CN107708675B

CN107708675B - 假塑性微凝胶基质的组合物和试剂盒

Info

Publication number: CN107708675B
Application number: CN201680035351.3A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫·查尔斯·萨拉蒙; 安·比尔·萨拉蒙; 凯特琳·伊丽莎白·雷莉; 劳拉·珍·萨格斯; 钟恩娜; 凯利·X-C·梁
Original assignee: Rochar Technology Co ltd
Current assignee: Rochar Technology Co ltd; Sanala Medical Technology Co ltd
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: AU2016250012B2; EP3283057A1; US20160303281A1; CA2982352A1; JP6930733B2; KR102592242B1; US20210308323A1; JP2018511622A; EP3283057B1; US11590259B2; BR112017022045B1; MX2017013002A; KR20170140274A; DK3283057T3; ES2895947T3; PT3283057T; HK1245663A1; CN107708675A; BR112017022045A2; EP3283057A4

Abstract

本发明大体上涉及蛋白和基于蛋白的生物大分子的水不溶性的但水可溶胀的、且可变形的、交联的、PEG化的微凝胶颗粒，其在水性介质中在剪切力下是假塑性(剪切稀化)的并且流动，并且其可以被注射或制备以流动，其中当剪切力去除时，所述微凝胶颗粒重新形成微凝胶颗粒簇。所述微凝胶颗粒充当基质以支持细胞生长、存活和增殖。

Description

假塑性微凝胶基质的组合物和试剂盒

技术领域

本发明大体上涉及蛋白和基于蛋白的生物大分子的交联的、水可溶胀的微凝胶颗粒，其在水性介质中在剪切力下是假塑性的并且流动，并且其可以被涂覆(coat)、注射、喷、涂(paint)或植入到组织、器官和伤口空隙空间以及周围组织替代物中，其中在不存在剪切力的情况下，所述微凝胶颗粒聚集成整体式微凝胶簇。所述微凝胶颗粒用作粘弹性基质以支持细胞生长、存活和增殖。

背景技术

已经对用作生物相容性大分子的水凝胶领域做了深入研究，开始了其作为整体式的、交联的、柔软的隐形眼镜材料的商业用途(美国专利号3,408,429)。由于其柔软、柔韧的性质，水凝胶是许多生物医学应用的优良材料，包括长期佩戴的硅酮水凝胶隐形眼镜、药物和其他药剂活性成分的递送、新生物材料的开发、生物材料的涂覆、用于细胞包封和递送的生物粘合剂和密封剂以及用于组织再生的细胞培养基底和支架。

天然和合成聚合物均可以用于生产用于组织工程应用的支架。天然聚合物通常具有固有的生物相容性并且可以具有生物活性。常用的可用作细胞支架的天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸、纤维蛋白、纤维蛋白原、蚕丝、藻酸盐、壳聚糖、右旋糖酐和琼脂糖等。

合成的基于聚合物的细胞支架使得能够控制物理和化学性质，例如稳定性、降解动力学、物理性质和机械强度。已经对许多合成的聚合物做了研究以用作组织工程支架的基质，包括聚(乙二醇)(PEG)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)、聚己内酯、聚(羟基链烷酸酯)和聚(乙烯醇)。特别地，由于PEG独特的化学和物理性质，例如溶于水和有机溶剂、无毒性、低蛋白粘附性和非免疫原性，其被广泛用作支架材料。此外，PEG包括促进聚合物修饰的羟基末端基团，从而产生具有不同化学、物理和生物学性质的新型结构(structures)和构造(architectures)，特别是具有生物部分以增强其生物活性。聚(乙二醇)经常与其他聚合物组合使用，以产生用于再生若干组织(包括软骨、骨、神经、脉管***和肌肉)的支架。

美国专利号6,818,018讨论了通过物理和化学交联流程的组合来原位形成水凝胶的组合物和方法。原位形成的水凝胶可以与生物活性分子结合使用，所述生物活性分子溶解或分散在水凝胶中。还提出了使用该水凝胶作为组织涂层(coating)以预防术后粘连；作为组织充填(tissue augmentation)或腔封闭(luminal occlusion)辅助剂；作为携带细胞、药物或其它生物活性物质的基质；作为组织密封剂或粘合剂；以及作为医疗设备涂层的方法。

在美国专利号7,776,240和8,323,794中，通过形成一种乳液描述了可注射的水凝胶微球，在所述乳液中，水凝胶前体处于分散的水相中并且所述水凝胶前体是聚合的，从而产生交联的微球。优选地，所述水凝胶前体是聚(乙二醇)二丙烯酸酯和N-异丙基丙烯酰胺，并且乳液的连续相是右旋糖酐和右旋糖酐溶解度降低剂的水溶液。可以将蛋白如细胞因子装载到微球中。

美国专利申请公开号2004/0220296公开了一种包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)的凝胶制剂，其也可以以液体形式注射。这一聚合物、共聚物或该聚合物与第二聚合物如聚(乙二醇)、聚乙烯基吡咯烷酮或聚(乙烯醇)的混合物的溶液在室温下为液体并且在体温下为固体。描述了这样的方法：在低于体温的温度下，通过注射呈液体的溶液将水凝胶植入到哺乳动物中，然后随着植入物温度升高至体温，其在体内进行热相变以在原位形成固体水凝胶。

在美国专利申请公开号2008/0268056中描述了一种生物相容性物质，其可用于修复椎体压缩性骨折。所述生物相容性物质可以通过物理交联由两种或更多种生物相容性聚合物水凝胶制成。如此制备的生物相容性物质具有热敏性并呈现出较低的临界溶解温度。它在25℃至34℃的温度范围内经历体积和状态变化。所述生物相容性物质在室温下可以是液体可注射形式，并且在较高温度的人体内可以凝胶化。在美国专利申请公开号2009/0053276中描述了基于合成聚合物的用于注射的其他热敏性水凝胶。

在美国专利申请公开号2005/0281880中报道了用于制备可注射的透明质酸水凝胶的流程。所述流程包括交联一种或多种聚合物并洗涤随后形成的凝胶，然后纯化并通过叶轮搅拌均质化以生产可注射的水凝胶。所述凝胶在磷酸盐缓冲盐水中的溶胀度可以为约4000-5000％。所述凝胶的粒度可以为约500微米。交联反应可以用双-或多官能团交联剂如环氧化物、醛、聚氮丙啶基(polyaziridyl)或二乙烯基砜进行。交联剂可以是1,4-丁二醇二缩水甘油醚。所述流程可以在37-60℃的温度下，在pH 11或更高的pH下进行。

在美国专利号4,172,066中，描述了一种基本上由水溶性烯键式不饱和单体组成的水可溶胀的或水膨胀性的交联聚合物的球形微凝胶，其分散在水或其它水性介质中并且是有效的增稠剂，当分散在水性介质中时其呈现出假塑性流变性。由于其均匀的小粒度，和水膨胀直径通常在约0.5至约200微米的范围内，以及其吸收相当比例的水的能力，所述微凝胶特别适用于需要增稠剂的应用，例如水性流体的快速吸附，例如尿布、带垫(beltpads)等卫生制品，以及用于其中聚合物的溶胀或部分封堵性质特别重要的应用，例如在封堵多孔构型(formations)或结构(structures)中。

美国专利号8,038,721公开了一种柔软的、无毒的组织填充物，其由球形固体颗粒组成，其网纹表面(textured surface)的尺寸范围在约32至90微米之间。所述颗粒作为载体均匀地悬浮在凝胶中，其中所述固体颗粒优选为非陶瓷固化聚合物如聚(甲基丙烯酸甲酯)。所述凝胶是纤维素多糖如羧甲基纤维素与醇如聚(乙烯醇)的组合，其溶解在水或一些其它溶剂中。所述填充物通过注射使用从而充填患者的软组织以及矫正软组织缺损(defect)。

美国专利号8,574,629中描述了一种可注射的凝胶，其包含一种交联的基于生物聚合物的基质，其中预先交联的生物聚合物颗粒已经与基质共交联，其中所述生物聚合物选自由透明质酸钠、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、纤维素及其衍生物、藻酸盐、黄原胶、卡拉胶、蛋白、核酸及其混合物构成的组，并且其中所述交联剂是丁二醇二缩水甘油醚。

