的慢性眼睛综合症的药物治疗；
5.受试者患有一个病症，主要研究者认为这会干扰最佳的研究参与，或者会给受试者带来特殊的风险；
6.受试者在过去7天内戴过隐形眼镜；
7.受试者在招募30天内使用调查研究药物或研究装置；
8.受试者曾做过角膜屈光手术，包括RK、LASIK或PRK手术；
9.受试者目前患有活跃性眼内炎症或眼内炎症史，例如，葡萄膜炎。
10.受试者在过去30天内使用口服多西环素、皮质类固醇或免疫调节剂；
11.受试者在过去30天内接受了局部眼用皮质类固醇、局部眼用非甾体(NSAID)治疗或局部眼用环孢菌素；
12.受试者是怀孕或哺乳的女性；
13.受试者在泪液收集前14天内曾使用过任何局部眼科药物，不包括人工泪液；或者
14.受试者在泪液收集24小时内使用过任何人工泪液。
研究程序
严重性分级方案：用于限定对照和干眼症受试者的分级方法基于以下分类方案：
表18-干眼分级
研究目标招募：按受试者等级的招募如下：
阴性对照：约30个受试者
1级：约5个受试者
2级：约5个受试者
3-4级：约30个受试者。
访问和检查：访问1(基线和泪液收集)：
1.获得人口统计信息、医疗和眼科病史以及人工泪液使用(如果适用)。
2.指示受试者完成问卷和Ora CalibraTM眼部不适&4-症状问卷。
3.进行视敏度。
4.进行裂隙灯检查。
5.对双眼进行睑板腺评估。
6.使用毛细管从受试者右眼收集6-25微升泪液。
7.对收集眼进行泪膜破裂时间测试。
8.对收集眼进行角膜荧光素染色并检查眼表面。
9.对收集眼进行未麻醉的Schirmer测试。
10.分配受试者研究号，根据诊断等级在标签上记录。
11.如适用，记录任何不利事件。
访问2程序：如果受试者的访问1泪液不能被分析(例如体积不足)，则要求受试者返回进行第二次访问以收集泪液。
1.进行视敏度。
2.进行裂隙灯检查。
3.使用毛细管从受试者的合格眼收集6-25微升泪液。
分析和安全变量
泪液测量：分析泪液中溶菌酶、乳铁蛋白、基质金属蛋白酶9、白蛋白和粘蛋白的总量度，在逻辑回归中作为按0.1至2的可视线强度等级分级的解释性变量，增量为0.25，以确定与1-4级干眼症受试者或健康受试者的关联。
泪液成分以单变量方式分析以与干眼症相关联。使用正向选择(forwardselection)程序，其中将最初的解释性变量放置在模型中后，将额外的主效应项(在双侧α＝0.10的单变量分析中是显著的)放置在模型中以及相应的双向交互项和其它主效应项已与模型中，添加项并保持在双侧α＝0.05下。如果交互项符合要添加的标准，则还添加主效应项。
干眼症评估：如上所述对受试者筛查干眼综合症的体征和症状。表19招募的受试者人口统计
结果
总共74位受试者完成研究，包括5位分别分类为1级或2级干眼症，34位受试者具有3级或4级以及30位健康对照。表5-2总结了人口统计。干眼综合症患者更可能是女性(3/4级受试者为34/44，对照为15/30)，而且更可能年龄较大。
初始筛选的结果：泪液成分分析结果显示，在对每一种的单变量Wald卡方分析中，仅白蛋白显示出与总干眼症分数(P＝0.0370)的显著(P小于0.05)相关性。
泪液分析结果建模：总共74名受试者，44名1-4级干眼症和30名健康受试者被包括在预测模型的开发中。作为该过程的第一步，建立了基于白蛋白测量的预测算法。只使用白蛋白的模型是：
表20：模型0-仅白蛋白
使用这些项，给定泪液白蛋白分数的干眼症(1-4级)受试者的概率计算如下：
在计算这个概率后，基于概率将受试者分配到一个组(干眼症或健康的)。使用50％的截止概率，该模型在34/44＝77.4％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在9/30＝30.0％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
在将截止概率增加至60％后，模型在30/44＝68.2％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在19/30＝63.3％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
在组合模型中，将所有变量与每个双向交互一起输入模型中；实施反向选择程序用以去除在双侧α＝0.10下不显著的项。如果交互项符合要添加的标准，则还要求主效应项。由于西班牙裔/拉丁裔受试者数量小，所以模型拟合存在问题，包括模型种族。因此，去除种族及其所有双向交互。
所得模型产生白蛋白、乳铁蛋白、年龄、性别和白蛋白*乳铁蛋白作为显著的解释性变量，并且具有以下最大似然估计以估计身为3/4级干眼症受试者的受试者的对数发生比：
表21：模型1-白蛋白乳铁蛋白+人口统计
基于该模型，用下列表达式计算给定白蛋白、乳铁蛋白、年龄和性别分数的干眼症(GI-4)受试者的概率：
在计算这个概率后，然后基于该概率将受试者分配到一个组(干眼症或健康的)。使用50％的截止概率，该模型在39/44＝88.6％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在23/30＝76.7％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
