CN107727714A - 一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器的制备方法,特点是基于碳纳米角(CNHs)及八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)纳米材料,引入二萘嵌苯衍生物(PTC‑NH2)及鲁米诺(luminol)两种信号探针,制备一种硅酞菁敏化的比率型电化学发光免疫传感器,并用于***特异性抗原(PSA)的检测。具有大比表面积的CNHs及较高孔隙率的OAMs作为生物传感器平台可以承载大量的生物分子及信号探针,同时,六氟双酚A‑硅酞菁(HFSPC)的吸电子基团可加速鲁米诺失去电子,得到一个增强的ECL信号。基于上述优点,所制得的比率型电化学发光免疫传感器,具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测限低等优点,可用于***特异性抗原(PSA)的检测,在临床应用方面具有较为重要的应用价值及实际意义。
Description
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域,具体涉及一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型***特异性抗原(PSA)电化学发光免疫传感器的制备方法。
背景技术
比率法,一种新的分析方法,其量化取决于两信号的比率而不是绝对值,已经逐步被应用在荧光、电化学发光、光电和电化学等领域,相比其他分析技术,电化学发光具有灵敏度高、简单、快速反应等优点,其与比率型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景。电化学发光免疫传感器,利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类生物传感器,具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点,具有良好的应用前景。本发明制备了一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器,并实现对***特异性抗原的高灵敏检测。
碳纳米角是一种新型的碳纳米材料,由于碳纳米角呈大丽花状结构,表面具有非常多的配位点,表现出良好的电子导电性、大的比表面积和高的空隙容量等化学特性,在构建良好的电化学传感器中得到了广泛关注。TiO2纳米材料因其独特的光催化活性、无毒性,优异的化学和物理稳定性,使其成为光催化和光电化学传感器的理想材料,其性能一般受晶型、晶粒大小、晶面、结晶度、比表面积、微结构等的影响。TiO2介晶是晶体亚单元有序排列构成的,相比于传统的TiO2单晶,TiO2介晶具有更加优良的性能。本发明基于碳纳米角(CNHs)及八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)纳米材料,引入二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)及鲁米诺(luminol)两种信号探针,制备一种硅酞菁敏化的比率型电化学发光免疫传感器,并用于***特异性抗原(PSA)的检测。具有大比表面积的CNHs及较高孔隙率的OAMs作为生物传感器平台可以承载大量的生物分子及信号探针,同时,六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)的吸电子基团可加速鲁米诺失去电子,得到一个增强的ECL信号。基于上述优点,所制得的比率型电化学发光免疫传感器,具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测限低等优点,可用于***特异性抗原(PSA)的检测,在临床应用方面具有非常重要的应用价值及实际意义。
发明内容
本发明的目的之一是基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料,构建一种无标记,稳定性好,灵敏度高的电化学发光免疫传感器及其制备方法。
本发明的目的之二是将该电化学发光免疫传感器应用于***特异性抗原的高灵敏检测。
为实现发明目的,本发明采用如下技术方案:
1.一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型***特异性抗原(PSA)电化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依序用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加3μL 浓度为3 mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得CNHs修饰玻碳电极;
(3)滴加3μL 0.2mmol/L鲁米诺(luminol), 2mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及2mg/mL六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)混合溶液于修饰电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极;
(4)将luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰电极浸入浓度比为1:2的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液中50min,再浸入30 μL浓度为2 mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)标记的***特异性抗原抗体(Ab1)溶液中并在4°C冰箱中孵育45min,用去离子水洗去物理吸附的Ab1,制得HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极;
(5)取60μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 滴加到步骤(4)修饰电极表面4°C冰箱中孵育1 h,以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(6)将步骤(5)获得的修饰电极浸入不同浓度的***特异性抗原(PSA)标准溶液中并在4°C冰箱中孵育1 h,用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面,制得PSA/HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极。
(7)将步骤(6)获得的修饰电极浸入50μL二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)、八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)和***特异性抗原抗体(Ab2)(PTC-NH2@OAMs@ Ab2)组成的复合物溶液中并在4°C冰箱中孵育50 min,用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面,制得PTC-NH2@OAMs@ Ab2/PSA/HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极,并保存在4°C冰箱中。