美国专利申请公开号2012/0034271公开了一种可注射的原位二硫键交联的水凝胶，其凝胶化流程在注射器中完成，其中硫醇基在密封的可注射容器中被溶解在交联活性溶液中的氧气氧化成二硫键以形成交联的水凝胶，其中所述原位交联的水凝胶是多糖、蛋白或通过一种或多种化学修饰产生的合成大分子的衍生物。

美国专利号6,129,761中报道了一种能够交联形成水凝胶的慢聚合的、生物相容的、可生物降解的聚合物，其将分离的细胞递送到患者中以产生器官等同物或组织如软骨。所述聚合物选自由改性透明质酸、合成改性藻酸盐、通过自由基反应共价交联的聚合物和通过暴露于一价离子而凝胶化的聚合物构成的组。据报道，所述凝胶能促进移植并为新细胞生长提供三维模板。在一个实施方案中，使细胞悬浮在聚合物溶液中并直接注射到患者位点中，在其中所述聚合物交联形成其中分散有细胞的水凝胶基质。在另一个实施方案中，使细胞悬浮在聚合物溶液中，所述聚合物溶液被倒入或注入具有所需解剖形状的模具中，然后交联形成其中分散有细胞的水凝胶基质，可以将其植入到患者体内。

在美国专利申请公开号2013/0209370中描述了一种微孔可注射的、柔软有弹性的、可完全吸收的基于纤维蛋白的组合物，其用作软组织腔和空隙填充物。所述组合物结合了纤维蛋白原组分、凝血酶组分、增塑剂和平均直径在0.01μm至200μm之间的含钙颗粒。描述了通过将组分混合在一起和/或均质化所述组分来制备可注射的软组织空隙填充物组合物。

在美国专利号6,290,729中，描述了触变性和假塑性聚合物，其呈现出剪切稀化，由此聚合物在剪切力下变得更具流动性，并且在剪切力停止时恢复成高粘度或凝胶的形式。‘729专利描述了涂层的形成，可以通过向聚合物中引入交联剂、胶凝剂或交联催化剂连同流体材料(fluent material)或热敏性能来对其进行控制，然后改变条件使得在原位发生交联和/或胶凝。描述了一种用于控制组织修复或向内生长(in-growth)的方法，其包括在可能发生组织生长的位点应用聚合物材料，其中所述聚合物材料以第一流体状态被应用，然后在原位转化为第二非流体状态。

在美国专利申请公开号2012/0264190中描述了制备细胞外基质粉末的方法。在‘190公开中，所述组合物可以用于形成用于植入、注射的三维移植构建体，或者所述粉末状或颗粒状细胞外基质材料可以分散在用于局部使用的凝胶或软膏中以诱导宿主中受损(damaged)或病变(diseased)组织的修复。所述组合物是一种热敏性水凝胶，其在室温下是液体形式并且在高于室温的温度或在正常体温下是凝胶形式。

在美国专利8,802,436中，提出了从细胞外基质制备生物活性凝胶的改进方法，其保留了足够的生物活性以辅助组织修复，所述方法如下：将细胞外基质颗粒化(particularizing)至粒度范围为约1μm至约1,000μm，将颗粒化的粉末溶解在氢氧化钠中，用盐酸中和溶解的细胞外基质，以及任选地，冷冻或冻干所述冷冻的细胞外基质，以及任选地，使冻干的凝胶在水或盐水中复原。所有凝胶的最终粘稠度是泡沫样的。

美国专利号7,582,311中描述了适用于施用颗粒状悬浮液的注射载体。实例包括基于聚合物的制剂、相关药物制剂、制品和试剂盒。据报道，所述注射载体包括一种提高可注射性的假塑性组合物。所述注射载体包含一种溶于生理缓冲液如盐水中的柔性分子如透明质酸或其衍生物。

在美国专利申请公开号2004/0208938中，描述了可注射性改进的可注射组合物和用于制备该可注射组合物的方法。在‘938公开中，干燥微粒与水性注射载体形成悬浮液，然后将所述悬浮液与增粘剂混合以使所述悬浮液的流体相的粘度增加至改善可注射性的所需水平。

美国专利申请公开号2010/0330184描述了适用于施用颗粒状悬浮液如基于聚合物的制剂以及相关药物制剂、制品和试剂盒的注射载体。据报道，‘184公开的所述注射载体优于常规注射载体，因为其包括假塑性柔性聚合物组合物，如透明质酸、透明质酸衍生物及其组合的溶液，其改善可注射性，有利于递送所需剂量。

在美国专利申请公开号2013/0189230中讨论了一种用作细胞递送载体的可注射聚合物组合物。‘230公开的所述可注射聚合物组合物包括至少一种热胶凝聚合物(甲基纤维素)、至少一种阴离子胶凝聚合物(透明质酸)和水基载体，并且据报道其是剪切稀化的、触变的和可再吸收的。

在美国专利号8,357,402中，提出了一种可流动的伤口基质材料，其由胶原蛋白基质颗粒，优选胶原蛋白/糖胺聚糖(GAG)基质颗粒组成，据报道，当水合时其可以被有效地递送至伤口位点。据报道，所述可流动的伤口基质可以被有效地递送至具有不同深度和几何形状的伤口中，并提供了一种结构框架，所述结构框架充当细胞向内生长的支架。

在美国专利号7,442,397中，提出了与基于纤维蛋白的生物基质相关的方法和材料，其中可以使用基于纤维蛋白的生物基质将干细胞或祖细胞递送至病变心脏以辅助或恢复心脏功能。据报道，‘397专利提供了一种用于修复哺乳动物受损组织的方法，其通过在一定条件下，在需要修复的组织上或其中，引入含有干细胞或祖细胞的纤维蛋白原溶液，使得在引入位点处或附近形成包括细胞的纤维蛋白生物基质。在一个实施方案中，所述纤维蛋白原溶液是PEG化的。形成纤维蛋白生物基质的条件可以包括将具有纤维蛋白原转化剂(例如，丝氨酸蛋白酶如凝血酶)的溶液引入到纤维蛋白原溶液。

美国专利5,733,563号报道了亲水性水可溶胀的凝胶，其由双官能团聚(氧乙烯)的交联混合物构成，其被适宜的活化剂活化，溶于水溶液和白蛋白型蛋白中。所得水凝胶基于蛋白与双官能团聚(氧化烯)的交联，所述蛋白即各种来源的白蛋白，包括例如牛血清白蛋白，所述双官能团聚(氧化烯)优选聚(氧乙烯)，最优选聚(乙二醇)，或各种分子量的双官能团聚(氧化烯)的混合物。所述水凝胶的机械性质可以通过加入高分子量的非反应性聚(乙二醇)或其它惰性聚合物来改善。所述新型水凝胶可用于制备隐形眼镜、受控药物释放装置、用于治疗目标的酶或细胞的固定基质、伤口敷料和人造皮肤。

在美国专利申请公开号2011/0238000中描述了一种水凝胶体系，其包含用于控释递送治疗剂的聚合物共轭的白蛋白分子。所述聚合物是带官能团的合成聚合物，优选PEG-二丙烯酸酯。所述聚合物共轭的白蛋白优选为单-PEG化的白蛋白。所述水凝胶体系可以包含基质，所述聚合物共轭的白蛋白分子通过所述聚合物的第二官能团连接到所述基质上。所述基质可以由聚合物-白蛋白共轭物的相同聚合物形成。

据报道，美国专利申请公开号2010/0137510公开了一种聚合物-蛋白前体分子，其包含硫醇化蛋白和至少两种合成聚合物，所述至少两种合成聚合物共价连接到所述硫醇化蛋白的硫醇基团，所述至少两种合成聚合物中的每一种具有一个官能团，被选择的所述官能团能够与共价连接到至少一种其他聚合物-蛋白前体分子的至少一种其他合成聚合物的官能团交联，从而形成支架。所述官能团可以是丙烯酸酯或乙烯基砜，其通过光引发交联。可以组合PEG-胶原蛋白、PEG-白蛋白和PEG-纤维蛋白原的可溶性蛋白并光交联形成水凝胶支架。

美国专利申请公开号2003/0166867公开了平均直径为200-2000nm(0.2-2.0μm)的纤维蛋白纳米粒，并且其可以通过在不添加外源化学交联剂的情况下，在50-80℃的温度下，在油乳液中，混合含有纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的水溶液来获得。相关的美国专利号6,150,505报道了通过在内源性因子XIII的存在下，在加热的植物油(70-80℃)中，使纤维蛋白原和凝血酶反应来制备直径为50-200μm的纤维蛋白微珠。