在将截止概率增加至55％后，模型在37/44＝84.1％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在24/30＝80.0％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
进一步将截止概率增加到60％，模型在36/44＝81.8％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在26/30＝86.7％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
该模型的结果证明选择55％或60％的截止概率产生大于或等于80％的灵敏度和特异性。
将溶菌酶单独添加到模型1中没有产生模型的灵敏度或特异性的任何差异。相比之下，添加交互项溶菌酶*白蛋白和溶菌酶*乳铁蛋白确实因交互项产生了额外的预测能力，所以构建了组合所有这些项的第二个模型。
表22：模型2-白蛋白/溶菌酶/乳铁蛋白/人口统计
使用50％的截止概率，该模型在40/44＝90.9％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在23/30＝76.7％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
在将截止概率增加至55％后，模型在38/44＝86.4％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在26/30＝86.7％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
进一步将截止概率增加到60％，模型在36/44＝81.8％的时间正确地将干眼症受试者分类为患有干眼症，并且在27/30＝90.0％的时间正确地将健康受试者分类为健康的。
添加溶菌酶以及溶菌酶*白蛋白和溶菌酶*乳铁蛋白交互在每个截止概率下略微提高了灵敏度和特异性。
在研究过程中没有报道出不良事件或安全问题。
讨论和总结论
本实例中概述的研究的目的是评估本发明的方法在健康受试者以及具有干眼综合症的受试者的泪液中的有效性。首先，使用标准化的分级***来定义和区分健康受试者群体与具有不同等级的干眼综合症的那些群体。这个评分方案是由四个确定的基准测试组成，用于评估干眼症的体征和症状。这个定义先前用于美国监管临床试验和称为的诊所(in-office)干眼症筛选测试的FDA批准过程，这是一种基于泪液MMP9水平检测的测试。
也对使用标准化***分级的研究受试者测定基于其提供干眼严重性的客观测量的潜力而选择的小组泪液成分。将观察到的线强度和受试者人口统计数据用于构建预测性统计模型，作为判断哪种开发的测定可以提供最佳诊断能力的手段。
所开发测定的结果表明白蛋白是预测模型所基于的最佳被测物(assay)，因为它显示识别DES受试者的最高有效性。然而，额外测定的纳入提供了甚至更高灵敏度和特异性的机会。为此，并且因为我们知道DES是一个多因素综合症的这个事实，所以我们进行了所有的测定，然后将它们结合到一个模型中来问这个问题，给以每个受试者的泪液成分分数，灵敏度和特异性可以是这些成分在其诊断DES的能力方面上的组合。
测试灵敏度表示正确识别为具有DES的受试者的数目，而特异性表示正确识别为健康对照的受试者的数目。这些值可以组合在阳性预测值(PPV)中，这是衡量那些确定为DES患者具有干眼症的受试者的哪个部分。理想的测试将具有高灵敏度和高特异性。表23显示了基于不同测定结果的不同模型的灵敏度和特异性的比较。
就目前而言，在市场上有两个主要的DES诊断商业测试，都涉及患者群体的异质性并且依靠单一参数进行中继，并试图诊断多因素疾病-(诊断使用点为炎症标记物MMP914提供了阳性或阴性测定)和***，其提供了在302至328mOsm范围内的泪液渗透压的数值输出，其范围包括正常和超高渗透压值。装置和渗透压***提供被设计用于设置门诊访问的客观的诊断测试；两者在赞助的临床试验中表现良好。
表23：模型比较
来自模型2(表7-1)的灵敏度和特异性值与包括渗透压***或的商业诊断(表24)是一致的。这个结果支持了模型2组合测定作为干眼症诊断的潜在用途。特别值得注意的是，研究的评分方案使用了这一研究中使用的同一组用于干眼症的诊断标准14，这是比较不同测试性能的主要变量。
研究结果还显示，模型2能够以优于明确的现有测试，特别是在临床医生办公室的环境下通常进行的测试的灵敏度和特异性诊断干眼症：Schirmer测试、TFBUT、症状问卷(如ODSI)或角膜染色。
表24：其它干眼症测试的特征
虽然在一些测试中，和装置都表现出良好的灵敏度和特异性，但在这两种情况下都存在关于它们作为诊断方法(diagnostic)的整体可靠性的争论，这主要是因为这两个测试涉及患者群体的异质性并且依靠单一参数来试图诊断多因素疾病。例如，最近的几项研究得出结论：基于渗透压测量与干眼症的其它体征或症状之间没有相关性。同样，虽然的初步评估以高敏感度和特异性将其分级，但最近的研究发现与MMP9检测装置和其它干眼症测试的结果几乎没有相关性。这种差异可能归因于样品收集方法的差异。
***和目前的研究都从眼睛的侧面轻轻地收集泪液。相比之下，采样涉及下眼脸的相对侵入性的摩擦。直接比较使用两种收集方法的MMP9水平对于解决MMP9结果差异的基础是必要的。
对于来自该研究的模型的进一步测试，使用模型2测试来自包括疑似健康和DES患者(根据不同纳入标准招募)的DiagnosTear第一临床测试的数据集(dataset)；结果如表25所示。
