CN107709543B - 制造适于向体细胞分化诱导的干细胞克隆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种方法，该方法是制造干细胞克隆的方法，包括：(i)将与向体细胞的分化诱导相关的外源性基因导入到干细胞的工序；(ii)将导入有外源性基因的干细胞分化诱导为上述体细胞的工序；(iii)将分化诱导而成的体细胞进行脱分化的工序；以及(iv)从通过工序(iii)形成的干细胞集落，分离出上述外源性基因整合到染色体而成的干细胞的工序。
Description
技术领域
本发明涉及使利用了体细胞的重编程并由各种集团构成的干细胞或体细胞进行来源于单一细胞的细胞集团化，即克隆化的方法等。
背景技术
在细胞株研发中，克隆是重要的工序，以往，该克隆利用有限稀释法来进行。
虽然通过向细胞导入外源性基因来进行使细胞向期望的细胞类型变化(专利文献1、非专利文献1和非专利文献2)，但由于导入的外源性基因的拷贝数和/或染色体上的导入部位等不同，所以得到的细胞不一样。因此，虽然考虑通过有限稀释法来进行克隆，但未必所有细胞均能够适用有限稀释法。
另外，导入外源性基因而得到的细胞即使进行相同的方法，再次得到期望的细胞的概率也低，因此在需要对该细胞进行同源重组等基因操作的情况下，能够进行这样操作的细胞类型受到限制。
近年来，提出了由使保有期望的TCR型的T淋巴细胞重编程而得到的iPS细胞再次诱导为T淋巴细胞的补充疗法(专利文献2或非专利文献3)，但这并不是针对克隆或基因操作。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2014/148646
专利文献2:WO2011/096482
非专利文献
非专利文献1：Nakamura S等，Cell Stem Cell.14：535-548,2014
非专利文献2：Tanaka A等PLoS One.8：e61540,2013
非专利文献3：Nishimura T等，Cell Stem Cell.12(1)：114-126,2013
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，使由各种集团构成的干细胞或体细胞进行来源于单一细胞的细胞集团化，即进行克隆化。
技术方案
本发明人等发现，从经过一次或多次脱分化而制备出的干细胞集落分离出与体细胞的分化诱导相关的基因整合到染色体而成的干细胞，结果分离出的干细胞适于向体细胞分化诱导，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的发明。
一种制造[A1]干细胞克隆的方法，包括：
(i)将与向体细胞的分化诱导相关的外源性基因导入到干细胞的工序，
(ii)将导入有上述外源性基因的干细胞分化诱导为上述体细胞的工序，
(iii)将分化诱导而成的体细胞进行脱分化的工序，以及
(iv)从通过工序(iii)形成的干细胞集落分离出上述外源性基因整合到染色体而成的干细胞的工序。
[A2]在[A1]记载的方法中，分离出的干细胞克隆的向体细胞的分化诱导效率比克隆化前的干细胞的向体细胞的分化诱导效率高。
[A3]在[A1]或[A2]记载的方法中，上述体细胞为造血前体细胞、巨核前体细胞、成红血细胞、神经细胞、神经干细胞、神经嵴细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞，肝细胞或黑素细胞。
[A4]在[A3]记载的方法中，上述体细胞为巨核前体细胞，与上述分化诱导相关的外源性基因是从由包括MYC家族基因的癌基因、包括Bmi1的对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因(多梳基因)、以及包括BCL-XL基因的细胞凋亡抑制基因组成的组中选择的至少一种外源性基因。[A5]在[A1]～[A4]中任一项记载的方法中，分离出表达MEG3的干细胞。
[A6]在[A1]～[A5]中任一项记载的方法中，与上述分化诱导相关的外源性基因与药物反应性启动子功能性连结。
[A7]在[A1]～[A6]中任一项记载的方法中，工序(iii)的脱分化通过从由OCT3/4、SOX2和KLF4组成的组中选择的重编程因子的导入来实施。
[A8]一种方法，该方法是制造体细胞的方法，该方法包括：
将按照[A1]～[A7]中记载的方法制造出的干细胞克隆向体细胞分化诱导的工序。
[A9]一种方法，该方法是制造血小板的方法，该方法包括：
将按照[A1]～[A6]中记载的方法制造出的干细胞克隆向巨核前体细胞分化诱导的工序；以及
使分化诱导而成的巨核前体细胞成熟为巨核细胞，释放出血小板的工序。
[A10]在[A9]记载的方法中，使制造出的血小板缺失HLA。
[B1]一种方法，该方法包括以下的工序且是使体细胞克隆化的方法，该体细胞是通过表达外源性基因而制造的体细胞；
(i)向体细胞导入重编程因子，形成干细胞集落的工序，该体细胞是与药物反应性启动子功能性连结的外源性基因整合到染色体而成的；
(ii)将由上述工序(i)得到的干细胞集落进行分离的工序；以及
(iii)将由上述工序(ii)分离出的干细胞集落中所含的干细胞向体细胞诱导的工序，其包括使从该干细胞向该体细胞的任一分化步骤的细胞与对应的药物接触的工序；
[B2]在[B1]记载的方法中，上述体细胞为巨核前体细胞，上述外源性基因是从由MYC家族基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因组成的组中选择的至少一种基因；
[B3]在[B2]记载的方法中，上述工序(iii)包括以下工序：
(a)将通过上述工序(ii)分离出干细胞集落所包含的干细胞向造血前体细胞诱导的工序；以及
(b)使通过上述工序(a)得到的造血前体细胞与对应的药物接触的工序；
[B4]在[B1]至[B3]中任一项记载的方法中，上述重编程因子为包括OCT3/4、SOX2和KLF4的因子；
[B5]在[B1]至[B4]中任一项记载的方法中，上述药物反应性启动子为具有TRE序列的启动子，至少在上述工序(iii)的细胞中，进一步使反义tetR融合蛋白表达；
[B6]在[B2]至[B5]中任一项记载的方法中，在上述工序(iii)中，还包括在通过上述工序(ii)分离出的干细胞集落所含有的干细胞中，选择出表达MEG3的干细胞的工序；
[B7]在[B1]至[B6]中任一项记载的方法中，在上述工序(iii)中，还包括在通过上述工序(ii)分离出的干细胞集落所含有的干细胞中，使HLA缺失的工序；
[B8]在[B7]记载的方法中，上述HLA为I类抗原；
[B9]在[B8]记载的方法中，上述I类抗原为β2-微球蛋白；
[B10]一种血小板的制造方法，包括以下工序：
通过[B2]至[B9]任一项中记载的方法使巨核前体细胞克隆化的工序；以及
使克隆化而成的巨核前体细胞成熟为巨核细胞，释放出血小板的工序；
[B11]一种制造缺失了HLA的体细胞的方法，其包括以下工序；
(i)向体细胞导入重编程因子，形成多能干细胞的工序，
(ii)使在通过上述工序(i)得到的多能干细胞中缺失HLA的工序，以及
(iii)将由上述工序(ii)得到的缺失了HLA的多能干细胞向体细胞诱导的工序；
[B12]在[B11]记载的方法中，上述重编程因子为包括OCT3/4、SOX2和KLF4的因子；
[B13]在[B11]或[B12]记载的方法中，在上述工序(i)中使用的体细胞为巨核前体细胞，该巨核前体细胞是通过将从由与药物反应性启动子功能性连结的MYC家族基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因组成的组中选择的至少一种基因向染色体整合而制造出的巨核前体细胞；
[B14]在[B13]记载的方法中，上述工序(iii)包括以下工序：
(A)将通过上述工序(ii)得到的缺失了HLA的多能干细胞向造血前体细胞诱导的工序，以及
(B)使通过上述工序(A)得到的造血前体细胞与对应的药物接触的工序；
[B15]在[B11]至[B14]中任一项记载的方法中，上述HLA为I类抗原；
[B16]在[B15]记载的方法中，上述I类抗原为β2-微球蛋白；
[B17]一种缺失了HLA的血小板的制造方法，包括以下工序：
通过[B13]至[B16]的任一项记载的方法来制造缺失了HLA的巨核前体细胞的工序，以及
使缺失了HLA的巨核前体细胞成熟为巨核细胞，释放出血小板的工序；
[B18]一种iPS细胞，其包括外源性癌基因以及对外源性的p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因的iPS细胞，对外源性的p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因相对于该外源性的癌基因的含有率为2倍至7倍；
[B19]在[B18]中记载的iPS细胞中，上述癌基因为c-Myc，并且对上述p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因为Bmi1；
[B20]一种巨核前体细胞，其包括外源性的癌基因和对外源性的p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因，对外源性的p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因相对于该外源性的癌基因的含有率为2倍至7倍；
[B21]在[B20]中记载的巨核前体细胞，上述癌基因为c-Myc，并且对上述p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因为Bmi1。
[B22]一种方法，其选择出适于巨核前体细胞的诱导的多能干细胞或造血前体细胞，包括选择出表达MEG3的多能干细胞或造血前体细胞的工序。
发明效果