据报道，美国专利号8,858,925公开了可生物降解的支架，其由天然存在的纤维蛋白原的蛋白骨架构成，所述纤维蛋白原通过合成聚合物聚(乙二醇)的修饰交联，生成PEG化的纤维蛋白原支架，用于治疗需要组织再生的病症。‘925专利使用了一种前体分子，其包含纤维蛋白原蛋白和至少两种聚(乙二醇)分子，所述纤维蛋白原蛋白被变性并保留了形成支架的活性，且所述聚(乙二醇)分子共价连接到所述变性纤维蛋白原蛋白的游离硫醇基团，其中所述至少两种PEG分子的每一个均包含用于交联的官能团以形成水凝胶支架。通过使前体分子进行自由基聚合反应，优选通过在体外或体内完成的丙烯酸酯化PEG的光引发来进行交联。

附图说明

图1显示了PEG化的纤维蛋白或PEG化的纤维蛋白原微凝胶粉末的制备流程图。

图2是显示了10:1摩尔比的PEG-纤维蛋白和20:1摩尔比的PEG-纤维蛋白原微凝胶的剪切稀化性能的图。冷冻研磨的微凝胶在磷酸缓冲盐水中以300mg/mL再水合。斜率值如下：PEG-纤维蛋白原(-0.90)和PEG-纤维蛋白(-0.98)。斜率接近-1代表完美的剪切稀化材料。

图3是在磷酸盐缓冲盐水中以300mg/mL再水合的20:1的PEG-纤维蛋白原微凝胶颗粒的模量-频率曲线图。反复暴露于1％应力后，粘弹性质可恢复。重复测试的储能和损耗模量稍高是微凝胶随时间进行而脱水的假象。

图4是模量-频率图中10:1的PEG-纤维蛋白和20:1的PEG-纤维蛋白原微凝胶的储能(G’)和损耗(G”)模量的比较图。所述微凝胶在磷酸盐缓冲盐水中以300mg/mL的浓度再水合。

图5是粘度-剪切速率曲线图，其显示了经杵臼研磨以及冷冻研磨的50:1的PEG-纤维蛋白原微凝胶颗粒的剪切稀化性能。所述微凝胶在磷酸缓冲盐水中以300mg/mL再水合。

图6是显示了在1、4和7天内，PEG-纤维蛋白原(PEG-FGN)和PEG-纤维蛋白微凝胶颗粒上的脂肪干细胞(ADSC)增殖的图。

图7显示了在第7天，10：1、20：1和50：1的PEG-纤维蛋白原和PEG-纤维蛋白微凝胶上的人ADSC的活细胞染色图像，其说明ADSC可在20：1的PEG-纤维蛋白原和50:1的PEG-纤维蛋白原微凝胶上存活。

图8显示了(大鼠)体外皮下注射染色的20:1PEG-FGN微凝胶的图像。所述微凝胶在注射后充当固体，其保持其形状并保留在注射部位。

图9是粘度-剪切速率的曲线图，其显示了不含PHMB和含有PHMB(以1000ppm PHMB的再水合浓度被掺入)的20:1PEG-FGN凝胶的剪切稀化性能。所述微凝胶在磷酸盐缓冲盐水中以300mg/mL再水合。

图10是模量-频率的曲线图，其显示了不含PHMB和含有PHMB(以1000ppm PHMB的再水合浓度(50mg/mL)被掺入)的20:1PEG-FGN凝胶的储能和损耗模量。所述微凝胶在磷酸盐缓冲盐水中以300mg/mL再水合。

图11显示了20:1的PEG-FGN微凝胶的平滑肌肌动蛋白(SMA)染色的图像，其表明在7和14天时，单独的和掺入了ADSC或颗粒状羊膜的微凝胶的中心有血管生成。

图12显示了CM-diI标记的大鼠ADSC的图像，其表明在7天和14天后，20：1的PEG-FGN微凝胶中移植的细胞的存活能力。DAPI和平滑肌肌动蛋白(SMA)染色显示了细胞核和微血管形成。

发明内容

描述了蛋白、基于蛋白的大分子或两者的水不溶性的但水可溶胀的、且可变形的、交联的、PEG化的微凝胶颗粒。所述蛋白和基于蛋白的大分子可以选自细胞外基质、糖蛋白、结构蛋白、纤维蛋白、酶、蛋白聚糖、天然多肽、合成多肽、球状蛋白、膜蛋白、血浆蛋白、肽、寡肽、抗微生物肽、肽激素、伴侣蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、凝血蛋白、免疫***蛋白、离子通道蛋白、细胞粘附蛋白、神经肽、核蛋白、硬蛋白、色素蛋白、缀合蛋白、蛋白-蛋白复合物、蛋白-多糖复合物、蛋白-脂质复合物、蛋白-酶复合物、蛋白-聚合物复合物、运动蛋白、黏蛋白、磷蛋白、收缩蛋白、转运蛋白、信号蛋白、调节蛋白、生长因子蛋白、感觉蛋白、防御蛋白、储存蛋白、受体蛋白、抗体、重组蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白、明胶、角蛋白、层粘连蛋白及其组合，其在水性介质中在剪切力下是假塑性的并且流动，并且其可以被注射或制备以流动，其中当剪切力去除时，所述微凝胶颗粒可以重新形成微凝胶颗粒簇。

所述交联的PEG化的微凝胶颗粒也可以以其干燥状态使用，并且可以放置在身体缺损、伤口、烧伤中或其上，或放置在组织替代物中、上或周围，其中所述微凝胶颗粒可被内源性或外源性源水合。

特别令人感兴趣的是该基于蛋白的微凝胶颗粒作为涂覆、注射或植入材料，在组织、器官、伤口空隙空间、组织替代物和皮肤置换产品中的用途，其中所述水合微凝胶颗粒在剪切力下在水性介质中是假塑性的，并且当剪切力去除时可以重新形成凝结的微凝胶簇。所述微凝胶颗粒可以以其干燥状态作为粉末应用或作为水合颗粒应用。本文所述的材料可以用于这样的方法，该方法包括填充生物空隙、裂伤和软组织腔，和为皮肤替代物提供涂层和支持物，在其中所述微凝胶颗粒充当细胞基质。

空隙的实例包括但不限于损害(lesion)、裂伤、瘘管和憩室。这些空隙可能是生理性的或者是感染、手术、囊肿、肿瘤去除或软组织的创伤性损伤或重塑的结果，如在皮肤和伤口愈合、整形手术、整容手术、重建手术、皮肤置换产品的涂覆/密封、肌腱修复、疝修复、颅面手术、眼科手术、面颈部除皱术、腹壁成形术、隆胸术、心肌修复、软骨修复、神经修复、脊髓修复、肝组织再生、膀胱修复、肌肉修复、***固定术、风湿科、男性女乳症矫治、纤体塑形、嫩肤、紧致换肤、显微手术、用于填充皱纹、遮盖疤痕或丰唇的皮肤美容术等中。

利用了组织工程皮肤替代物和喷涂细胞(spray-on cells)的皮肤置换术(skinreplacement)用于为难愈合的伤口，如由于糖尿病引起的慢性伤口、三度烧伤和创伤伤口提供皮肤修复。皮肤置换产品的不结合和伤口感染可能是使用皮肤置换产品进行伤口愈合不成功的关键决定因素。皮肤置换产品通常填充近60％的伤口空隙，留下40％的没有用于细胞迁移的持续性接触的伤口区域以及用于干燥/浸软和感染发展的开放性区域。本文所述的含微凝胶颗粒的制剂形成适合周围组织的涂层，当作为粉末应用并在原位水合时或作为水合微凝胶颗粒应用时，其填充伤口空隙空间，所述水合微凝胶颗粒增强皮肤置换产品和创面之间的细胞迁移，减少干燥和浸软。当向所述微凝胶颗粒中添加抗微生物剂时，可以减少或消除感染，从而提高愈合效果，特别是对于在临床结果中产生较高摄取率的瘘道(tunneling)和皮下剥离(undermining)伤口、烧伤和皮肤置换产品。