表25：第一临床测试结果的测试模型
作为本研究中开发的模型的测试，测试更大的群体或其它干眼症分级方案是有价值的。例如，包含结膜染色组分的分级方案已用于泪液蛋白质组学的最新研究。此外，用于研究的样本量也可能由于受试者群体的年龄和性别差异而引起偏差，但这是未来测试中可以解决的问题。
炎症是干眼症的病因学中已知的因素，并且暴露于促炎信号的组织响应于血管渗透性增加和来自局部脉管***的渗出性流体损失。这种渗出物可以随着电解质浓度增加(即渗透压增加)和白蛋白浓度升高而影响泪膜组合物。因此，本研究中使用的标志物允许综合测量干眼症表型的几个后遗症。
使用白蛋白作为诊断信息(diagnostic)具有坚实的科学依据。白蛋白从扩张的结膜血管扩散到泪膜中，在眼睛闭合和创伤期间其浓度增加。因此，泪液的白蛋白水平可被认为是眼表面完整性的标记。此外，任何炎症事件中的标志性响应之一是血管渗透性的增加，并且随着增加，期望循环血浆(其中白蛋白浓度在3％至5％范围内)中可溶性组分从血管***流出进入泪膜的流量增加是合理的。这项测试(和其它研究)的结果证实，泪膜白蛋白的显著变化与干眼症确实有关。
目前还没有报道证明白蛋白在泪液中的任何清楚的生理学作用。虽然如此，但是眼部炎症的临床前研究使Shimura等(2003)认为泪膜中的白蛋白可能代表在流泪减少或杯状细胞损失后对可溶性粘蛋白减少的代偿性响应。研究显示白蛋白似乎减少大鼠上皮细胞的细胞凋亡，表明血清衍生蛋白对眼部炎症反应有积极的作用。他们还建议，泪液白蛋白是眼表面完整性的一个特定标记，这一观点得到了DiagnosTear第一临床研究结果的支持——其中观察到白蛋白与角膜染色之间的显著的正相关。
来自单独的白蛋白(模型0)的结果比使用多次测定的结果稳健性差，但是可以受益于仅测量单一泪液成分的简单性，其中过程或测定干扰问题的可能性被最小化。相反，根据染色和其它传统的干眼症测试，在OSDI调查中分数低的无症状但符合干眼症标准的受试者中检测多重测定模型的诊断能力也是值得的。这些受试者由于其不适程度低而特别容易造成眼表面损伤。
已经确定了溶菌酶和乳铁蛋白在干眼症中的潜在作用有一段时间，因为它们是已知的泪腺产物和泪膜的健康水相的两种主要组分。这些蛋白质的水平代表了泪腺产生的量度，因此泪膜中其浓度的任何改变都意味着泪腺功能障碍。泪液中的其它标记物包括炎性产物，例如MMP9；这样的泪液标记物反映炎症细胞的局部的泪管周围浸润。
就我们所知，我们首次证明，起源于眼中不同位置的蛋白质水平的组合具有诊断DES的显著能力。将这两种泪液成分中的一种或多种的变化与白蛋白组合的测试将对眼表面挑战(challenge)采样两种不同的生理反应，因此可以提供更稳健的诊断输出。
研究结果证实多测定方法可能提供用于识别和治疗干眼综合症的最佳诊断工具。
在健康受试者和符合轻度至中度干眼症的一个或多个标准的受试者中检查了主要泪液成分的水平。以下实验说明了用于干眼症评估的基准测试与泪液成分的定量测量之间的比较。用于定量测量至少一种泪液成分的测试的实例是角膜染色、Schirmer测试、TFBUT、和包括OSDI问卷和Ora-CalibraTM眼部不适分数的提供的症状评估。OSDI是一个12个问题的评估，其已经成为干眼症状的标准。用于不适的Ora-CalibraTM评估也通过允许患者回答问题来提供对症状的量度，其中与OSDI相比，问题的数量减少。使用毛细管收集泪液样品，然后分析泪液成分。测得的泪液成分是粘蛋白。
本文引用的公开在此通过引用整体并入。虽然以上通过参考实例和优选实施例已经说明了本发明的多个方面，但是应该理解，本发明的范围不是由上述说明限定的，而是由在专利法原则下适当解释的以下权利要求限定的。

Claims (9)

1.一种方法，其中所述方法将受试者分类为患有干眼症，所述方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由所述受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白的水平；
c.由所确定的人血清白蛋白的水平，为确定的人血清白蛋白的量分配分数；以及
d.由所分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数：
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则所述受试者具有干眼症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有50％的截止概率分数，并且77％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且30％的时间正确地将受试者分类为健康的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有60％的截止概率分数，并且68％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且63％的时间正确地将受试者分类为健康的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中使用装置执行确定所述泪液样品中的人血清白蛋白的水平的步骤，所述装置包括：
a.测试条，其配置为从所述患者接收泪液样品；以及