根据本发明，能够制造适于向体细胞分化诱导的干细胞克隆。另外，与通过以往的有限稀释法克隆化而成的干细胞相比，通过本发明克隆化而成的干细胞的细胞增殖能力等优异。例如，与以往相比，按照本发明制备出的二次巨核前体细胞克隆不仅细胞增殖能力和/或向巨核细胞的成熟能力优异，而且由该克隆制备出的巨核细胞的血小板产生能力也高。
附图说明
图1是示出从由通过有限稀释法得到的22个巨核前体细胞克隆候选以及原始的各种集团构成的巨核前体细胞(H+)诱导得到的血小板产生数量(图1的A)以及代替通过该血小板的PMA刺激而形成的GPIIb/IIIa复合体数的荧光强度(图1的B)的图。
图2是示出再次测定的结果的图，从由图1的22个巨核前体细胞克隆候选之中5个巨核前体细胞克隆以及原始的各种集团构成的巨核前体细胞(H)诱导得到的血小板产生数量(图2的A)以及代替通过该血小板的PMA刺激而形成的GPIIb/IIIa复合体数的荧光强度(图2的B)。
图3是示出再次测定的结果的图，从图2的5个巨核前体细胞克隆和原始巨核前体细胞(H)诱导的血小板产生数量(图3A)以及代替通过该血小板的PMA刺激而形成的GPIIb/IIIa复合体数的荧光强度(图3B)。
图4的A是示出从巨核前体细胞的制造、利用重编程的克隆化以及从二次iPS细胞制造二次巨核前体细胞的示意图。图4的B是示出通过使巨核前体细胞重编程而得到的二次iPS细胞克隆的染色体中所含的c-MYC或BMI1的每个细胞的拷贝数的图。
图5示出用流式细胞仪对从各二次iPS细胞克隆诱导的巨核前体细胞中的CD42b和CD41a的表达细胞分布以及CD235和CD41a的表达细胞分布进行测定所得的结果。
图6的A示出用于使β2-微球蛋白的Exon1缺失的同源重组的示意图。图6的B示出用于对靶载体导入后的二次iPS细胞克隆中的同源重组进行确认的PCR的结果。
图7的A示出用流式细胞仪对来源于缺失了β2-微球蛋白的Exon1的二次iPS细胞克隆的巨核前体细胞(imMKCL)(左图)以及从该巨核前体细胞产生的血小板(右图)中的β2-微球蛋白和HLA的表达细胞分布进行测定所得的结果。图7的B示出从来源于缺失了β2-微球蛋白的Exon1的二次iPS细胞克隆(HLA(-))或二次iPS细胞克隆(HLA(+))的巨核前体细胞产生的血小板中的PMA刺激后的PAC1的荧光强度比。对荧光强度而言，将来源于二次iPS细胞克隆(HLA(+))的血小板的值设为1。
图8示出利用Illumina公司(图8的A)或Affymetrix公司(图8的B)的微阵列，针对可以向巨核前体细胞诱导的二次iPS细胞克隆(优iPS)和不能向巨核前体细胞诱导的二次iPS细胞克隆(差iPS)，或者来源于可以向巨核前体细胞诱导的二次iPS细胞克隆的造血前体细胞(优HPC)和来源于不能向巨核前体细胞诱导的二次iPS细胞克隆的造血前体细胞(差HPC)比较基因的表达量所得的结果。
图9的A示出来源于二次iPS细胞克隆的巨核细胞(克隆2)和克隆化前的巨核前体细胞株(亲代，Parental)的增殖曲线，图9的B示出根据该增殖曲线计算出的倍增时间(**P<0.01)。
图10的A示出来源于二次iPS细胞克隆的巨核细胞(克隆2)和克隆化前的巨核前体细胞株(亲代)的成熟前后的细胞外观，图10的B示出各细胞的尺寸变化。
图11是将成为血小板源的前血小板(Proplatelet)形成数进行比较所得的图。
具体实施方式
本发明的制造干细胞克隆的方法包括以下的工序：
(i)将与向体细胞分化诱导相关的外源性基因导入到干细胞的工序，
(ii)将导入有上述外源性基因的干细胞向上述体细胞分化诱导的工序，
(iii)将分化诱导而成的体细胞进行脱分化的工序，以及
(iv)从通过工序(iii)形成的干细胞集落分离出上述外源性基因整合于染色体而成的干细胞的工序。
分离出的干细胞克隆与克隆化前的干细胞相比更适于向体细胞分化诱导，每一细胞的向体细胞分化诱导的效率更高。
在一实施方式中，本发明的干细胞克隆的制造方法可以包括以下的工序：
(i)向体细胞导入重编程因子，形成干细胞集落的工序，该体细胞是与药物反应性启动子功能性连结的外源性基因整合到染色体而得到的；以及
(ii)分离出由上述工序(i)得到的干细胞集落的工序。
得到的干细胞克隆可以进一步向体细胞分化诱导。分化诱导适当选择适于向本领域技术人员期望的体细胞分化诱导的方法来实施，并无特别限定，但可以还包括以下的工序：
(iii)将通过工序(ii)分离出的干细胞集落所含的干细胞向体细胞诱导的工序，并且包括使从该干细胞向该体细胞的任一分化步骤的细胞与对应的药物接触的工序。
在本发明中，克隆化表示细胞集团的克隆化，表示从具有不均一的遗传信息的细胞集团分离出具有均一的遗传信息的细胞集团。
供克隆化的体细胞
在本发明中，供克隆化的体细胞(称为原代体细胞)只要是通过将与药物反应性启动子功能性连结的基因向染色体整合而制造出的细胞，就无特别限定，例如，可列举神经细胞(WO2014/148646，Wapinski OL等，Cell.155：621-635,2013)、神经干细胞(Han DW等，Cell Stem Cell.10：465-472,2012)、神经嵴细胞(Kim YJ等，Cell Stem Cell.15：497-506,2014)、心肌细胞(Ieda M等，Cell.142：375-386,2010)、骨骼肌细胞(Tanaka A等，PLoSOne.8：e61540,2013)、软骨细胞(Outani H等，PLoS One.8：e77365,2013)、肝细胞(Huang P等，Cell Stem Cell.14：370-384,2014)、黑素细胞(Yang R等，Nat Commun.5：5807,2014)、造血前体细胞(Batta K，Cell Rep.9：1871-84,2014)、成红血细胞(Hirose S等，Stem CellReports.1：499-508,2013)和巨核前体细胞(Nakamura S等，Cell Stem Cell.14：535-548,2014)。
在本发明中，由于巨核前体细胞无法通过有限稀释法来进行克隆化，因此适于作为通过本发明的方法进行克隆化的体细胞。成红血细胞也优选作为本发明中的体细胞。然而，即使是除此以外的体细胞，也可以得到期望的与向体细胞分化诱导相关的外源性基因被导入到染色体而成的干细胞克隆，因此体细胞不限于巨核前体细胞和成红血细胞。
本发明中的与向体细胞分化诱导相关的外源性基因广泛，是指在从干细胞分化诱导成体细胞时被导入到细胞的基因。如果以体细胞是巨核前体细胞的情况为例进行说明，则与分化诱导相关的基因可以是从由癌基因、对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因(多梳基因)、以及细胞凋亡抑制基因组成的组中选择的至少一种基因，其中，癌基因优选为MYC家族基因，更加优选为c-Myc；对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因(多梳基因)优选为Bmi1；细胞凋亡抑制基因优选为BCL-XL基因。如果以体细胞是成红血细胞的情况为例，则与分化诱导相关的基因可以是从由癌基因、细胞凋亡抑制基因组成的组中选择的至少一种基因，其中，癌基因优选为MYC家族基因，更加优选为c-Myc；细胞凋亡抑制基因优选为BCL-XL基因。与向体细胞分化诱导相关的外源性基因也可以以能够与药物反应性启动子发生作用地连结。
在本发明中，药物反应性启动子是指在对应的药物存在下或非存在下表达基因的启动子。作为在对应的药物存在下表达基因的启动子，示例出TRE启动子(具有tetO序列连续7次而成的Tet应答序列的CMV最小启动子)。在使用了TRE启动子的情况下，优选使用如下的方式，即，在同一细胞中，通过使反义tetR(rtetR)和VP16AD的融合蛋白(反义tetR融合蛋白)同时表达，从而在对应的药物(例如，可示例四环素或多西环素)存在下诱导基因表达。在使用反义tetR融合蛋白的情况下，该融合蛋白至少在后述的“从干细胞向二次体细胞诱导的工序”中表达即可。例如，在制作原代体细胞时，通过使编码反义tetR融合蛋白的基因与药物反应性启动子功能性连结而将该基因导入，由此能够在“从干细胞向二次体细胞诱导的工序”中，通过添加或除去对应的药物而使反义tetR融合蛋白表达。在将药物反应性启动子与两种以上的基因功能性连结的情况下，药物反应性启动子可以使用全部相同的种类，也可以使用两个种类以上。
原代巨核前体细胞的诱导方法
本发明中的“巨核前体细胞”是指通过进行成熟而成为巨核细胞的细胞，并且是未多核化的细胞，例如，包括表征为CD41a阳性/CD42a阳性/CD42b弱阳性的细胞。本发明的巨核前体细胞优选为可以通过扩大培养而增殖的细胞，例如，是在适当的条件下可以扩大培养至少60天以上的细胞。在本发明中，巨核前体细胞可以经克隆化也可以未经克隆化，没有特别限定，但克隆化而成的细胞有时也称为巨核前体细胞株。本发明中的巨核前体细胞也可以从造血前体细胞诱导。
本发明中的“巨核细胞”也称为血小板前体细胞、巨核细胞，是通过分离其细胞质而产生血小板的细胞，也可以是多核化而成的细胞，例如，包括表征为CD41a阳性/CD42a阳性/CD42b阳性的细胞。除此之外，巨核细胞也可以表征为GATA1、FOG1、NF-E2和β1-微管蛋白表达的细胞。多核化的巨核细胞是指与巨核前体细胞相比，核的数量相对增加的细胞或细胞群。例如，在适用本发明的方法的巨核前体细胞的核为2N的情况下，4N以上的细胞成为多核化的巨核细胞。另外，在本发明中，巨核细胞可以被永生化为巨核细胞株，也可以是克隆化而成的细胞群。