所述微凝胶颗粒衍生自天然存在的或遗传获得的蛋白和基于蛋白的生物大分子，所述蛋白和基于蛋白的生物大分子选自胶原蛋白、细胞外基质、白蛋白、血浆、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、凝血因子、血管性血友病因子、血红蛋白、弹性蛋白、明胶、角蛋白、无细胞真皮、羊膜，脂肪组织、基质胶(Matrigel)、尸筋膜、心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、粘蛋白、聚集蛋白聚糖、肌动蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、串珠素(perlecan)、角蛋白、血影蛋白、胎盘、肝、胰腺、纤维连接蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、网硬蛋白、绒毛膜、脐带、小肠粘膜下层、大肠、膀胱无细胞基质、胃粘膜下层组织、***、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白多糖、串珠素、基膜聚糖、纤维调节蛋白、整合素、钙粘着蛋白、集聚蛋白、巢蛋白(entactin)、骺蛋白聚糖(epiphycan)、肌动蛋白、心包膜、胎盘、来自任意哺乳动物器官的胎组织、病毒衍生物、其组合等。

可注射的基于颗粒的水合微凝胶有利于填充软组织缺损。所述含微凝胶颗粒的组合物可以通过微凝胶的变形(如果注射针的内部尺寸需要)而流动穿过注射针，并且是剪切稀化的使得能够填充瘘道和皮下剥离伤口，因为在可移动的力(movable force)下在静止时可以从颗粒簇中分离出离散的微凝胶颗粒从而降低粘度，并且因为当剪切力去除时可以重新形成颗粒簇，通过形成可模制的、适合的粘弹性固体来再生假塑性基质。所述水合微凝胶颗粒的可流动特性连同其产生的粘弹性固体样性能，使得所述可注射的、假塑性基质能填充不规则的伤口表面或填充组织缺损。

通过PEG化制备衍生蛋白包括将蛋白组分转化为更亲水的状态，其具有可溶胀性但不溶于水性介质。所述衍生蛋白作为水凝胶发挥功能；然而，通过多官能团PEG化交联所述衍生蛋白可在水性介质中导致整体式凝胶化。然后将整体式凝胶冻干并研磨成粉末，其在水合时形成微凝胶颗粒。蛋白和基于蛋白的大分子的PEG化可以通过与主要在蛋白组分上的可用氨基或巯基反应而发生。PEG化试剂通常包含反应性官能团，包括叠氮化物、碳酸酯、酯、醛、丙烯酸酯、羧基、碳二亚胺、羰基咪唑、二氯三嗪、环氧、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、硝基苯基碳酸酯、邻二吡啶基二硫化物(orthopyridyl disulfide)、吡啶氧羰基、琥珀酰亚胺基碳酸酯、琥珀酰亚胺基戊二酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸甲酯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酸、巯基、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、乙烯基砜等。根据用于衍生所述蛋白和/或基于蛋白的大分子的PEG化试剂的类型，其它可用官能团如羧基、胍基、羟基、咪唑或酪氨酸(酚)基团也可以是PEG化的。PEG组分的分子量及其与待PEG化的蛋白或基于蛋白的大分子的摩尔比决定了将获得的水合程度、交联程度以及所得PEG化的复合物的物理、机械和生物性质。一般而言，PEG片段越大，所得的凝胶的水合(溶胀)越高，凝胶越强，凝胶的蛋白组分对蛋白酶降解的稳定性越高，且复合物的生物活性越低。复合物的蛋白组分生物活性的降低可能与由聚(乙二醇)单元和由组合物中的总体稀释引起的空间位阻有关。

可以通过流变学分析对微凝胶的机械性质进行研究。在流变学中，弱生物材料如眼组织(例如，玻璃体)和脂肪的储能模量(G’)和损耗模量(G”)基本上低于强材料如肌肉、肌腱和软骨的相关值。就此而言，G’值的范围为1Pa至1MPa，G”值的范围为0.1Pa至1MPa。在本文所述的一些实施方案中，储能模量的范围为10Pa至250,000Pa，或50Pa至175,000Pa，或100Pa至100,000Pa。在一些实施方案中，损耗模量的范围为5Pa至100,000Pa，或7.5Pa至50Pa，或10Pa至10,000Pa。

在一些实施方案中，所述交联的、水合的、PEG化的微凝胶颗粒在剪切力下显示假塑性。这种假塑性现象是基于水不溶性水合颗粒本身的，而非基于可溶性大分子。此外，本文所述的水合微凝胶颗粒的流变性能与其固体样性能惊人地相关(由损耗角正切(tanδ)值(G”/G’)小于1证明)，而不是更流体样。

在一些实施方案中，本公开提供了衍生的基于蛋白的生物大分子的交联的、水可溶胀的微凝胶颗粒。

在一些实施方案中，本公开提供了通过双官能团至多官能团PEG化交联的基于蛋白的生物大分子。

在一些实施方案中，本公开提供了PEG化试剂与蛋白的摩尔比范围为1:1至100:1。

在一些实施方案中，本公开提供了在水性介质中在剪切力下是假塑性的水合微凝胶颗粒。

在一些实施方案中，本公开提供了这样的组合物，其中当剪切力从水合微凝胶颗粒中去除时，其重新形成微凝胶颗粒簇。

在一些实施方案中，本发明提供了一种干燥微凝胶粉末和水合微凝胶颗粒。

在一些实施方案中，本公开提供了可以在组织、器官、伤口空隙空间、组织替代物、绷带和医疗设备中或其上涂覆、注射、喷、涂或植入的微凝胶颗粒。

在一些实施方案中，本公开提供了用所述微凝胶颗粒治疗具有瘘道和皮下剥离的伤口的方法。

在一些实施方案中，本公开提供了水不溶性的但水可溶胀的、并且在剪切力或压缩力(compression)下可变形的微凝胶颗粒。

在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒的蛋白部分选自细胞外基质、糖蛋白、结构蛋白、纤维蛋白、酶、蛋白聚糖、天然多肽、合成多肽、球状蛋白、膜蛋白、血浆蛋白、肽、寡肽、抗微生物肽、肽激素、伴侣蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、凝血蛋白、免疫***蛋白、离子通道蛋白、细胞粘附蛋白、神经肽、核蛋白、硬蛋白、色素蛋白、缀合蛋白、蛋白-蛋白复合物、蛋白-多糖复合物、蛋白-脂质复合物、蛋白-聚合物复合物、运动蛋白、黏蛋白、磷蛋白、收缩蛋白、转运蛋白、信号蛋白、调节蛋白、生长因子蛋白、感觉蛋白、防御蛋白、储存蛋白、受体蛋白、抗体、重组蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白、明胶、角蛋白、层粘连蛋白及其组合。

在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒的蛋白部分选自纤维蛋白原、纤维蛋白、白蛋白、血浆、细胞外基质和胶原蛋白。

在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒在体内诱导血管生成。

在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒在体内促进移植的细胞存活。

在一些实施方案中，所述蛋白PEG化试剂具有多官能团。

在一些实施方案中，所述蛋白PEG化试剂是α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯(SG-PEG-SG)。

在一些实施方案中，向所述PEG化的蛋白微凝胶中掺入生物活性剂。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是人源的并且是自体的或同种异体的。

在一些实施方案中，所述细胞是人源干细胞并且是自体的或同种异体的。

在一些实施方案中，本发明的另一个目的为生物活性剂是微粒化(micronized)的脱细胞皮肤组织。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是微粒化的或颗粒化(morselized)的组织，例如但不限于脊髓、膀胱、小肠粘膜下层、皮肤、真皮、表皮、脂肪、软骨、胎盘、细胞外基质、肌腱、脐带、角膜、心脏、心肌、肝脏、胰腺和肌肉。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是颗粒化羊膜组织。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是切碎的组织。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是微粒化组织。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是颗粒状交联牛肌腱胶原蛋白和/或糖胺聚糖。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是羊水。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是华通氏胶。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是微粒化的皮肤组织。