b.包含对人血清白蛋白特异的试剂的试剂垫，所述试剂垫在与所述泪液样品接触时进行反应，所述反应配置为产生颜色，其中所述颜色的强度与所述泪液样品中的人血清白蛋白的量成比例，并且其中所述测试条配置为将所述泪液样品递送到所述试剂垫。
5.一种方法，其中所述方法将受试者分类为患有干眼症，所述方法由以下组成：
a.获得人口统计数据，其由所述受试者的年龄和性别组成；
b.从患者获得泪液样品，并确定人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的水平；
c.由所确定的人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的水平，为确定的人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶的量分配分数；以及
d.由所分配的分数，根据以下等式计算截止概率分数：
其中如果所计算的截止概率分数是50％至60％，则所述受试者具有干眼症。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法具有50％的截止概率分数，并88％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且76％的时间正确地将受试者分类为健康的。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述方法具有55％的截止概率分数，并84％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且80％的时间正确地将受试者分类为健康的。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法具有60％的截止概率分数，并81％的时间正确地将受试者分类为具有干眼症，并且86％的时间正确地将受试者分类为健康的。
9.根据权利要求5所述的方法，其中使用装置执行确定选自由人血清白蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶组成的群组的至少一种泪液成分的水平的步骤，所述装置包括：
a.测试条，其配置为从所述患者接收泪液样品；以及
b.多个试剂垫，其中第一单个试剂垫包含对人血清白蛋白特异的试剂，第二试剂垫包含对溶菌酶特异的试剂，并且第三试剂垫包含对乳铁蛋白特异的试剂，其中所述第一试剂垫、所述第二试剂垫和所述第三试剂垫中的所述试剂在与所述泪液样品接触时进行反应，所述反应配置为产生颜色，其中所述颜色的强度与所述泪液样品中的所述人血清白蛋白、溶菌酶和乳铁蛋白的量成比例，并且其中所述测试条配置为将所述泪液样品递送到所述多个试剂垫。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10527628B2 (en) 2015-05-01 2020-01-07 Diagnostear, Ltd. Method for measuring tear constituents in a tear sample
US20190302028A1 (en) * 2016-01-14 2019-10-03 Diagnos Tear, Ltd. Method for Measuring Tear Constituents in a Tear Sample

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102026648A (zh) * 2008-05-15 2011-04-20 株式会社·R-技术上野 用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的药物组合物
CN103336132A (zh) * 2013-07-08 2013-10-02 无锡安迪生物工程有限公司 一种检测泪液中乳铁蛋白的方法及其专用胶体金检测卡
CN104094114A (zh) * 2011-11-30 2014-10-08 黛尔格诺斯蒂尔有限公司 干眼诊断
US20140314715A1 (en) * 2013-04-22 2014-10-23 Georgia Regents University Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Sjogren's Syndrome

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4015462A (en) 1976-01-08 1977-04-05 Miles Laboratories, Inc. Device and method for the determination of the specific gravity or osmolality of a liquid
EP0236023A3 (en) 1986-03-03 1988-09-07 Seymour Norman Blackman Non-invasive blood glucose level monitoring method