在本发明中，造血前体细胞(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))是指淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞、巨核细胞等可以分化成血细胞系细胞的细胞，在本发明中，造血前体细胞和造血干细胞并无区别，如无特别说明就表示同一细胞。造血干细胞/前体细胞可以通过例如作为表面抗原的CD34和/或CD43为阳性来识别。在本发明中，造血干细胞也可以应用于从多能干细胞、来源于脐带血、骨髓血、外周血的造血干细胞以及前体细胞等分化诱导出的造血前体细胞。例如，在使用多能干细胞的情况下，造血前体细胞可以按照Takayama N.等.J Exp Med.2817-2830(2010)中记载的方法，由通过在VEGF的存在下在C3H10T1/2上对多能干细胞进行培养所得到的网状结构物(也称为ES-sac或iPS-sac)来制备。在此，“网状结构物”是指来源于多能干细胞的立体的囊状(在内部带有空间的形状)结构体，并且由内皮细胞集团等形成，在内部含有造血前体细胞的结构体。除此以外，作为来自多能干细胞的造血前体细胞的诱导方法，可示例利用形成拟胚体和添加细胞因子的方法(Chadwick等，Blood 2003,102：906-15，Vijayaragavan等，Cell StemCell 2009，4：248-62，Saeki等，Stem Cells 2009，27：59-67)或与来源于异种的基质细胞的共培养法(Niwa A等，J Cell Physiol.2009 Nov；221(2)：367-77.)等。
作为该多能干细胞，可列举受精卵、胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)这样的细胞。本发明的作为体细胞的巨核前体细胞优选为通过使癌基因、对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因(多梳基因)、和/或细胞凋亡抑制基因强制表达来培养该细胞的工序，从而向造血前体细胞诱导而成的细胞。
在本发明中，“癌基因”是指由于其表达、结构或功能等与正常细胞不同而引起正常细胞癌化的基因，例如，可列举MYC家族基因、Src家族基因、Ras家族基因、Raf家族基因、c-Kit以及PDGFR、Abl等蛋白激酶家族基因等。作为MYC家族基因，可示例c-MYC、N-MYC和L-MYC。c-MYC基因是指包括例如由NCBI的登录号(accession number)NM_002467表示的核酸序列的基因。另外，在c-MYC基因中也可以包括其同源物，c-MYC基因同源物是指其cDNA序列包括例如与由NCBI的登录号NM_002467表示的核酸序列实质上相同的序列的基因。包括与由NCBI的登录号NM_002467表示的核酸序列实质上相同的序列的cDNA是指包括如下序列的DNA，所述序列的DNA与包括由NCBI的登录号NM_002467表示的序列的DNA具有约60％以上的同一性，优选具有约70％以上的同一性，更加优选具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的同一性，最优选具有约99％的同一性，或者是在严格的条件下能够与包括与由NCBI的登录号NM_002467表示的核酸序列互补的序列的DNA杂交的DNA，通过这些DNA编码的蛋白有利于造血前体细胞等分化步骤的细胞的扩增。
在此，严格的条件是指由本领域技术人员容易确定的杂交的条件，通常是依赖于探针长度、清洗温度和盐浓度的经验性试验条件。通常，如果探针变长，则适宜的用于退火的温度变高，如果探针变短，则温度变低。杂交形成通常依赖于互补的链在比其融点稍低的环境下的再退火能力。
例如，作为低严格的条件，可列举在杂交后的过滤器的清洗步骤中，在37℃～42℃的温度条件下，在0.1×SSC、0.1％的SDS溶液中进行清洗等。另外，作为高严格的条件，可列举例如，在清洗步骤中，在65℃下，在5×SSC和0.1％的SDS中进行清洗等。通过进一步提高严格的条件，能够获得同源性高的多核苷酸。
在本发明中，由于优选抑制c-MYC的表达量，因此也可以是对与不稳定结构域融合而成的蛋白进行编码的c-MYC。不稳定结构域可以从ProteoTuner公司或Clontech公司购买并使用。
在本发明中，作为“对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因”，可示例BMI1、Id1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HDAC、Dnmt1/3a/3b等。BMI1基因是指包括例如由NCBI的登录号NM_005180表示的核酸序列的基因。另外，BMI1基因中也可以包括其同源物，BMI1基因的同源物是指其cDNA序列包括例如与由NCBI的登录号NM_005180表示的核酸序列实质上相同的序列的基因。包括与由NCBI的登录号NM_005180表示的核酸序列实质上相同的序列的cDNA是指包括如下序列的DNA，该序列的DNA与包括由NCBI的登录号NM_005180表示的序列的DNA具有约60％以上的同一性，优选具有约70％以上的同一性，更加优选具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的同一性、最优选具有约99％的同一性，或者是在严格的条件下能够与包括与由NCBI的登录号NM_005180表示的核酸序列互补的序列的DNA杂交的DNA，通过该DNA编码的蛋白对在MYC家族基因等癌基因表达的细胞内产生的癌基因诱导性细胞衰老进行抑制，促进该细胞的扩增。
在本发明中，“细胞凋亡抑制基因”只要是抑制细胞凋亡的基因就没有特别限定，例如，可列举BCL2基因、BCL-XL基因、存活素(survivin)、MCL1等。BCL-XL基因是指包括例如由NCBI的登录号NM_001191或NM_138578表示的核酸序列的基因。另外，在BCL-XL基因也可以包括其同源物，BCL-XL基因的同源物是指其cDNA序列包括例如与由NCBI的登录号NM_001191或NM_138578表示的核酸序列实质上相同的序列的基因。包括与由NCBI的登录号NM_001191或NM_138578表示的核酸序列实质上相同的序列的cDNA是指包括如下序列的DNA，该序列的DNA与包括由NCBI的登录号NM_001191或NM_138578表示的序列的DNA具有约60％以上的同一性，优选具有约70％以上的同一性，更加优选具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的同一性、最优选具有约99％的同一性，或者是在严格的条件下能够与包括与由NCBI的登录号NM_001191或NM_138578表示的核酸序列互补的序列的DNA杂交的DNA，通过该DNA编码的蛋白具有抑制细胞凋亡的效果。
在本发明中，使上述的基因在造血前体细胞中强制表达的方法优选通过将与药物反应性启动子功能性连结的基因整合到染色体来进行，例如，通过将包括与药物反应性启动子功能性连结的基因的表达载体向造血前体细胞导入来实现。作为表达这些基因的载体，可使用例如逆转录病毒、慢病毒等病毒载体、动物细胞表达质粒(例如，pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)。从向染色体整合这一观点考虑，逆转录病毒载体或慢病毒载体是优选的载体。
表达载体除了含有启动子以外，还可以根据期望而含有增强子、多聚A附加信号、选择标记基因、SV40复制起点等。作为有用的选择标记基因，可列举例如二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
在本发明中，为了同时导入多个基因，可以使基因纵向连结而得到多顺反子载体。为了可以进行多顺反子表达，可以在强制表达的多个基因之间，对***病毒的2A自裂解肽(参照Science，322,949-953,2008等)和IRES(内部核糖体进入位点，Internal ribosomeentry site)序列等进行结扎(Ligation)。
在本发明中，将表达载体导入到造血前体细胞的方法通过如下方式完成，即，在病毒载体的情况下，将包括该核酸的质粒导入到适当的包装细胞(例如Plat-E细胞)和/或补充细胞株(例如293细胞)，回收在培养上清液中产生的病毒，使其与造血前体细胞接触并感染。在非病毒载体的情况下，可以使用脂质体转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等，将质粒载体导入到细胞。
作为本发明的巨核前体细胞的诱导方法的一个方式，可以在对造血前体细胞使癌基因、或者对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因强制表达之后，进一步使细胞凋亡抑制基因强制表达。细胞凋亡抑制基因的强制表达也与上述同样地可以通过将表达载体、或这些基因编码的蛋白或编码这些基因的RNA向造血前体细胞导入来完成。虽然没有特别限定，但随后强制表达细胞凋亡抑制基因的情况优选强制表达至少14天以上癌基因以及对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因之后，可进行细胞凋亡抑制基因的强制表达。
在本发明中，也可以使半胱天冬酶抑制剂(caspase inhibitor)与细胞接触，来替代使细胞凋亡抑制基因在造血前体细胞中强制表达。在本发明中，半胱天冬酶抑制剂可以是肽性化合物、非肽性化合物、或者来源于生物的蛋白中的任一种。作为肽性化合物，例如可列举人工化学合成的下述(1)～(10)的肽性化合物。
(1)Z-Asp-CH2-DCB(分子量454.26)
(2)Boc-Asp(OMe)-FMK(分子量263.3)
(3)Boc-Asp(OBzl)-CMK(分子量355.8)
(4)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-YVAD-CHO(分子量1990.5)(序列编号1)
(5)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-DEVD-CHO(分子量2000.4)(序列编号2)
(6)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEVD-CHO(分子量1998.5)(序列编号3)
(7)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-IETD-CHO(分子量2000.5)(序列编号4)