在一些实施方案中，所述生物活性剂是生长因子。

在一些实施方案中，所述生物活性剂具有抗微生物性质。

在一些实施方案中，所述抗微生物剂是聚(六亚甲基双胍)及其盐。

在一些实施方案中，向所述PEG化的微凝胶颗粒中添加水溶性聚合物。

在一些实施方案中，向所述PEG化的微凝胶颗粒中添加精油。

在一些实施方案中，所述交联的PEG化的微凝胶颗粒可以作为粉末、液体、凝胶、糊剂、乳膏剂、乳液或其组合应用。

在一些实施方案中，所述水合微凝胶颗粒的流变学储能模量(G’)大于损耗模量(G”)，损耗角正切小于1。

具体实施方式

提供了这样的组合物，所述组合物包括水不溶性微凝胶颗粒，所述水不溶性微凝胶颗粒选自交联的、PEG化的蛋白和基于蛋白的生物大分子，其在水溶液中具有假塑性。水合微凝胶颗粒溶液的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下重新形成微凝胶簇。PEG化试剂与蛋白和基于蛋白的生物大分子的摩尔比为1:1至100:1。在一些实施方案中，所述组合物中微凝胶颗粒的浓度为10mg/mL至1,000mg/mL，或25mg/mL至800mg/mL，或50mg/mL至750mg/mL，或从100mg/mL至500mg/mL。单独或混合物中的独立的和成簇的水合微凝胶颗粒可以具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值。

使用常规单官能团PEG化来制备水不溶性、水可溶胀的、PEG化的蛋白通常不是优选的，因为会经常获得可溶性凝胶，其不能提供所需的机械性质。该可溶性凝胶可能为添加的细胞提供不良的支架。在用于制备本文所述的水不溶性、水可溶胀的、PEG化的蛋白整体式水凝胶的一些实施方案中，在直链或支链末端上的通过多官能团反应性基团的PEG化中，使用了多臂聚(乙二醇)(PEG)以在水性介质中产生整体式凝胶，该整体式凝胶可以在干燥且转化成颗粒(例如通过研磨如杵臼或冷冻研磨)后转化成不溶性微凝胶颗粒。在一些实施方案中，可以在蛋白PEG化制备过程中，通过快速搅拌或剪切所得的凝胶来直接获得微凝胶颗粒。在一些实施方案中，优选分离整体式凝胶，因为在微凝胶颗粒形成之前可以通过萃取分离未反应的组分。

在一些实施方案中，所述PEG化试剂选自α-氨基丙基-ω-氨基丙氧基聚氧乙烯、α-氨基丙基-ω-羧基戊氧基聚氧乙烯、α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]乙基}聚乙二醇、α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基ω-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙氧基聚氧乙烯、季戊四醇四(氨基丙基)聚氧乙烯，α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-(琥珀酰亚胺基氧羧基)聚氧乙烯、季戊四醇四(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯、六聚甘油八(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、六聚甘油八(4-硝基苯氧羰基)聚氧乙烯、4-臂聚(乙二醇)四丙烯酸酯、4-臂琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、双(聚氧乙烯双[咪唑基羰基])、O-(3-羧丙基)-O′-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双(2-叠氮基乙基)聚乙二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二环氧甘油醚、聚(乙二醇)二(对-硝基苯基碳酸酯)、聚(乙二醇)二(乙烯砜)、聚(乙二醇)二(丙醛)、聚(乙二醇)二(苯并***基碳酸酯)等及其组合。在一些实施方案中，PEG化试剂是α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯(SG-PEG-SG)，可购自NOF美国公司，商品名为

DE-034GS，分子量为3,400道尔顿(CAS号：[154467-38-6])。通常认为，SG-PEG-SG可通过消除蛋白氨基的N-羟基琥珀酰亚胺来交联蛋白，在多个蛋白片段和PEG化试剂之间形成氨基甲酸酯桥连。因此，通常认为PEG化试剂在纤维蛋白原部分之间形成桥连。

在一些实施方案中，PEG化的纤维蛋白原和PEG化的纤维蛋白水合微凝胶颗粒为用作组织、器官和伤口空隙空间中或上的软组织填充物、涂层，移植或注射以及组织替代物的适宜涂层提供了便利的递送形式，充当可降解的支架，从而在愈合期间控制伤口环境并促进血管生成。由于新形成的血管参与到愈合过程中，为细胞和生长组织提供氧气和营养，因此血管生成和新血管形成是伤口愈合效果的关键性决定因素。已知伤口愈合可被纤维蛋白肽(纤维蛋白原和纤维蛋白的降解产物)促进，其在增强血管生成和组织再生中有已知的作用。

与整体式水凝胶相反，独立的水合微凝胶颗粒具有大孔径和用于细胞附着的大表面积。除了本文所述的独特的流动性质之外，所述微凝胶颗粒体系的柔性和开放性使得细胞能够迁移。在干燥微凝胶颗粒的一些实施方案中，孔径(pore size)范围为0.9μm至40.7μm，而颗粒的长度范围为10.9μm至1347.7μm，宽度为2.2μm至874.2μm。在干燥微凝胶颗粒的一些实施方案中，孔径范围为0.9μm至23.7μm，而颗粒的长度范围为5.3μm至1832.8μm，宽度为1.6μm至894.2μm。在一些实施方案中，所述干燥微凝胶颗粒通过冷冻研磨或通过杵臼制备。

在一些实施方案中，当用作细胞支架时，所述干燥微凝胶被含有细胞的溶液快速再水合。在一些实施方案中，将干燥微凝胶粉末预先装载入注射器中，并且将细胞吸入注射器中，以便在将负载细胞的组合物注射到伤口或缺损中之前水合所述微凝胶粉末。在其他实施方案中，将干燥微凝胶粉末预先装载入小瓶中，然后将溶液中的细胞通过隔膜注入小瓶中，以便在将负载细胞的体系吸入注射器中并注射到需要其的组织、空隙或伤口中之前水合所述微凝胶。在一些实施方案中，水合假塑性细胞组合物可以通过注射器或套管注射到组织、空隙或伤口中，或通过涂覆应用以进行局部递送。在应用时，所述水合微凝胶颗粒通过与彼此和与周围组织粘附而聚集形成微凝胶簇。所述微凝胶簇形成凝结的水凝胶网络，其在微凝胶颗粒中和上以及微凝胶颗粒之间含有空隙空间。所述微凝胶颗粒的剪切稀化和快速自聚集特性，连同其调节空隙空间中的细胞和其他生物剂的能力，加上其用微凝胶和组织之间的界面来填充空腔形状的能力，为递送生物剂提供了优越的网络。作为结果，本文所述的水不溶性微凝胶颗粒组合物提供了优异的细胞递送体系。

当再水合时，已经冻干并研磨成粉末的PEG化的纤维蛋白原颗粒呈现出剪切稀化、可流动的性能。在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒在盐水溶液(93wt％盐水)中吸附其重量的近15倍，比类似的PEG化的纤维蛋白颗粒更多地水合，所述PEG化的纤维蛋白颗粒在相同的PEG化程度(摩尔比为50:1，表1)下在盐水溶液(89wt％盐水)中吸附其重量的近7倍。不同于形成单一的固体凝胶，这些PEG-纤维蛋白原微凝胶颗粒与相邻的PEG-纤维蛋白原微凝胶颗粒通过氢键相互作用以形成具有剪切稀化性质的“凝胶样”固体。

本文所述的微凝胶颗粒相对于在宿主中原位制备的整体式水凝胶的优点是：可以对注射产品预纯化以除去未反应的组分；可以基于剪切稀化性质，以水合微凝胶形式将所述注射产品注射到指定位置，这有助于填充软组织缺损；可以在室温下以粉末形式储存所述注射产品；并且可以在临床操作(clinical procedure)中通过将细胞溶液吸入含有微凝胶粉末的注射器中，使所述注射产品与细胞混合，或以其它方式使细胞溶液与微凝胶粉末接触。所述水合微凝胶颗粒的多孔网络还使得细胞能够迁移，并通过穿过其孔和空隙空间的营养交换和宿主细胞浸润(infiltration)来提高细胞存活。这种柔性与整体式水凝胶形成鲜明对照，例如已报道的作为支架的聚(乙二醇)(PEG)水凝胶，由于PEG水凝胶的密度，细胞可能难以浸润(美国专利号8,557,288)。

此外，整体式凝胶的原位制备通常利用PEG化的材料上的侧链丙烯酸酯基团或其它乙烯基型单体的光聚合。虽然在临床环境中该操作是繁冗复杂的，但自由基原位聚合的引发也会产生热量，这对周围组织或添加的细胞是不利的。该流程还表现出在体内保留有残留的、未反应单体的可能性，其可能具有细胞毒性。