2.上述鲁米诺(luminol), 羧甲基壳聚糖(CMCS)及六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)混合溶液由下述方法制备的:通过简单混合 2mmol/L鲁米诺(luminol), 20mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及20mg/mL六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)的溶液简单混合并适当加入一定体积的水再均匀混合而制备成。
3.上述六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)由下述方法制备的:将0.20 g SiPcCl2、0.24g六氟双酚A和0.14 g无水K2CO3置于30ml甲苯溶剂中在110ºC 下回流48小时,然后将反应混合物冷却至室温并将溶剂减压蒸发至干,随后将固体产物置于索氏提取器中用二氯甲烷纯化24小时,被提取的物质重结晶后用体积比为1:1的甲醇和去离子水的混合液淋洗,然后重新溶解于二氯甲烷中。
4.上述二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)、八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)和***特异性抗原抗体(Ab2)(PTC-NH2@OAMs@ Ab2)复合物溶液由下述方法制备的:1)体积比为1:1的6mg/ml OAMs溶液与1 wt % 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合震荡6 h,离心收集沉淀物,然后再分散在去离子水,得到NH2- OAMs溶液;2) 体积比为1:4 的5 mg/ml PTC-NH2与4mg/ml NH2- OAMs溶液混合震荡1 h,离心收集沉淀物,然后再分散在去离子水,得到PTC-NH2@ OAMs溶液;3)将100μL Ab2及100μL PTC-NH2 @ OAMs溶液及60μl浓度比为1:2的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合液混合并在4°C下放置12 h,离心收集沉淀物并分散在pH 7.4的PBS溶液中,然后加入0.5 wt %BSA去除非特异性吸附位点。
5.上述的二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)由下述方法制备的: 20mg 3,4, 9,10-四羧酸二酐(PTCDA)在2 mL丙酮中搅拌溶解,随后将0.1ml无水乙二胺(C2H8N4)在4°C下缓慢地加入到上述溶液中.然后离心、洗涤至pH为7.4,去除过量的乙二胺。最后,将所得产物均匀分散在4ml去离子水中,储存在4°C冰箱中。
6.上述的八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)材料由下述方法制备的:1.2克的锐钛矿型TiO2粉末溶解于60mL浓度为18mol/ml的 KOH溶液中,搅拌20分钟后,将悬浮液移入一个100ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜内;密封反应器, 170ºC 下反应72小时,冷却到室温;然后,用稀醋酸溶液洗涤沉淀至沉淀pH值为3.5,沉淀离心后在65ºC下干燥12 小时得到产物钛酸纳米线.;取400mg前驱体钛酸纳米线分散在70ml稀醋酸中,于100聚四氟乙烯高压反应釜中200ºC条件下反应 48h,所得到的产物用蒸馏水和无水乙醇离心洗涤,60ºC条件下烘干12 h并400ºC下煅烧 30分钟,以除去残余的有机物,制得OAMs。
7.***特异性抗原(PSA)的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以上述制备方法制备的一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为对电极,在10 mmol/ml K2S2O8的pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用双电位模式对不同浓度的***特异性抗原(PSA)标准溶液进行检测,初始电位- 0.8 V,脉冲周期5秒,脉冲时间40秒,脉冲电位0.6 V和脉冲周期3秒,通过电致化学发光设备采集-0.8 V的ECL信号强度(Ic)及0.6 V的ECL信号强度(Ia),通过其比率值(Ic/Ia)与***特异性抗原(PSA)标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)待测样品溶液代替***特异性抗原(PSA)溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为:
(1)比率法,一种新的分析方法,其量化取决于两信号的比率而不是绝对值,已经逐步被应用在荧光、电化学发光、光电和电化学等领域。相比其他分析技术,电化学发光具有灵敏度高、简单、快速反应等优点,其与比率型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景。
(2)具有大比表面积的CNHs及较高孔隙率的OAMs作为生物传感器平台可以承载大量的生物分子及信号探针,同时,六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)的吸电子基团可加速鲁米诺失去电子,得到一个增强的ECL信号。本发明制备的免疫传感器具有较好的稳定性。
(3)本发明利用抗原、抗体的免疫反应,提高了检测方法的特异性。
附图说明
图1为八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)材料、二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)及PTC-NH2@ OAMs复合物溶液的红外光谱(IR)图。
图2为免疫传感电极的电化学发光响应信号与***特异性抗原(PSA)标准溶液浓度的线性关系图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明,但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型***特异性抗原(PSA)电化学发光免疫传感器的制备:
(1) 玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依序用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2) 滴加3μL 浓度为3 mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得CNHs修饰玻碳电极;碳纳米角采用本领域一般技术人员能实现的方法制备。
(3) 滴加3μL 0.2mmol/L鲁米诺(luminol), 2mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及2mg/mL六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)混合溶液于修饰电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极;
(4) 将luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰电极浸入浓度比为1:2的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液中50min,再浸入30μL浓度为2 mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)标记的***特异性抗原抗体(Ab1)溶液中并在4°C冰箱中孵育45min,用去离子水洗去物理吸附的Ab1,制得HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极;***特异性抗原抗体可以采用北京博奥生物技术有限公司生产。