(8)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEHD-CHO(分子量2036.5)(序列编号5)
(9)Z-DEVD-FMK(Z-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone)(序列编号6)
(10)Z-VAD FMK
例如，作为肽性化合物的半胱天冬酶抑制剂，可列举(1)VX-740福泰制药(VertexPharmaceuticals)(Leung-Toung等，Curr.Med.Chem.9,979-1002(2002))、(2)HMR-3480安万特制药(Aventis Pharma)AG(Randle等，Expert Opin.Investig.Drugs 10,1207-1209(2001))。
作为非肽性化合物的半胱天冬酶抑制剂，可示例(1)苯胺喹唑啉(anilinoquinazolines(AQZs))阿斯利康制药(AstraZeneca Pharmaceuticals)(Scott等，J.Pharmacol.Exp.Ther.304,433-440(2003))、(2)M826默克福罗斯特制药(Merck Frosst)(Han等，J.Biol.Chem.277,30128-30136(2002))、(3)M867默克福罗斯特制药(Methot等，J.Exp.Med.199,199-207(2004))、(4)烟基天门冬氨酰酮(Nicotinyl aspartyl ketones)默克福罗斯特制药(Isabel等，Bioorg.Med.Chem.Lett.13,2137-2140(2003))等。
另外，作为其他非肽性化合物的半胱天冬酶抑制剂，可列举(1)IDN-6556-IdunPharmaceuticals公司(Hoglen等，J.Pharmacol.Exp.Ther.309,634-640(2004))、(2)MF-286和MF-867默克福罗斯特制药(Los等，Drug Discov.Today 8,67-77(2003))、(3)IDN-5370-Idun Pharmaceuticals公司(Deckwerth等，Drug Dev.Res.52,579-586(2001))、(4)IDN-1965-Idun Pharmaceuticals公司(Hoglen等，J.Pharmacol.Exp.Ther.297,811-818(2001))、(5)VX-799福泰制药(Los等，Drug Discov.Today 8,67-77(2003))等。除此之外，还可列举M-920和M-791默克福罗斯特制药(Hotchkiss等，Nat.Immunol.1,496-501(2000))等作为半胱天冬酶抑制剂。
在本发明中，优选的半胱天冬酶抑制剂为Z-VAD FMK。在使用Z-VAD FMK作为半胱天冬酶抑制剂的情况下，其添加针对培养造血前体细胞的培养基进行。培养基中的Z-VADFMK的优选浓度可列举例如为10μM以上、20μM以上、30μM以上、40μM以上和50μM以上，优选为30μM以上。
在本发明中，为了从造血前体细胞诱导巨核前体细胞所使用的培养基没有特别限定，可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，例如包含IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle's最低基础培养基(Eagle's MinimumEssential Medium，EMEM)、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodified Eagle's Medium，DMEM)、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal 培养基(Life Technologies公司)和它们的混合培养基等。培养基中可以含有血清，或者也可以没有血清。根据需要，培养基还可以含有例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油(thiol glycerol)、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等中的一种以上的物质。细胞因子是指促进血细胞系分化的蛋白，例如可示例VEGF、TPO、SCF等。在本发明中优选的培养基为包括血清、胰岛素、转铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、抗坏血酸、TPO的IMDM培养基。更加优选还包括SCF。另外，在使用了包括药物反应性的启动子的表达载体的情况下，在强制表达的工序中，优选在培养基中含有对应的药物，例如，四环素或多西环素。
在本发明中，用于从造血前体细胞诱导巨核前体细胞的温度条件没有特别限定，但确认了通过在37℃以上的温度下培养造血前体细胞，从而促进向巨核前体细胞的分化。在此，37℃以上的温度是不对细胞造成损害的程度的适当温度，因此优选例如约37℃～约42℃的程度、约37～约39℃的程度。另外，关于37℃以上的温度下的培养时间，只要是本领域技术人员，就可以一边监视巨核前体细胞的数量等一边适当确定。只要可获得期望的巨核前体细胞，就不特别限定天数，例如，至少为6天以上、12天以上、18天以上、24天以上、30天以上、42天以上、48天以上、54天以上、60天以上，优选为60天以上。在巨核前体细胞的诱导中，培养时间长也没有问题。另外，优选培养期间内进行适当传代。
体细胞的重编程方法
在本发明中，作为重编程体细胞的方法，可以通过向体细胞导入重编程因子来进行。在此，重编程因子可示例为例如，Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，这些重编程因子可以单独使用，也可以组合使用。作为重编程因子的组合，可示例在WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D等.(2008)，Nat.Biotechnol.，26：795-797、Shi Y等.(2008)，CellStem Cell，2：525-528、Eminli S等.(2008)，StemCells.26：2467-2474、Huangfu D等.(2008)，Nat.Biotechnol.26：1269-1275、Shi Y等.(2008)，Cell Stem Cell，3,568-574、Zhao Y等.(2008)，Cell Stem Cell，3：475-479、Marson A，(2008)，Cell Stem Cell，3，132-135、Feng B等.(2009)，Nat.Cell Biol.11：197-203、R.L.Judson等.，(2009)，Nat.Biotechnol.，27：459-461、Lyssiotis CA等.(2009)，Proc Natl Acad Sci U S A.106：8912-8917、Kim JB等.(2009)，Nature.461：649-643、Ichida JK等.(2009)，Cell Stem Cell.5：491-503、Heng JC等.(2010)，Cell StemCell.6：167-74、Han J等.(2010)，Nature.463：1096-100、Mali P等.(2010)，StemCells.28：713-720、Maekawa M等.(2011)，Nature.474：225-9中记载的组合。更加优选的重编程因子为包括Oct3/4、Sox2和Klf4的组合。
上述重编程因子中，还包括组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如，丙戊酸(VPA)、曲古抑菌素A、丁酸钠、MC 1293、M344等低分子抑制剂、针对HDAC的siRNA和shRNA(例如HDAC1siRNA Smartpool(注册商标)(Millipore公司)、HuSH 29mer shRNA Constructsagainst HDAC1(OriGene公司)等)等核酸性表达抑制剂等)、MEK抑制剂(例如PD184352、PD98059、U0126、SL327和PD0325901)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(例如Bio和CHIR99021)、DNA甲基转移酶抑制剂(例如5-氮杂胞苷)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如BIX-01294等低分子抑制剂、针对Suv39hl、Suv39h2、SetDBl和G9a的siRNA和shRNA等核酸性表达抑制剂等)、L-型钙通道激动剂(L-channel calcium agonist，例如Bayk8644)、酪酸、TGFβ抑制剂或ALK5抑制剂(例如LY364947、SB431542、616453和A-83-01)、p53抑制剂(例如针对p53的siRNA和shRNA)、ARID3A抑制剂(例如针对ARID3A的siRNA和shRNA)、miR-291-3p、miR-294、miR-295和miR-302等miRNA、Wnt信号(Wnt Signaling，例如soluble Wnt3a)、神经肽Y、***素类(例如***素E2和***素J2)、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等出于提高建立效率的目的而被使用的因子，在本说明书中，将这些出于改善建立效率的目的而使用的因子不与重编程因子进行特别区分。
在蛋白形态的情况下，重编程因子也可以通过例如脂质体转染、与细胞膜穿透肽(例如来源于HIV的TAT和多聚精氨酸)的融合、显微注射等方法导入到体细胞内。