在一些实施方案中，本文所述的微凝胶颗粒的形状可以是不规则的，或者可以具有规定的形状，如球形或椭圆形。在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒可以是微孔的、介孔的或大孔的。因此根据实施方案，所述微凝胶颗粒可以具有可调整的尺寸，可调整的水合度、用于细胞附着或添加生物剂的大表面积以及用于掺入其它生物分子的内部多孔网络。此外，所述微凝胶颗粒具有固有的可生物降解性。此外，与整体式(成块)水凝胶相反，由于其尺寸较小、柔性、容易发生变形和压缩，因此所述微凝胶颗粒对环境变化有响应。

在一些实施方案中，所述假塑性微凝胶颗粒组合物可以包括具有羊水、颗粒化羊膜组织、切碎的组织、微粒化组织、微粒化脱细胞组织、血浆、血液、颗粒状交联牛肌腱胶原蛋白和糖胺聚糖、细胞培养基中的细胞和干细胞、合成或天然衍生的细胞外基质组分(包括胶原蛋白、糖胺聚糖、纤维蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白)、羟基磷灰石、蜂蜜、多糖、可生物降解的聚合物(包括聚乙交酯、聚丙交酯，聚(丙交酯-乙交酯)、聚二噁烷酮、聚己内酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚氨基甲酸酯、聚(酯酰胺)、聚(原酸酯)，聚酸酐、聚(氨基酸)、聚磷腈和细菌聚酯及其组合的水溶液，并且其可以被注射到软组织、空隙或伤口中。

在一些实施方案中，切碎的组织选自皮肤组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脂肪组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、膀胱组织、肠道组织、心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织和声带组织。在一些实施方案中，微粒化组织和微粒化脱细胞组织选自皮肤组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脂肪组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、膀胱组织、肠道组织、心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织和声带组织。所述假塑性微凝胶基质可用于例如治疗具有瘘道和皮下剥离的糖尿病性足溃疡，或其它需要可流动粘弹性基质的伤口或外科手术(surgical procedure)。

纤维蛋白原是脊椎动物的水溶性糖蛋白，其有助于血块形成。纤维蛋白原分子是水溶性的、340kDa的血浆糖蛋白，其在血块形成期间被凝血酶转化成水不溶性纤维蛋白。纤维蛋白原为棒状形状，尺寸近9×47.5×6nm，在生理pH(等电点为pH 5.2)下具有负净电荷。纤维蛋白原可从人血浆、牛血浆、鲑鱼血浆、狒狒血浆、鼠血浆、小鼠血浆、大鼠血浆、犬血浆和猫血浆中商购获得。在一些实施方案中，优选人血浆。在一些实施方案中，利用含有50-70％蛋白(其中≥80％的蛋白是可凝结的)的来自人血浆的Sigma-Aldrich(F3879)纤维蛋白原。在一些其它实施方案中，可以利用来自自体、同种异体或异种来源的纤维蛋白原。在其它实施方案中，可以利用重组纤维蛋白原。在一些实施方案中，优选自体人纤维蛋白原。

凝血酶是一种蛋白水解酶，其作为丝氨酸蛋白酶将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链以及催化许多其他与凝血相关的反应。凝血酶可从多种类型的血浆中获得，如人、牛、猪、马、大鼠、兔和重组来源。在一些实施方案中，对于PEG化的纤维蛋白原向PEG化的纤维蛋白的转化，优选使用≥1,000NIH单位/mg蛋白的、来自人血浆的Sigma Aldrich(T7009)凝血酶。

在一些实施方案中，所述微凝胶组合物由与双官能团至多官能团PEG化试剂交联的纤维蛋白原或纤维蛋白的研磨颗粒组成，产生水不溶性凝胶颗粒，所述水不溶性凝胶颗粒由主要是纤维蛋白原或纤维蛋白蛋白链之间的侧链氨基酸基团之间的聚(乙二醇)取代物(substituent)的各种组合构成。每种微凝胶颗粒均是多个纤维蛋白原或纤维蛋白的蛋白链的复合物，散布在较短但量更多的聚(乙二醇)链之间。所述微凝胶颗粒的形成发生在应用到组织、器官、伤口和组织替代物之前，这避免为了聚合而在原位使用仪器(instrumentation)，提供了在引入体内之前去除污染性单体和引发剂的能力，并避免了在引入位点产生聚合热。这种组合有助于促进注射成功。

进行蛋白取代物和/或基于蛋白的大分子的PEG化时，PEG化试剂与蛋白组分的摩尔比可以为100:1、75:1、50:1、35:1、20:1、15:1、10:1、7.5:1、5:1、2.5:1和1:1，或任意以任意这些摩尔比开始或结束的范围(例如，100:1至1:1，或50:1至2.5:1，或50:1至10:1，或35:1至5:1)。在一些实施方案中，PEG化试剂与蛋白组分的摩尔比为10：1、20：1、35：1和50：1。在一些实施方案中，在冻干整体式凝胶之后，将冷冻干燥的聚合物用杵臼或冷冻研磨粉末化，并通过筛分进一步分离，得到干燥微凝胶颗粒的中值粒度范围为10μm至1,000μm，或50μm至500μm，或75μm至250μm。在一些实施方案中，在冻干整体式凝胶之后，将冷冻干燥的聚合物用杵臼或冷冻研磨粉末化，得到干燥颗粒的中值粒度长度范围为10μm至1,000μm，或50μm至500μm，或75μm至250μm。

在一些实施方案中，所述微凝胶颗粒与流体水合。在一些实施方案中，所述流体的流动相是水、等渗盐水、平衡盐溶液、缓冲溶液、林格氏溶液、细胞培养基、干细胞培养基、血清、血浆、羊水、华通氏胶、营养液、防腐溶液或其组合。所述微凝胶颗粒的水合度至少取决于PEG化试剂与衍生化蛋白的摩尔比；所得微凝胶颗粒的孔隙度和表面积；以及流动相的pH、克分子渗透压浓度和温度。在所述流体是水性介质的一些实施方案中，所述水性介质的pH范围可以为4.5至8.0，或5.5至7.5。在一些实施方案中，当使用盐水溶液测量时，所述微凝胶颗粒的水合度(溶胀度)可以是所述微凝胶颗粒干重的至少50倍、至少40倍、至少30倍、至少20倍、至少10倍、至少5倍或至少2倍。

在一些实施方案中，向所述微凝胶颗粒中添加抗微生物剂以阻碍微生物的发育和增殖。在一些实施方案中，抗微生物剂的添加有助于减少或消除微生物菌落和生物膜形成。由于空隙、伤口和烧伤中可能受感染，因此PEG化的蛋白微凝胶组合物可以包括足以阻碍或根除微生物的量的生物剂。

生物剂的实例包括但不限于抗生素、防腐剂、抗感染剂、抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗原生动物剂、杀孢子剂和抗寄生虫剂。在一些实施方案中，所述生物剂是可生物降解的、对人和动物细胞无毒的或者是可生物降解且无毒的。

杀生物剂的实例包括但不限于双胍，例如聚(六亚甲基双胍)(PHMB)及其盐，低分子量合成阳离子双胍聚合物，氯己定及其盐如氯己定二葡萄糖酸盐，和阿来西定(alexidine)及其盐如己联双辛胍，其中后两者为双(双胍)，苯扎氯铵，苄索氯铵，十六烷基三甲基溴化铵，甘油单月桂酸酯，辛二醇，硫酸庆大霉素，碘，聚维酮碘，淀粉碘，硫酸新霉素，多粘菌素B，杆菌肽，四环素，克林霉素，庆大霉素，呋喃西林，醋酸磺胺米隆，银纳米粒，磺胺嘧啶银，硝酸银，盐酸特比萘芬，硝酸咪康唑，酮康唑，克霉唑，伊曲康唑，甲硝唑，抗微生物肽，聚季铵盐-1，聚季铵盐-6，聚季铵盐-10，其盐及其组合。