SU1534406A1 (ru) 1987-11-25 1990-01-07 Военно-Медицинская Краснознаменная Академия Им.С.М.Кирова Способ диагностики скрытой формы сахарного диабета
US5170799A (en) 1988-02-20 1992-12-15 Showa Yakuhin Kako Co., Ltd. Test strip for measuring tear production
US5006310A (en) 1989-11-03 1991-04-09 Visionex Schirmer tear test
US5435970A (en) 1989-12-18 1995-07-25 Environmental Diagnostics, Inc. Device for analysis for constituents in biological fluids
GB8928501D0 (en) 1989-12-18 1990-02-21 Unilever Plc Reagents
IE904365A1 (en) 1990-02-13 1991-08-14 Epitope Stick probe device for detection of antibodies
GB9028038D0 (en) 1990-12-24 1991-02-13 Nycomed Pharma As Test method and reagent kit therefor
US5260069A (en) 1992-11-27 1993-11-09 Anda Sr Pharmaceuticals Inc. Pulsatile particles drug delivery system
US5352411A (en) 1993-08-13 1994-10-04 Khuri Raja N Device for determination of tear constituents
US5744096A (en) 1997-02-21 1998-04-28 Cholestech Corporation Automated immunoassay cassette
CA2216189A1 (en) 1997-11-12 1999-05-12 Jia Bei Zhu One-step semi-quantitative/multiple items test kit
US20020182600A1 (en) 2001-04-11 2002-12-05 Smith Jack V. Method for assaying biological and other constituents using synthetic nucleounits in lateral flow, liquid, and dry chemistry techniques
US8323903B2 (en) 2001-10-12 2012-12-04 Life Technologies Corporation Antibody complexes and methods for immunolabeling
AU2002364609B2 (en) 2001-12-28 2008-04-03 Polymer Technology Systems, Inc. Test strip for determining concentration of multiple analytes in a single fluid sample
US7244394B2 (en) 2002-10-03 2007-07-17 Novartis Ag Methods and kits for assays of analytes of interest in tears
US7134998B2 (en) 2003-02-10 2006-11-14 Kao Corporation Tear secretion quantity examination system
WO2004112694A2 (en) 2003-05-23 2004-12-29 Chiron Corporation Immunogenic reagents from west nile virus
US7129717B2 (en) 2003-11-19 2006-10-31 Ocusense, Inc. Systems and methods for measuring tear film osmolarity
US20050214161A1 (en) 2004-03-23 2005-09-29 Gupta Surendra K Test device for simultaneous measurement of multiple analytes in a single sample
US7887750B2 (en) 2004-05-05 2011-02-15 Bayer Healthcare Llc Analytical systems, devices, and cartridges therefor
US7629127B2 (en) 2005-01-21 2009-12-08 Dexall Biomedical Labs, Inc. Method for the visual detection of specific antibodies by the use of lateral flow assays