另一方面，在DNA形态的情况下，可以通过例如病毒、质粒、人工染色体等载体、脂质体转染、脂质体、显微注射等方式导入到体细胞内。作为病毒载体，可示例逆转录病毒载体、慢病毒载体(以上，Cell，126，pp.663-676,2006；Cell，131，pp.861-872,2007；Science，318，pp.1917-1920,2007)、腺病毒载体(Science，322,945-949,2008)、腺相关病毒载体、仙台病毒载体(WO 2010/008054)等。另外，作为人工染色体载体，包括例如人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC、PAC)等。作为质粒，可使用哺乳动物细胞用质粒(Science，322：949-953,2008)。在载体中，可包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子、多腺苷酸化位点等控制序列，以使得核重编程物质能够表达，进一步地，可以根据需要，包括耐药基因(例如卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等)、胸苷激酶基因、白喉毒素基因等选择标记序列、绿色荧光蛋白(GFP)、β葡萄糖苷酸酶(GUS)、FLAG等报告基因序列等。另外，在上述载体中，为了在向体细胞导入之后将编码重编程因子的基因或启动子以及编码与此结合的重编程因子的基因共同切除，可以在它们的前后具有LoxP序列。
在RNA形态的情况下，重编程因子也可以通过例如脂质体转染、显微注射等方法导入到体细胞内，为了抑制分解，可以使用纳入了5-甲基胞苷和假尿苷(pseudouridine)(TriLink Biotechnologies)而成的RNA(Warren L，(2010)Cell Stem Cell.7：618-630)。
作为用于重编程后的细胞的培养液，包括例如含有10～15％的FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培养液(这些培养液中可以进一步适当含有LIF、盘尼西林/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、β-巯基乙醇等)或市售的培养液(例如小鼠ES细胞培养用培养液(TX-WES培养液，thromboX公司)、灵长类ES细胞培养用培养液(灵长类ES/iPS细胞用培养液，reprocell公司)、无血清培养基(mTeSR，Stemcell Technology公司))等。
作为重编程后的细胞的培养法的示例，例如，可以在37℃、5％的CO2存在下，在含有10％的FBS的DMEM或DMEM/F12培养液上使体细胞与重编程因子接触并培养约4～7天，然后，将细胞在饲养细胞(例如，丝裂霉素C处理STO细胞、SNL细胞等)上重新接种，从重编程因子与体细胞的接触起算约10天后开始用含有bFGF的灵长类ES细胞培养用培养液进行培养，从该接触起算约30～约45天或更长时间之后，能够产生iPS状集落。
或者，可以在37℃、5％的CO2存在下，在饲养细胞(例如，丝裂霉素C处理STO细胞、SNL细胞等)上用含有10％的FBS的DMEM培养液(其中可以进一步适当含有LIF、盘尼西林/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、β-巯基乙醇等)进行培养，在约25～约30天或更长时间之后可以产生ES状集落。优选地，可示例利用重编程的体细胞本身(TakahashiK等，(2009)，PLoS One.4：e8067或WO2010/137746)或者利用细胞外基质(例如层粘连蛋白-5(WO2009/123349)和基质胶(BD公司))来取代饲养细胞的方法。
除此之外，还示例利用不含有血清的培养基来进行培养的方法(Sun N等，ProcNatl Acad SciU S A.106：15720-15725,2009或Nakagawa M等，Sci Rep.4：3594,2014)。进一步地，为了提高建立效率，也可以通过低氧条件(0.1％以上且15％以下的氧浓度)来建立iPS细胞(Yoshida Y等，(2009)，Cell Stem Cell.5：237-241或WO2010/013845)。
在上述培养期间，从开始培养第2天以后每天更换一次新鲜的培养液。另外，重编程中使用的体细胞的细胞数并无限定，可示例每10cm2培养皿(dish)上约5×103～约5×106细胞的范围。
对通过体细胞的重编程所获得的干细胞集落进行分离的工序
在本发明中，能够通过如上所述向体细胞导入重编程因子并进行培养，来获得干细胞集落。在本发明中，干细胞表示这样的细胞，即，具有进行***而制造与自身相同细胞的自我复制能力和分化为其他种类的细胞的能力，且能够无限增殖的细胞。本发明的干细胞只要形成集落就没有特别限定，是干细胞之中具有向除胎盘以外的组织细胞分化的能力的多能干细胞。
在本发明中，集落表示来源于单一细胞的细胞群。
在本发明的克隆化方法中，包括对获得的干细胞集落进行分离的工序。分离可以通过适当采取单一集落并将其转移到其他培养皿来进行。
用于巨核前体细胞诱导的iPS细胞
在本发明中，在体细胞为巨核前体细胞的情况下，如上所述，可以在巨核前体细胞的染色体内包含与药物反应性启动子功能性连结的外源性的癌基因以及外源性的对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因。在此情况下，通过利用上述方法对该巨核前体细胞进行重编程而获得的二次iPS细胞在其染色体内同样地包含与药物反应性启动子功能性连结的外源性的癌基因和外源性的对p16基因的表达或对p19基因的表达进行抑制的基因。此时，与药物反应性启动子功能性连结的外源性的对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因相对于用于巨核前体细胞诱导的iPS细胞中的外源性的癌基因中的与药物反应性启动子功能性连结的外源性的癌基因的含有率优选为2倍至7倍，更加优选为3倍至5倍。同样地，与药物反应性启动子功能性连结的外源性的对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因相对于巨核前体细胞中的外源性的癌基因中的与药物反应性启动子功能性连结的外源性的癌基因的含有率优选为2倍至7倍，更加优选为3倍至5倍。应予说明，癌基因以及对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因可适当选择为上述的基因。
从干细胞向二次体细胞诱导的工序
在本发明的克隆化方法中，包括将通过上述的方法得到的干细胞向二次体细胞诱导的工序。在本发明中，二次体细胞表示从原代体细胞向干细胞重编程后，诱导而得到的体细胞，优选原代体细胞与二次体细胞为相同的体细胞。本诱导工序可以通过使整合的基因再次表达来进行。基因的再表达可以通过如下方式进行：使从通过原代体细胞的重编程获得的干细胞至二次体细胞为止的任一分化步骤的细胞与对应的药物接触(在对应的药物存在下表达基因的启动子的情况)，或者，使从通过原代体细胞的重编程获得的干细胞至二次体细胞为止的任一分化步骤的细胞与对应的药物中止接触(除去对应的药物时表达基因的启动子的情况)。例如，在使用rtetR和VP16AD的融合基因(反义tetR)的情况下，可以通过投放对应的药物使基因再次表达。对“从通过原代体细胞的重编程获得的干细胞至二次体细胞为止的任一分化步骤的细胞”而言，该干细胞可以为分化成二次体细胞以前经历的所有细胞。因此，在本发明中，在再表达基因之前，可以将该干细胞向其他细胞诱导，作为该诱导后的细胞，可列举纤维芽细胞、造血前体细胞等。向“其他细胞”的诱导可以按照公知的方法进行。使用巨核前体细胞作为体细胞的情况下，可示例向上述造血前体细胞的诱导方法。即，通过向为了从干细胞诱导造血前体细胞，从上述的造血前体细胞诱导巨核前体细胞所使用的培养基投放对应的药物，能够强制表达癌基因、对p16基因的表达或p19基因的表达进行抑制的基因、和/或细胞凋亡抑制基因。
选择干细胞或造血前体细胞的工序
在本发明中，在使用巨核前体细胞作为体细胞情况下，由于未必是所有干细胞均能够向巨核前体细胞诱导，因此优选适当选择可以向巨核前体细胞诱导的干细胞，作为该方法，示例在干细胞中选择对MEG3进行表达的干细胞的方法。在本发明中，也可以选择来源于表达MEG3的干细胞的造血前体细胞。在本发明中，在人类的情况下，MEG3是例如包括由NCBI的登录号NR_002766、NR_003530、NR_003531、NR_033358、NR_033359、NR_033360、NR_046464、NR_046465、NR_046466、NR_046467、NR_046468、NR_046469、NR_046470、NR_046471、NR_046472或NR_046473表示的核酸序列的非编码RNA。适用于本发明的方法的干细胞没有特别限定，可以是原代多能干细胞，更加优选为通过上述的方法得到的干细胞克隆。表达高可以表示在同时测定的多个干细胞或造血前体细胞中，表达比平均值高，或者也可以表示比无法向巨核前体细胞诱导的已知的干细胞或造血前体细胞中的表达高。
在本发明中，作为确认MEG3的表达的方法，可以使用本领域技术人员公知的方法，例如，可示例逆转录酶PCR分析、定量逆转录酶PCR分析、诺瑟印迹杂交(Northern blot)分析、免疫组织化学、阵列分析以及他们的组合。
使体细胞的HLA缺失的方法和制造缺失HLA的体细胞的方法
在一实施方式中，本发明提供包括以下工序的使体细胞的HLA缺失的方法或制造缺失HLA的体细胞的方法；
(i)向体细胞导入重编程因子，形成多能干细胞的工序；
(ii)使通过上述工序(i)得到的多能干细胞中缺失HLA的工序；以及
(iii)将通过上述工序(ii)得到的缺失了HLA的多能干细胞向体细胞诱导的工序。
