CN107723302A - 一种过表达产甘油假丝酵母CgGAD1提高渗透压耐受性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的耐高渗功能基因CgGAD1的克隆及其应用，属于分子生物学、生物技术领域。方法是，从产甘油假丝酵母C.glycerinogenes的染色体基因组DNA中扩增得到γ‑氨基丁酸合成关键酶基因CgGAD1，该基因全长1830bp，无内含子。该基因是耐高渗功能基因，过量表达CgGAD1可增加γ‑氨基丁酸在胞内的积累，提高菌株在高渗条件下的生长。本发明提供了一种利用基因工程手段进一步提高C.glycerinogenes对渗透压耐受性的方法，为其它微生物及高等真核生物的抗逆性改良提供了优良的基因材料及研究思路。

Description

一种过表达产甘油假丝酵母CgGAD1提高渗透压耐受性的方法

技术领域

本发明涉及一种产甘油假丝酵母CgGAD1基因的克隆、过表达及耐高渗透压抗盐性功能分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的酵母菌株，长期被应用于甘油的工业化生产。C.glycerolgenesis具有高产量、高转化率、生产强度大的特点。与S.cerevisiae等常规的模式酵母相比，C.glycerolgenesis具有更高的渗透压耐受性，能够在超过550g/L葡萄糖的培养基中进行正常的生理代谢，因此在浓醪发酵等领域中具有潜在的应用前景。

酵母在生长或增殖过程中，尤其是在工业发酵环境下通常都会遭遇各种外部的环境压力。尤其是外部的高渗透压往往会导致细胞内部水分流失，造成细胞膨胀压的损失，从而引起细胞萎缩，这对酵母生理功能的发挥是极为不利的。为了应对复杂的外部环境压力，酵母细胞在长期进化过程中逐步形成了一系列特定的适应性机制，使其能够准确感受周围环境的变化并通过不同的调节机制迅速做出响应，以此来保护细胞。在S.cerevisiae中，细胞主要通过利用Hog1介导的胞内甘油快速积累机制来提供渗透压保护。除此之外还存在多种调节机制，如离子的体内稳态(依赖于ATP驱动的Na⁺、K⁺主动转运和H⁺反向转运)，TOR(Target of rapamycin，雷帕霉素靶标信号途径)和CWI(Cell wall integrity，细胞壁完整性途径)等。S.cerevisiae还通过积累阳离子，糖(如海藻糖，蔗糖，糖原)，多元醇(如甘露醇，山梨醇等)及氨基酸(如脯氨酸，精氨酸和谷氨酸)等相容性物质来恢复细胞的膨胀压。这类物质既可能来源于内部合成，也可能吸收自外界环境，它们是酵母的渗透压响应调控机制的重要组成。在高渗透压条件下，C.glycerolgenesis的γ-氨基丁酸透性酶基因受到强烈的诱导，其胞内含量得到一定程度的积累，在培养基中外源添加γ-氨基丁酸可促进C.glycerolgenesis在渗透压条件下的生长，表明C.glycerolgenesis可利用γ-氨基丁酸作为渗透压保护剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于产甘油假丝酵母(C.glycerolgenesis)的γ-氨基丁酸合成关键酶谷氨酸脱羧酶基因CgGAD1，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供一种提高产甘油假丝酵母在高渗条件下菌体生长的方法。通过过量表达来源于自身的CgGAD1，增加γ-氨基丁酸在胞内的积累，促进菌株在高渗条件下的菌体生长。

本发明的技术方案：一种提高产甘油假丝酵母抵御外界高渗透压的方法，利用尿嘧啶营养缺陷型的甘油工业生产菌株产甘油假丝酵母C.glycerolgenesis U5为研究对象，克隆获得来源于产甘油假丝酵母的谷氨酸脱羧酶基因CgGAD1，将其以整合表达的方法过表达于C.glycerolgenesis U5中，重组菌的胞内γ-氨基丁酸含量得到明显的升高，其在高渗透压条件下的菌体生长也发生显著提高，表明通过过量表达谷氨酸脱羧酶基因可有效保护产甘油假丝酵母抵御外界渗透压胁迫。