在一些实施方案中，所述抗微生物双胍是聚(六亚甲基双胍)盐酸盐(PHMB)。由于PHMB针对微生物的高杀生活性以及其生物降解性和低细胞毒性，因此可以使用。PHMB的活性主要针对革兰氏阴性和***、真菌和病毒。抗生素被认为是受管制的药物，并且可能发生细菌耐药性，与抗生素相比，PHMB不会发生这种耐药性。如本文所用，“抗微生物剂”是一种杀死微生物或抑制其生长或复制的物质，而“抗感染剂”是一种通过杀死感染因子如微生物或预防其传播来抵抗感染的物质。通常，这两个术语可互换使用。如本文所用，认为“PHMB”是抗微生物剂。

在一些实施方案中，基于所述组合物总重量，本文所述的含有水合或再水合PEG化的蛋白微凝胶颗粒的组合物可以包括浓度范围为0.0001wt％(1ppm)至1wt％(10,000ppm)，或范围为0.01wt％(100ppm)至0.75wt％(7,500ppm)，或范围为0.05wt％(500ppm)至0.5wt％(5,000ppm)，或范围为0.1wt％(1,000ppm)至0.25wt％(2,500ppm)的杀生性PHMB。在一些实施方案中，基于所述组合物总重量，本文所述的干燥PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可以包括浓度范围为0.002wt％(20ppm)至25.0wt％(250,000ppm)，或范围为0.20wt％至15.0wt％(150,000ppm)，或范围为1.0wt％(10,000ppm)至10.0wt％(100,000ppm)，或范围为2.0wt％(20,000ppm)至4.0wt％(40,000ppm)的杀生性PHMB。

一些实施方案中，可以向所述抗微生物PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物中添加浓度为0.001wt％(10ppm)至4.0wt％(40,000ppm)的双(双胍)，如阿来西定及其盐和氯己定及其盐。

在一些实施方案中，可以向所述抗微生物PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物中添加浓度为0.001wt％(10ppm)至2.0wt％(20,000ppm)的表面活性剂型抗微生物剂，如苄索氯铵或苯扎氯铵。

在一些实施方案中，可以向所述抗微生物PEG化的微凝胶颗粒蛋白组合物中添加浓度为0.1wt％(1,000ppm)至2.0wt％(20,000ppm)的亲脂型抗微生物剂，如甘油单月桂酸酯或辛乙二醇。

在一些实施方案中，可以向所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒中共价掺入具有反应性官能团如氨基、亚氨基、咪唑基、巯基、羟基、酚基(phenolic)、吲哚基、胍基(guanidium)、胍鎓(guanidinium)和羧基的抗微生物剂，形成PEG化的蛋白/抗微生物剂的三元复合物。在一些实施方案中，形成了PEG化的纤维蛋白原/PHMB微凝胶颗粒的共价结合的三元复合物。

在一些实施方案中，水性PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的克分子渗透压浓度可以为10-340mOsm/kg。在一些实施方案中，在该实施方案中所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物是水基溶液、凝胶、糊剂、乳液或泡沫剂，可以添加水溶性聚合物以增加溶液粘度和延长在组织、空隙或伤口的表面上，或在空隙或伤口的皮下的停留时间。在一些实施方案中，有用的水溶性聚合物包括但不限于聚(乙二醇)、聚(氧乙烯)、聚(乙烯醇)和共聚物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)和共聚物、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、瓜尔胶、羟乙基瓜尔胶、羟丙基瓜尔胶、明胶、白蛋白、羟丙基甲基瓜尔胶、羧甲基瓜尔胶、羧甲基壳聚糖、刺槐豆胶、角叉菜胶、黄原胶、结兰胶、普鲁兰多糖、藻酸盐、硫酸软骨素、右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、芦荟凝胶、硬葡聚糖、裂裥多糖、***树胶、罗望子胶、聚(甲基乙烯基醚)、氧乙烯-环氧丙烷-氧乙烯嵌段共聚物、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、右旋糖酐、卡波姆及其盐、聚(丙烯酸)及其盐、聚(甲基丙烯酸)及其盐、聚(乙烯-丙烯酸)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基磷酸)盐、聚(乙烯基磺酸)盐、聚(2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸)钠、(多种)聚丙烯酰胺、聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(N-乙烯基乙酰胺)、聚(N-乙烯基甲酰胺)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甘油酯)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚(N-乙烯基己内酰胺)，后两者在低于其低临界溶解温度下水合，聚季铵盐-1、聚季铵盐-6、聚季铵盐-10、紫罗烯聚合物、阳离子瓜尔胶、吡啶鎓(pyridinium)聚合物、咪唑鎓(imidazolium)聚合物、二烯丙基二甲基铵聚合物、聚(L-赖氨酸)、丙烯酰基-、甲基丙烯酰基-和苯乙烯基-三甲基铵聚合物、丙烯酰胺基-和甲基丙烯酰胺基-三甲基铵聚合物、抗微生物肽等、及其衍生物和组合。

在一些实施方案中，可以通过包含数量范围为约0.01至约50.0wt％，0.1至45wt％，0.5至25wt％，或1.0至10.0wt％的水溶性聚合物增粘剂，来促进粘性溶液、凝胶、乳膏剂、糊剂、乳液、香脂、和喷雾剂形式的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的制备。

在一些实施方案中，可以向所述微凝胶颗粒组合物中添加精油作为香料或芳香剂和/或作为抗微生物剂。可用于本文所述微凝胶颗粒组合物的精油的实例包括但不限于百里酚、薄荷醇、檀香、樟脑、小豆蔻、肉桂、茉莉、薰衣草、天竺葵、杜松、薄荷醇、松树、柠檬、玫瑰、桉树、丁香、桔树、牛至、薄荷、芳樟醇、荷兰薄荷、薄荷、柠檬草、香柠檬、香茅、柏树、肉豆蔻、云杉、茶树、冬青(水杨酸甲酯)、香草等。在一些实施方案中，所述精油可以选自百里香酚、檀香油、冬青油、桉叶油醇、松油及其组合。在一些实施方案中，基于所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的重量，精油存在的量的范围可以为0％至5wt％。在一些实施方案中，基于所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的重量，精油存在的量的范围可以为至少0.1wt％，或至少0.25wt％，或至少0.5wt％。

在一些实施方案中，也可以使用叶绿酸(一种水溶性半合成叶绿素衍生物)来控制伤口气味和提供抗炎性质。在一些实施方案中，基于所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的重量，叶绿酸存在的量的范围可以为0％至5wt％。在一些实施方案中，基于所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的重量，叶绿酸存在的量的范围可以为至少0.1wt％，或至少0.25wt％，或至少0.5wt％。

在一些实施方案中，所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物还可以包括润湿剂、缓冲液、胶凝剂或乳化剂。其它赋形剂可以包括各种水基缓冲液(pH范围为5.0-7.5)、表面活性剂、硅酮、聚醚共聚物、蔬菜和植物脂肪和油类、亲水性和疏水性醇、维生素、单酸甘油酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯和硬脂酸酯。在一些实施方案中，所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可以是这样的形式，其包括但不限于液体、凝胶、糊剂、乳膏剂、乳液、其组合等。在一些实施方案中，将所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物冻干成干粉。所述冻干的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可以以粉末形式使用，或者可以将所述粉末进一步加工(例如，再水合)成溶液、悬浮液、乳膏剂、洗剂、凝胶、糊剂、乳液、香脂、喷雾剂、泡沫剂、气雾剂、薄膜或其他制剂。

在一些实施方案中，所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒是纳米粒、纳米壳、纳米棒及其组合的形式。在一些实施方案中，所述脱水或冻干的PEG化的蛋白微凝胶颗粒是纳米粒、纳米壳、纳米棒及其组合的形式。

如本文所用，“水性介质”是指一系列水基溶液，其包括但不限于具有可溶组分的均质水溶液、细胞培养基溶液、缓冲溶液、等渗溶液、盐溶液、乳化溶液、表面活性剂溶液、羊水、华通氏胶、血清、亲水聚合物以及粘稠的或凝胶状均质的或乳化的水溶液。

如本文所用，“表面活性剂”具有其标准含义，并且包括降低两种液体之间或液体和固体之间表面张力(或界面张力)的化合物，包括乳化剂(emulsifying agents)、乳化剂(emulsifiers)、洗涤剂、润湿剂和表面活性剂。

如本文所用，“亲水性”具有其标准含义，并且包括这样的化合物，该化合物对水具有亲和能力并且可以是离子或中性的或者其结构中具有吸引水的极性基团。例如，亲水性化合物可以是与水混溶的、水膨胀性的、水可吸附的或溶于水的，在室温下在水中与水的静态接触角≤90°。