用于本发明的使HLA缺失的方法的体细胞、所使用的重编程因子、形成多能干细胞的方法、以及将多能干细胞向体细胞诱导的方法与用于上述的克隆化提供的体细胞相同。因此，在本发明中，还提供使体细胞克隆化并进一步使HLA缺失的方法。
在本发明中，HLA为人类白细胞型抗原且表示包括α链和L链的I类抗原、包括DRB1基因编码的β链和DRA基因编码的α链的II类抗原以及III类抗原。因体细胞不同而导致表达的HLA不同，所以可以适当选择应缺失的HLA来进行，在使用巨核前体细胞作为体细胞的情况下，优选选择I类抗原作为HLA并使其缺失。HLA的缺失可以是使α链、L链、β链中的任一个缺失，在使I类抗原缺失的情况下，优选使L链即β2-微球蛋白缺失。
本发明的在多能干细胞中使染色体的HLA缺失的方法可以适当选择同源重组法等本身公知的方法来进行。
血小板的制造方法
本发明的血小板的制造方法包括：通过本发明的克隆化方法使巨核前体细胞克隆化的工序、使克隆化而成的巨核前体细胞成熟为巨核细胞，释放出血小板的工序。使巨核前体细胞成熟，释放出血小板的工序可以按照公知的方法或以其为标准的方法来进行。例如，在巨核前体细胞包括从由MYC家族基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因组成的组中选择的至少一种基因的情况下，巨核细胞的成熟可以通过在上述工序(iii)之后，从培养基中除去对应的药物，由此抑制MYC家族基因、多梳基因和/或细胞凋亡抑制基因的表达来进行。成熟的巨核细胞进行多核化并释放出血小板。
血小板可以与ACD-A液、FFP、柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖等组合而制成血小板制剂，也可以与红细胞细胞组合而制成血液制剂。
在通过上述的方法获得缺失了HLA的巨核细胞的克隆的情况下，通过使其成熟而释放出血小板，能够获得缺失了HLA的血小板。缺失了HLA的血小板无论受体的HLA型如何，均可以应用于输血，因此是有用的。
改善巨核前体细胞的增殖能力的方法
如上所述，本发明提供一种通过将巨核前体细胞重编程来制作干细胞，进一步向巨核前体细胞转换，由此改善该巨核前体细胞的增殖能力的方法。因此，在一实施方式中，本发明的改善巨核前体细胞的增殖能力的方法包括以下的工序：
(i)向具有药物反应性表达的外源性的基因的巨核前体细胞导入重编程因子，形成干细胞集落的工序；
(ii)分离通过上述工序(i)得到的干细胞集落的工序；以及
(iii)将通过上述工序(ii)分离出的干细胞集落中所含的干细胞向巨核前体细胞诱导的工序，该工序中，向该体细胞的诱导包括与对应的药物接触的工序。
在本发明中，改善增殖能力是指染色体中的端粒序列变长。在本发明中，端粒序列表示TTAGGG的重复序列，端粒序列变长表示该重复数量变多。
实施例
以下，基于实施例和试验例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。
巨核前体细胞的制造
利用以3×105cells/dish的条件接种了MEF的6cm培养皿(dish)上维持的半汇合状态的iPS细胞(SeV2：按照WO2010/134526的方法，利用仙台病毒载体向新生儿成纤维细胞的导入c-MYC、OCT3/4、SOX2和KLF4来制作)，介由iPS-sac来进行造血前体细胞(HPC)的诱导。详细来说，使用人类胰蛋白酶溶液使iPS细胞游离，将1/50～1/30程度的细胞作为集落块，接种于经丝裂霉素C(MMC)处理的C3H10T1/2(可以从理研公司获得)上。应予说明，经MMC处理的C3H10T1/2通过在接种iPS细胞的前一天，以8×105cells/dish接种到10cm培养皿的方式来准备。接种后，在添加有20ng/ml的VEGF的Eagel’s基础培养基(EBM，Eagel’s BasalMedium)中，在5％的O2、5％的CO2、37℃气氛下开始培养(第0天)。在第3天和第6天，用相同的培养基进行培养基更换。
在第7天，在20％的O2、5％的CO2、37℃的气氛下继续培养。在第9天、第11天和第13天，用相同的培养基进行培养基更换。在第14天，使用细胞刮刀(cell scraper)或移液器(pipette)前端物理性地剥离细胞，通过40微米的细胞筛(cell strainer)回收大小均匀的细胞。根据细胞的大小，确认了该回收的细胞为造血前体细胞(HPC)。
在第14天，以3×104～1×105cells/孔的条件将回收的HPC接种于经MMC处理的C3H10T1/2上。培养基使用添加有50ng/ml的SCF、50ng/ml的TPO、0.5μg/ml的多西环素的EBM。接着，用慢病毒载体向HPC导入c-MYC和BMI 1。所使用的慢病毒载体是四环素控制性的诱导载体，通过将LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G的mOKS盒改为c-MYC或BMI1而制作(分别为LV-TRE-c-MYC-xL-Ubc-tTA-I2G或LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G)(Nakamura S等，Cell StemCell.14：535-548,2014)。感染中使用的病毒粒子通过使该慢病毒载体向293T细胞感染来制作(MOI 300)。仅在感染时添加鱼精蛋白。以后，每隔1天进行培养基更换，每周更换一次或两次C3H10T1/2和培养基。
从导入c-MYC和BMI1经过两周后，使用慢病毒载体，用MOI 10导入BCL-xl。BCL-xl的导入中使用的慢病毒载体为四环素控制性的诱导载体，与上述同样地通过将mOKS盒改为BCL-xl而制作(LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G)(Nakamura S等，Cell Stem Cell.14：535-548,2014)。仅在感染时添加鱼精蛋白。以后，在10cm 培养皿的10T1/2饲养细胞(feeder)上添加了50ng/ml的SCF、50ng/ml的TPO、0.5μg/ml的多西环素的EBM中来维持培养，制作出巨核前体细胞株(也称为imMKCL)。
参考例1
有限稀释法
将巨核前体细胞(imMKCL)以1.5cells/300uL/孔的密度接种于96孔板上，在含有15％的胎牛血清(FBS)、50ng/mL的人类SCF(R&D systems)、50ng/mL的TPO、5mg/mL的强力霉素(Clontech)、2mg/mL的嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)的IMDM(Iscove's modifiedDulbecco's medium)中，在37℃、5％的CO2气氛下培养10天至14天。为了进行扩大培养，将各孔分别转移至24孔板和6孔板，同样地继续培养。将各孔中的细胞称为巨核前体细胞克隆。
巨核前体细胞克隆的解析(第一次)
使用PBS对通过上述的方法得到的各巨核前体细胞克隆进行两次清洗，以4×105/3mL接种到6孔板，在含有50ng/mL的人类SCF、50ng/mL的人类TPO、750nM的SR1(Calbiochem)、15％的FBS的IMDM中进行培养。7天后，回收培养上清液，对血小板产生数量和血小板功能进行评价。血小板产生数量的评价如下进行。即，将针对CD41(BioLegend)、CD42a(eBioscience)和CD42b(BioLegend)的荧光色素结合抗体和碘化丙啶(Sigma-Aldrich)添加到培养上清液，培养30分钟后利用FACSVerseO(BD Biosciences)进行分析。分析根据大小排除巨核前体细胞后，将CD41、CD42a和CD42b为阳性作为指标来计数，计算出每个巨核前体细胞的血小板数。血小板功能性评价如下进行。即，将针对CD41、CD42b、activated glycoprotein(GP)IIb/IIIa(PAC-1；BD Biosciences)的荧光色素结合抗体和0.4mM的12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇(PMA，phorbol 12-myristate 13-acetate)(Sigma-Aldrich)添加到培养上清液，培养30分钟后利用FACSVerseO进行分析。分析时以荧光强度(MFI)计量activated GP IIb/IIIa的表达水平，将其用于评价。
通过上述的方法，对于22个巨核前体细胞克隆评价了血小板产量和血小板功能，结果在克隆1、克隆4和克隆13中，确认了血小板产量是对照物(克隆化前的巨核前体细胞)的血小板产量的1.6倍～1.9倍左右(图1的A)。作为血小板功能，示出了克隆13的活性最高，与对照物相比，对PMA刺激更好地反应(图1的B)。
巨核前体细胞克隆的解析(第二次)
对在第一次的解析结果中血小板产量多且血小板功能高的五个克隆(1、2、4、11和13)再次同样地进行解析。确认了仅克隆4的血小板产量高达对照物的1.3倍左右(图2的A)。另外，作为血小板功能，确认了克隆13高达对照物的3.7倍左右，但克隆1、2、4和11与第一次的解析结果不同，与对照物相比无变化(图2的B)。
巨核前体细胞克隆的解析(第三次)
对于第二次的解析结果再次同样地进行了解析。血小板产量相对于对照物无变化(图3A)。另外，作为血小板功能，确认了克隆4和13相对于对照物分别高达1.7倍和1.6倍左右，差异变小(图3B)。
根据以上的结果可确认的是，通过有限稀释得到的巨核前体细胞克隆未显示出血小板产生能力和在产生的血小板中稳定的功能。因此，暗示了在巨核前体细胞的克隆化中，使用有限稀释法是不妥当的。
实施例1
利用巨核前体细胞的重编程进行的克隆化
对通过上述的方法得到的巨核前体细胞进行重编程来制作iPS细胞(二次iPS细胞)，利用二次iPS细胞进行克隆化，再次诱导为巨核前体细胞并进行克隆化(二次巨核前体细胞)(图4的A)。具体如下。