本发明的有益效果：本发明从Candida glycerinogenes的染色体基因组中分离得到γ-氨基丁酸合成关键酶谷氨酸脱羧酶基因GAD1。该基因序列全长1830bp，无内含子，编码609个氨基酸。研究结果表明在产甘油假丝酵母中过量表达GAD1基因，可提高胞内γ-氨基丁酸的含量，进而促进菌株在高渗透压条件下的生长。该研究结果发现γ-氨基丁酸可作为渗透压保护剂在胞内积累以保护产甘油假丝酵母抵御外界渗透压。GAD1基因的获得扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母耐高渗的生理机理研究提供了思路。为今后更好地利用和改造产甘油假丝酵母，以实现其在浓醪发酵等领域中的应用提供研究基础。

附图说明:

图1.PCR扩增获得的C.glycerinogenes GAD1基因片段。

M:DL2000Marker；1:以引物GAD-F和GAD-R扩增获得的片段。

图2.C.glycerinogenes U5和C.glycerinogenes U5/pGAD1在含有1M NaCl的固体培养基上的生长状况。

图3.C.glycerinogenes U5和C.glycerinogenes U5/pGAD1在含有不同NaCl浓度的液体培养基中的菌体生长。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。

实施例1：C.glycerinogenes CgGAD1基因的克隆

实施例中，对菌株的培养分别使用YEPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母抽提物10，琼脂20(固体培养基)，pH5.5，和基本培养基(g/L)：葡萄糖20，无氨基酵母氮源6.7，琼脂20(固体培养基)，pH5.5。在30℃下YEPD培养基中培养C.glycerinogenes至对数生长期，收集菌体，以玻璃珠法抽提基因组DNA。利用引物GAD-F:5′-CGCGGATCCATGACACTTTCCAGCCATGT-3′；GAD-R:5′-CTTGGTACCTTAACA AATAACTTTTGCATTTGAG-3′，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果如图1所示。将扩增获得的目的片段连接至pMD-19T载体上，转化至大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的LB固体平板上进行筛选，挑取转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，并将其送至上海生工进行测序。测序结果显示该核苷酸序列全长1830bp，序列详见SEQ ID NO.1，将其命名为CgGAD1。

实施例2：CgGAD1过表达重组菌U5/pGAD1的构建

利用限制性酶BamH I和Kpn I分别对实施例中获得的基因扩增片段与整合表达载体pURGAP分别进行双酶切，获得的片段经T4-DNA连接酶在16℃下连接过夜，转化入E.coliJM109感受态中，在氨苄青霉素抗性平板上获得转化子，利用菌落PCR筛选阳性转化子并将其转接至LB培养基中，过夜培养后进行质粒抽提获得CgGAD1基因的整合表达质粒pGAD1。重组质粒以限制性内切酶Hind III进行线性化酶切，以LiAc法将其转入C.glycerinogenes尿嘧啶营养缺陷型突变株U5中。在基本培养基上培养3天后获得转化子，菌落PCR筛选获得CgGAD1基因过表达的重组菌U5/pGAD1。

实施例3：过表达CgGAD1提高C.glycerinogenes渗透压耐受性的应用

1、过表达CgGAD1的重组菌在含有1M NaCl的固体培养基上的生长状况。

将重组菌U5/pGAD1和对照菌株U5分别培养至对数生长期，分别取等量的菌体以无菌生理盐水制备菌悬液并连续稀释。用移液枪分别吸取3μl菌液，按照稀释后的浓度梯度平行滴至含有1M NaCl的固体培养基上；待液滴吸收后转移至30℃恒温培养箱中静止培养24h，观察菌落生长状况，结果见图2，表明过表达CgGAD1提高了菌株在渗透压条件下的生长。

2、过表达CgGAD1的重组菌在含有不同NaCl浓度的液体培养基中的菌体生长。

将重组菌U5/pGAD1和对照菌株U5分别转接至含有不同浓度NaCl的YEPD液体培养基中，30℃，200rpm的摇床中培养至稳定期，利用分光光度计测定600nm处的吸光值，结果见图3。过量表达CgGAD1可显著提高菌株在高渗条件下的生长能力。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种过表达产甘油假丝酵母CgGAD1提高渗透压耐受性的方法

<130> 20171128

<141> 2017-11-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenes)

<400> 1

atgacacttt ccagccatgt tgacacagat gctttagagg ataagatttt tgagaagtct 60

tctccaaaac acaagttact ccaaaagtac aatgacatac taagaagaca cgggaacgac 120

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Claims (2)

1.一种来源于产甘油假丝酵母的谷氨酸脱羧酶基因CgGAD1，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.根据权利要求1所示的核苷酸序列的功能，其特征在于能显著提高产甘油假丝酵母的高渗透压耐受能力。