(5) 取60μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 滴加到步骤(4)修饰电极表面4°C冰箱中孵育1 h,以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(6) 将步骤(5)获得的修饰电极浸入不同浓度的***特异性抗原(PSA)标准溶液中并在4°C冰箱中孵育1 h,用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面,制得PSA/HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极。
(7) 将步骤(6)获得的修饰电极浸入50μL二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)、八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)和***特异性抗原抗体(Ab2)(PTC-NH2@OAMs@ Ab2)组成的复合物溶液中并在4°C冰箱中孵育50 min,用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面,制得PTC-NH2@OAMs@ Ab2/PSA/HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极,并保存在4°C冰箱中。
上述浓度为0.2mmol/L的鲁米诺(luminol)、浓度为2mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及浓度为2mg/mL的六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)混合溶液由下述方法制备的:将浓度为2mmol/L鲁米诺(luminol), 浓度为 20mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及浓度为20mg/mL六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)的溶液简单混合并适当加入一定体积的水再均匀混合而制备成的。
上述六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)由下述方法制备的:将0.20 g SiPcCl2、0.24g六氟双酚A和0.14 g无水K2CO3置于30ml甲苯溶剂中在110ºC 下回流48小时,然后将反应混合物冷却至室温并将溶剂减压蒸发至干,随后将固体产物置于索氏提取器中用二氯甲烷纯化24小时,被提取的物质重结晶后用体积比为1:1的甲醇和去离子水的混合液淋洗,然后重新溶解于二氯甲烷中。
实施例2
实施例1中的八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)材料的制备:1.2克的锐钛矿型TiO2粉末溶解于60mL浓度为18mol/ml的 KOH溶液中,搅拌20分钟后,将悬浮液移入一个100ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜内;密封反应器, 170ºC 下反应72小时,冷却到室温;然后,用稀醋酸溶液洗涤沉淀至沉淀pH值为3.5,沉淀离心后在65ºC下干燥12 小时得到产物钛酸纳米线.;取400mg前驱体钛酸纳米线分散在70ml稀醋酸中,于100聚四氟乙烯高压反应釜中200ºC条件下反应 48h,所得到的产物用蒸馏水和无水乙醇离心洗涤,60ºC条件下烘干12 h并400ºC下煅烧 30分钟,以除去残余的有机物,制得OAMs。
实施例3
实施例1中的二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)的制备: 20mg 3,4, 9,10-四羧酸二酐(PTCDA)在2 mL丙酮中搅拌溶解,随后将0.1ml无水乙二胺(C2H8N4)在4°C下缓慢地加入到上述溶液中.然后离心、洗涤至pH为7.4,去除过量的乙二胺。最后,将所得产物均匀分散在4ml去离子水中,储存在4°C冰箱中。
实施例4
实施例1中的二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)、八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)(PTC-NH2@OAMs)复合物溶液的制备:1)体积比为1:1的6mg/ml OAMs溶液与1 wt % 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合震荡6 h,离心收集沉淀物,然后再分散在去离子水,得到NH2- OAMs溶液;2) 体积比为1:4 的5 mg/ml PTC-NH2与4 mg/ml NH2- OAMs溶液混合震荡1 h,离心收集沉淀物,然后再分散在去离子水,得到PTC-NH2 @ OAMs溶液。图1为八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)材料、二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)及PTC-NH2 @ OAMs复合物溶液的红外光谱(IR)图。相比于OAMs,PTC-NH2 @ OAMs在1599 cm-1处有二萘嵌苯骨架的缩合芳环的特征峰,此外,在1771和1301 cm-1处C = O和C–N伸缩振动特征峰,和在1637 cm-1处N–H的弯曲振动特征峰,说明PTC-NH2已经成功地固定在OAMs。
实施例5
***特异性抗原(PSA)的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以实施例1制备的一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为对电极,在10 mmol/ml K2S2O8的pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用双电位模式对不同浓度的***特异性抗原(PSA)标准溶液进行检测,初始电位- 0.8 V,脉冲周期5秒,脉冲时间40秒,脉冲电位0.6 V和脉冲周期3秒,通过电致化学发光设备采集-0.8 V的ECL信号强度(Ic)及0.6 V的ECL信号强度(Ia),通过其比率值(Ic/Ia)与***特异性抗原(PSA)标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线,图2为免疫传感电极的电化学发光响应信号与***素E1标准溶液浓度的线性关系图;
(3)待测样品溶液代替***特异性抗原(PSA)溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依序用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2) 滴加3μL 浓度为3 mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得CNHs修饰玻碳电极;
(3) 滴加3μL 浓度为0.2mmol/L的鲁米诺(luminol)、浓度为2mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及浓度为2mg/mL的六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)混合溶液于修饰电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极;