使用细胞核转染仪(Amaxa Nucleofector)，按照电穿孔法将四种游离基因载体质粒(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL和pCXWB-EBNA1；Okita K等，StemCells.31：458-66,2013和Okita K等，Nat Methods.8：409-12,2011)导入到1×106cells的原代巨核前体细胞株后，以3×105cells接种于作为饲养细胞的1-2×105cells/6cm培养皿的MEF上。14天后，收集得到的集落，进行扩大培养，将10个二次iPS细胞克隆用于解析。
二次iPS细胞克隆的解析
从通过上述的方法得到的10个二次iPS细胞克隆提取基因组DNA，针对c-MYC和BMI1使用可以在外显子(exon)内进行PCR反应的引物(primer)，进行定量PCR。其结果是，对内源性的2个拷贝以外的外源性的c-MYC和BMI1的***数进行了研究，10种二次iPS细胞克隆的外源性的BMI1的***数约为7个拷贝至26个拷贝，与外源性的c-MYC的***数约为1个拷贝至6个拷贝完全不同(图4的B)。
从通过上述方法得到的10个二次iPS细胞克隆(使用了一部分与上述不同的克隆)中提取基因组DNA，进行全基因组序列解析，对外源性的c-MYC和BMI1的***数进行了研究，确认了按以下的表1所示的比率***染色体。确认了在二次iPS细胞克隆中，相对于c-MYC的***数，含有约3倍至5倍的BMI1的***数。
[表1]
| BMI/MYC | |
| 2nd-iPS_1 | 3.90 |
| 2nd-iPS_4 | 2.89 |
| 2nd-iPS_11 | 4.97 |
| 2nd-iPS_13 | 3.47 |
| 2nd-iPS_14 | 3.97 |
| 2nd-iPS_15 | 2.95 |
| 2nd-iPS_16 | 4.75 |
| 2nd-iPS_19 | 2.94 |
| 2nd-iPS_20 | 4.27 |
| 2nd-iPS_22 | 4.89 |
根据以上的结果暗示了，在巨核前体细胞的制造工序中导入的外源性的基因的整合数量根据每个巨核前体细胞而不同，但在以固定的比率进行整合的情况下，可制造巨核前体细胞。
来自二次iPS细胞克隆的二次巨核前体细胞克隆的诱导
按照上述的方法从3个二次iPS细胞克隆(#4，#11和#12)介由iPS-sac在14天后分别得到HPC克隆。将得到的HPC克隆以1×105cells/孔接种于6-孔，在添加有50ng/ml的SCF、50ng/ml的TPO、0.5μg/m l的多西环素的EBM中培养27天，获得二次巨核前体细胞克隆。对获得的3个巨核前体细胞克隆进行了解析，结果获得了CD41a和CD41b阳性、CD235阴性的均匀的细胞群(图5的A和B)。
HLA缺失(HLA-null)二次iPS细胞克隆的制作
向通过上述的方法得到的二次iPS细胞克隆(#11)导入如图6的A所示的靶载体(Target vector)，通过同源重组使β2-微球蛋白(β2m)的Exon1缺失。关于是否适当地进行了同源重组，可以通过使用在野生型和重组型中设计在如图6的A所示的位置处的引物来确认PCR产物进行(图6的B)。其结果是，在2个克隆(克隆3和4)中建立了β2m的缺失型二次iPS细胞克隆。
接着，通过上述的方法，诱导β2m的缺失型二次巨核前体细胞克隆。另外，通过上述的方法，从培养上清液获得了血小板。在β2m的缺失型二次巨核前体细胞克隆和血小板中，使用针对β2m(BD Pharmingen)和HLA(BD Pharmingen)的抗体，进行流式细胞术，结果确认了在任一情况下均缺失了β2m和HLA(图7A)。
β2m的缺失型二次巨核前体细胞克隆的血小板功能性确认
与上述同样地用PMA对野生型二次iPS细胞克隆(#11)和β2m的缺失型二次巨核前体细胞克隆的培养上清液中的血小板进行刺激之后，使其与CD42a抗体、CD42b抗体和PAC1接触，用荧光强度(MFI)检测CD42a、CD42b和PAC1的阳性水平，进行了评价，结果在野生型和β2m的缺失型中，未发现其差异(图7B)。通过以上示出了，缺失了β2m的血小板与野生型的血小板相比，功能没有改变。
实施例2
适于巨核前体细胞的诱导的iPS细胞的标记的探索
针对通过上述的方法得到的能够建立imMKCL的两种二次iPS细胞(以下，称为优iPSC)，以及，在上述的方法中无法建立imMKCL的两种iPS细胞(以下，称为差iPSC)，提取mRNA，按照制造者指南，使用Illumina人类HT-12v4.0或Affymetrix GeneChip人类基因2.0ST阵列进行微阵列，使各两种优iPSC和差iPSC的表达量平均化，进行解析(图8的A和B)。
进一步地，通过与上述同样的方法，从Good-iPSC和差iPSC诱导造血前体细胞(HPC)(以下，分别称为优HPC和差HPC)，同样地进行诱导，使用Illumina人类HT-12v4.0或Affymetrix GeneChip人类基因2.0ST阵列进行微阵列(图8的A和B)。
以上的微阵列的解析结果确认了MEG3与优iPSC和优HPC一起进行了高表达。因此，在二次iPS细胞克隆或由其诱导的HPC中，通过确认MEG3的表达，由此暗示了能够选择适于巨核前体细胞的诱导的二次iPS细胞克隆。
实施例3
来源于二次iPS细胞克隆的巨核前体细胞的细胞增殖能力
为了研究根据本发明的克隆化的效果，将来源于二次iPS细胞克隆的巨核前体细胞的细胞增殖能力与克隆化前的巨核前体细胞株进行比较。在本实验中，使用来源于表1的2nd-iPS_11物质作为二次iPS细胞克隆。具体来说，将从2nd-iPS_11按照上述的方法介由iPS-sac在14天后得到的HPC克隆以1×105cells/孔接种于6-孔，在添加有50ng/ml的SCF、50ng/ml的TPO、0.5μg/ml的多西环素的EBM中培养27天，由此获得二次巨核前体细胞克隆(克隆2)。作为比较例，使用按照“巨核前体细胞的制造”一项制备出的克隆化前的巨核前体细胞(亲代)。将这些细胞以1x105cells/孔的条件接种于6-孔，在添加有50ng/ml的SCF、50ng/ml的TPO、0.5μg/ml的多西环素的EBM中培养15天。
在15天培养期间定期对细胞进行计数，结果显而易见的是，来源于二次iPS细胞克隆的巨核前体细胞比克隆化前的巨核前体细胞更快地增殖。将结果示于图9的A和B。
二次iPS细胞克隆由来巨核前体细胞的成熟能
将培养15天所得的二次巨核前体细胞克隆(克隆2)进一步在巨核细胞成熟条件(在EBM中添加50ng/ml的SCF、50ng/ml的TPO，进一步添加了750nM的SR-1(StemRegenin1)(Selleckchem公司制)和10microM的Y27632(wako公司制)的培养条件)下进行培养。巨核前体细胞(亲代)也在与二次巨核前体细胞克隆同样的培养条件下成熟为巨核细胞。对两个细胞进行时间推移成像，将拍摄到的图像示于图10的A，并且利用ImageJ对得到的图像进行解析，将所得到的结果示于图10的B。根据这些结果可知，按照本发明克隆化而成的巨核细胞比从克隆原细胞诱导得到的巨核细胞示出了更优异的成熟能力(细胞肥大化)。
来源于二次iPS细胞克隆的巨核细胞的血小板产生能力
接着，为了比较得到的巨核细胞的血小板产生能力，通过目视对图10的A的图像中形成有血小板的细胞的数量进行测算。其结果明确可知，按照本发明来源于克隆化而成的细胞的巨核细胞显示出优异的血小板产生能力(前血小板形成数量)(**p<0.01)。
序列表（SEQUENCE LISTING）
<110> 国立大学法人京都大学（KYOTO UNIVERSITY）
株式会社美加细胞（Megakaryon Corporation）
<120> 制造适于向体细胞分化诱导的干细胞克隆的方法
<130> 4793
<141> 2017-12-14
<150> JP2015-082768
<151> 2015-04-14
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成的半胱天冬酶抑制肽（A synthesized caspase inhibitorpeptide.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化（ACETYLATION）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 乙醛修饰的天冬氨酸（Acetaldehyde-modified aspartic acid.）
<400> 1
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Val Ala Asp
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成的半胱天冬酶抑制肽（A synthesized caspase inhibitorpeptide.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化（ACETYLATION）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 乙醛修饰的天冬氨酸（Acetaldehyde-modified aspartic acid.）
<400> 2
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Asp Glu Val Asp
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成的半胱天冬酶抑制肽（A synthesized caspase inhibitorpeptide.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化（ACETYLATION）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 乙醛修饰的天冬氨酸（Acetaldehyde-modified aspartic acid.）