JP4586130B2 (ja) 2005-02-22 2010-11-24 丸石化成株式会社 検体液採取器具
DK1982182T3 (da) 2006-01-19 2012-05-14 Lattec I S Hidtil ukendt tør-stick-indretningskonstruktion og fremgangsmåde til bestemmelse af en analyt i en prøve under anvendelse af denne tør-stick-indretning
US7704702B2 (en) 2006-08-10 2010-04-27 Inverness Medical Switzerland Gmbh Test strip for lateral flow assays
EP2100155B1 (en) 2006-12-11 2022-02-16 Tearlab Research, Inc. Systems and methods for collecting tear film and measuring tear film osmolarity
KR101058743B1 (ko) 2009-06-04 2011-08-24 주식회사 인포피아 콜레스테롤 측정 스트립 및 이를 이용한 콜레스테롤 검출 방법
US10704096B2 (en) 2009-07-07 2020-07-07 University Of Southern California Biomarkers for the early detection of autoimmune diseases
US8307697B2 (en) 2010-04-14 2012-11-13 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Method for estimating viscosity
EP2418491A1 (en) 2010-08-10 2012-02-15 Bioftalmik, S.L. Method for the diagnosis of dry eye and blepharitis
CN103376327A (zh) 2012-04-28 2013-10-30 通用电气公司 检测抗体或融合蛋白的浓度的方法
US10527628B2 (en) 2015-05-01 2020-01-07 Diagnostear, Ltd. Method for measuring tear constituents in a tear sample

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102026648A (zh) * 2008-05-15 2011-04-20 株式会社·R-技术上野 用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的药物组合物
CN104094114A (zh) * 2011-11-30 2014-10-08 黛尔格诺斯蒂尔有限公司 干眼诊断
US20140314715A1 (en) * 2013-04-22 2014-10-23 Georgia Regents University Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Sjogren's Syndrome
CN103336132A (zh) * 2013-07-08 2013-10-02 无锡安迪生物工程有限公司 一种检测泪液中乳铁蛋白的方法及其专用胶体金检测卡

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAIJUN LI: ""Quantification of tear proteins and sPLA2-IIa alteration in patients with allergic conjunctivitis"", 《MOLECULAR VISION 2010》 *
MICHAEL A. LEMP 等: ""Tear Osmolarity in the Diagnosis and Management of Dry Eye Disease"", 《ELSEVIER》 *
PIERA VERSURA 等: ""Diagnostic performance of a tear protein panel in early dry eye"", 《MOLECULAR VISION》 *
SRUTHI SRINIVASAN 等: ""iTRAQ Quantitative Proteomics in the Analysis of Tears in Dry Eye Patients "", 《INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE》 *

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Publication number Publication date
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