(4) 将luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰电极浸入浓度比为1:2的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液中50min,再浸入30μL浓度为2 mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)标记的***特异性抗原抗体(Ab1)溶液中并在4°C冰箱中孵育45min,用去离子水洗去物理吸附的Ab1,制得HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极;
(5) 取60μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 滴加到步骤(4)的修饰电极表面4°C冰箱中孵育1h,以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(6) 将步骤(5)获得的修饰电极浸入不同浓度的***特异性抗原(PSA)标准溶液中并在4°C冰箱中孵育1 h,用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面,制得PSA/HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极。
(7) 将步骤(6)获得的修饰电极浸入50μL二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)、八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)和***特异性抗原抗体(Ab2)(PTC-NH2@OAMs@ Ab2)组成的复合物溶液中并在4°C冰箱中孵育50 min,用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面,制得PTC-NH2@OAMs@Ab2/PSA/HRP-Ab1/luminol@CMCS@HFSPC/CNHs修饰玻碳电极,并保存在4°C冰箱中。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的浓度为0.2mmol/L的鲁米诺(luminol)、浓度为2mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及浓度为2mg/mL的六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)混合溶液由下述方法制备的:将浓度为2mmol/L鲁米诺(luminol), 浓度为 20mg/mL羧甲基壳聚糖(CMCS)及浓度为20mg/mL六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)的溶液简单混合并适当加入一定体积的水再均匀混合而制备成的。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述的六氟双酚A-硅酞菁(HFSPC)由下述方法制备的:将0.20 g SiPcCl2、0.24g六氟双酚A和0.14 g无水K2CO3置于30ml甲苯溶剂中在110ºC 下回流48小时,然后将反应混合物冷却至室温并将溶剂减压蒸发至干,随后将固体产物置于索氏提取器中用二氯甲烷纯化24小时,被提取的物质重结晶后用体积比为1:1的甲醇和去离子水的混合液淋洗,然后重新溶解于二氯甲烷中。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)、八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)和***特异性抗原抗体(Ab2)(PTC-NH2@OAMs@ Ab2)复合物溶液由下述方法制备的:1)体积比为1:1的6mg/ml OAMs溶液与1wt% 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合震荡6 h,离心收集沉淀物,然后再分散在去离子水,得到NH2- OAMs溶液;2)体积比为1:4 的5 mg/ml PTC-NH2与4 mg/ml NH2- OAMs溶液混合震荡1 h,离心收集沉淀物,然后再分散在去离子水,得到PTC-NH2 @ OAMs溶液;3)将100μL Ab2及100μL PTC-NH2 @OAMs溶液和60μl浓度比为1:2的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)相混合成混合液并在4°C下放置12 h,离心收集沉淀物并分散在pH7.4的PBS溶液中,然后加入0.5wt%BSA去除非特异性吸附位点。
5.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述的二萘嵌苯衍生物(PTC-NH2)由下述方法制备的:20mg 3,4, 9,10-四羧酸二酐(PTCDA)在2 mL丙酮中搅拌溶解,随后将0.1ml无水乙二胺(C2H8N4)在4°C下缓慢地加入到上述溶液中.然后离心、洗涤至pH为7.4,去除过量的乙二胺。最后,将所得产物均匀分散在4ml去离子水中,储存在4°C冰箱中。
6.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于,所述的八面体锐钛矿型TiO2介晶(OAMs)材料由下述方法制备的:1.2克的锐钛矿型TiO2粉末溶解于60mL浓度为18mol/ml的 KOH溶液中,搅拌20分钟后,将悬浮液移入一个100ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜内;密封反应器, 170ºC 下反应72小时,冷却到室温;然后,用稀醋酸溶液洗涤沉淀至沉淀pH值为3.5,沉淀离心后在65ºC下干燥12 小时得到产物钛酸纳米线.;取400mg前驱体钛酸纳米线分散在70ml稀醋酸中,于100聚四氟乙烯高压反应釜中200ºC条件下反应 48h,所得到的产物用蒸馏水和无水乙醇离心洗涤,60ºC条件下烘干12 h并400ºC下煅烧 30分钟,以除去残余的有机物,制得OAMs。
7.权利要求1-6任一所述的方法制备的一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型***特异性抗原(PSA)电化学发光免疫传感器。
8.权利要求7所述的基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器,其特征在于,用于***特异性抗原(PSA),检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以权利要求7所述的一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为对电极,在10 mmol/ml K2S2O8的pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用双电位模式对不同浓度的***特异性抗原(PSA)标准溶液进行检测,初始电位- 0.8 V,脉冲周期5秒,脉冲时间40秒,脉冲电位0.6 V和脉冲周期3秒,通过电致化学发光设备采集-0.8 V的ECL信号强度(Ic)及0.6 V的ECL信号强度(Ia),通过其比率值(Ic/Ia)与***特异性抗原(PSA)标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)待测样品溶液代替***特异性抗原(PSA)溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
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