<400> 3
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Leu Glu Val Asp
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成的半胱天冬酶抑制肽（A synthesized caspase inhibitorpeptide.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化（ACETYLATION）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 乙醛修饰的天冬氨酸（Acetaldehyde-modified aspartic acid.）
<400> 4
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Ile Glu Thr Asp
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成的半胱天冬酶抑制肽（A synthesized caspase inhibitorpeptide.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化（ACETYLATION）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 乙醛修饰的天冬氨酸（Acetaldehyde-modified aspartic acid.）
<400> 5
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
Leu Glu His Asp
20
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成的半胱天冬酶抑制肽（A synthesized caspase inhibitorpeptide.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 苄氧羰基修饰的天冬氨酸（Benzyloxycarbonyl-modified asparticacid.）
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 氟甲基酮修饰的天冬氨酸（Fluoromethylketone-modified asparticacid.）
<400> 6
Asp Glu Val Asp
1
Claims (7)
1.一种方法，所述方法是从由干细胞分化诱导而得的巨核前体细胞制造二次干细胞克隆的方法，其特征在于，包括：
(i)将巨核前体细胞进行脱分化，从而形成干细胞集落的工序，所述巨核前体细胞是从表达与向体细胞的分化诱导相关的外源性基因的干细胞诱导而得的造血前体细胞分化诱导而得；
(ii)从通过工序(i)形成的干细胞集落，分离出所述外源性基因整合到染色体而成的二次干细胞克隆的工序，
所述外源性基因是MYC家族基因和BMI1基因，或者所述外源性基因是MYC家族基因和BMI1基因以及BCL-XL基因，
工序(i)的脱分化通过从由OCT3/4、SOX2和KLF4组成的组中选择的重编程因子的导入来实施，通过脱分化得到的细胞为iPS细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将分离出的二次干细胞克隆的向体细胞的分化诱导效率与克隆化前的干细胞的向体细胞的分化诱导效率相比较的工序。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分离出表达MEG3的二次干细胞克隆。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源性基因与药物反应性启动子功能性连结。
5.一种方法，所述方法是制造巨核前体细胞的方法，其特征在于，包括将按照权利要求1～4中任一项所述的方法制造出的二次干细胞克隆向巨核前体细胞分化诱导的工序。
6.一种方法，所述方法是制造血小板的方法，其特征在于，包括：
将按照权利要求1～4中任一项所述的方法制造出的二次干细胞克隆向巨核前体细胞分化诱导的工序；以及
使分化诱导而成的巨核前体细胞成熟为巨核细胞，释放出血小板的工序。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括使所述二次干细胞克隆中缺失HLA的工序。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120009158A1 (en) * | 2010-06-18 | 2012-01-12 | The General Hospital Corporation | VENTRICULAR INDUCED PLURIPOTENT STEM (ViPS) CELLS FOR GENERATION OF AUTOLOGOUS VENTRICULAR CARDIOMYOCYTES AND USES THEREOF |
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Family Cites Families (10)
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|---|---|---|---|---|
| EA014166B1 (ru) * | 2005-12-13 | 2010-10-29 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
| WO2010033920A2 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Compositions and methods for enhancing cell reprogramming |
| DK3450545T3 (da) * | 2008-10-24 | 2023-10-02 | Wisconsin Alumni Res Found | Pluripotente stamceller opnået ved ikke-viral omprogrammering |
| WO2011034073A1 (ja) * | 2009-09-15 | 2011-03-24 | 国立大学法人東京大学 | 分化細胞の新規製造法 |
| CN102666853B (zh) * | 2009-10-28 | 2014-12-03 | 财团法人日本健康科学振兴财团 | 由干细胞向肝细胞的分化诱导方法 |
| JPWO2011096482A1 (ja) * | 2010-02-03 | 2013-06-13 | 国立大学法人 東京大学 | 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 |
| US9738906B2 (en) * | 2011-05-13 | 2017-08-22 | The University Of Tokyo | Method for producing polyploidized megakaryocyte and platelets |
| JP2013240308A (ja) * | 2012-05-23 | 2013-12-05 | Kagoshima Univ | ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞における遺伝子発現方法 |
| US20160002599A1 (en) * | 2013-02-08 | 2016-01-07 | Kyoto University | Production methods for megakaryocytes and platelets |
| SG11201507829SA (en) | 2013-03-21 | 2015-12-30 | Univ Kyoto | Pluripotent stem cell for neuronal differentiation induction |
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20120009158A1 (en) * | 2010-06-18 | 2012-01-12 | The General Hospital Corporation | VENTRICULAR INDUCED PLURIPOTENT STEM (ViPS) CELLS FOR GENERATION OF AUTOLOGOUS VENTRICULAR CARDIOMYOCYTES AND USES THEREOF |
| CN103703130A (zh) * | 2011-07-25 | 2014-04-02 | 国立大学法人京都大学 | 筛选诱导的多能干细胞的方法 |
Non-Patent Citations (1)
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| Expandable Megakaryocyte Cell Lines Enable Clinically Applicable Generation of Platelets from Human Induced Pluripotent Stem Cells;Sou nakamura et al.;《cell stem cell》;20140403;摘要，第535页右栏倒数第1段-537页左栏第1段 * |
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