如本文所用，“疏水性”是指排斥水，不溶于水或相对不溶于水，并且缺乏对水的亲和能力，在室温下在水中与水的静态接触角≥90°。具有亲水性取代基的疏水性化合物如邻二醇，可以在添加或不添加表面活性剂的情况下，在水中形成乳液，亲水性取代基在水界面，且化合物的疏水性部分在乳液的内部。

如本文所用，“可溶胀”是指摄取、吸收和/或吸附流体到其官能团、表面、孔、微孔、纳米孔、洞和间隙网络的材料。

如本文所用，术语“PEG化”指通过将具有反应性取代基的聚(乙二醇)(PEG)共价连接到蛋白的可用反应性官能团(如氨基或巯基)来对蛋白或基于蛋白的大分子进行修饰，而“PEG化的”是指连接有PEG取代基的蛋白。

如本文所用，“蛋白”旨在包括基于蛋白的大分子，并且包括细胞外基质、糖蛋白、结构蛋白、纤维蛋白、酶、蛋白聚糖、天然多肽、合成多肽、球状蛋白、膜蛋白、血浆蛋白、肽、寡肽、抗微生物肽、肽激素、伴侣蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、凝血蛋白、免疫***蛋白、离子通道蛋白、细胞粘附蛋白、神经肽、核蛋白、硬蛋白、色素蛋白、缀合蛋白、蛋白-蛋白复合物、蛋白-多糖复合物、蛋白-脂质复合物、蛋白-酶复合物、蛋白-聚合物复合物、运动蛋白、黏蛋白、磷蛋白、收缩蛋白、转运蛋白、信号蛋白、调节蛋白、生长因子蛋白、感觉蛋白、防御蛋白、储存蛋白、受体蛋白、抗体、重组蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白、明胶、角蛋白、层粘连蛋白及其组合。

如本文所用，“衍生蛋白”是与另一种物质，如其他蛋白、多糖、寡糖、糖胺聚糖、脂质、磷脂、脂质体、合成多肽、DNA、RNA、合成聚合物、表面活性剂、金属原子、纳米粒、抗微生物剂、抗生素、药物、其盐等连接、结合、配位或复合的蛋白组分。

如本文所用，“水凝胶”是通常由水溶性大分子构成的不溶性聚合物网络，其通过大分子链间的共价、离子或物理相互作用以交联或假交联状态存在，其中在水中所述不溶性网络吸附其重量的至少10％。水凝胶可以含有一种或多种亲水性聚合物。

如本文所用，“整体式”水凝胶由交联的、亲水性聚合物或多种聚合物的单一的、大的网络构成，其可细分为更小的、交联的微凝胶颗粒。

如本文所用，“微凝胶”是一种凝胶状的、水不溶性、亲水性颗粒，其长度范围为1微米至1,000微米、直径为1微米至1,000微米，或者是一种能够呈现出这些性质的脱水颗粒。

如本文所用，“微凝胶颗粒”是水不溶性、水可溶胀的凝胶片段的混合颗粒，取决于形成方法，其具有不同的形状，包括球形、椭圆形、角形、规则(有组织)或不规则形状、中空、微孔、介孔、大孔或具有空隙空间或其组合。

如本文所用，词语“微孔”是指孔径小于2nm的材料，“介孔”颗粒的孔径在2至50nm之间，“大孔”颗粒的孔径大于50nm。

如本文所用，“可流动”涉及一定体积的流体或凝胶，其能够流动通过任意给定尺寸的通道，例如通过挤压管、泵、插管或注射器。

如本文所用，“可注射”描述了溶液、悬浮液、凝胶、乳液或微凝胶穿过皮下注射针或插管的能力。

如本文所用，“牛顿流体”呈现出这样的粘度，该粘度与所研究的剪切力条件无关。

如本文所用，“非牛顿流体”呈现出这样的粘度，该粘度取决于所研究的剪切力条件。

如本文所用，“假塑性”涉及一种流体组合物，其粘度随剪切速率的增加而降低，即剪切稀化。

如本文所用，“剪切速率”(也称为剪切应变速率)是应力作为时间的函数变化的速率。

如本文所用，“损耗模量(G”)”是材料在变形(例如剪切力)下损失的能量的量度。G”归因于粘性流动，而非弹性变形。损耗模量也称为粘性模量。

如本文所用，“储能模量(G’)”是材料在变形(例如剪切力)下储存的能量的量度。G’归因于弹性变形。储能模量也称为弹性模量。

如本文所用，“损耗角正切”(也称为tanδ)是相位角(δ)的正切，其是损耗(粘性)模量(G”)与储能(弹性)模量(G’)的比，即tanδ＝G”/G’。损耗角正切是流体中弹性存在和程度的有用量词。损耗角正切值小于1表示具有弹性显性(即固体样)性能，值大于1表示具有粘性显性(即液体样)性能。

如本文所用，“生物活性剂”具有标准含义，并且包括对人类或动物健康安全有有益影响的，或旨在用于治愈、缓解、治疗、预防或诊断感染或疾病的，或破坏或抑制微生物生长的化学或生物物质或制剂。

如本文所用，“抗微生物剂”具有其标准含义，并且包括杀死微生物或抑制其生长或复制的物质，而“抗感染剂”被定义为通过杀死感染因子如微生物或预防其传播来抵抗感染的物质。通常，这两个术语可互换使用。

如本文所用，“抗生素”具有其标准含义，并且包括最初由微生物产生的或合成的物质，其具有能杀死或预防另一微生物生长的活性性质。术语抗生素通常用于指几乎任何试图消除感染的处方药。

如本文所用，“赋形剂”具有其标准含义，并且包括形成载体如液体、流体或凝胶的惰性物质，其溶解或分散PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物，其可能包括其它添加成分。

如本文所用，“粘弹性”是材料这样的性质，当经历变形时呈现出粘性和弹性特性。

如本文所用，当施加的剪切力负荷被去除后，“粘弹性固体”能够恢复其原始形状，而粘弹性液体则不能。

如本文所用，“软组织”具有其标准含义，并且包括连接、支持或围绕身体的其他结构和器官的生物组织，但不包括骨。软组织的实例包括肌腱、韧带、筋膜、皮肤、纤维组织、脂肪、滑膜、肌肉、神经和血管。

如本文所用，“纳米粒”是尺寸在1至500纳米之间的颗粒，并且还包括尺寸在1至100纳米之间的颗粒。

如本文所使用的，“纳米壳”是由另一化合物的壳或外部涂层围绕的特定化合物的球形核，其厚度是几纳米。

如本文所用，“纳米棒”是棒状颗粒，其长度为半径或宽度的至少两倍，并且其长度通常为1至100nm。

如本文所用，“微粒”是尺寸在0.1和100μm之间的各种尺寸的颗粒。

如本文所用，“微球”是球形颗粒，其直径通常为1μm至1,000μm。微球有时指微粒。

在一些实施方案中，可以向所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物中掺入一种或多种可观察的或可检测的试剂以提供增强的可视化性能或促进正确放置。在其它实施方案中，所述试剂可以包括染料、荧光物质、紫外线吸收剂、放射性物质、颜料或其任何组合。

在一些实施方案中，可以向所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物中掺入一种或多种生物活性剂以为哺乳动物宿主提供医疗有益效果。可以向所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物中掺入的生物活性剂的实例包括但不限于细胞、干细胞、羊膜组织、羊膜细胞、生长因子、微粒化的脱细胞皮肤组织、颗粒状交联牛肌腱胶原蛋白和糖胺聚糖、抗生素、防腐剂、抗感染剂、抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗原生动物剂、杀孢子剂和抗寄生虫剂、周围神经病变剂、神经性剂、趋化剂、镇痛剂、抗炎剂、抗过敏剂、抗高血压剂、丝裂霉素型抗生素、多烯抗真菌剂、止汗剂、减充血剂、抗晕动病剂、中枢神经***剂、伤口愈合剂、抗VEGF剂、抗肿瘤剂、腐蚀剂、抗牛皮癣剂、抗糖尿病药、抗关节炎药、止痒剂(anti-itchingagents、antipruritic agents)、麻醉剂、抗疟剂、皮肤病药剂、抗心律失常剂、抗惊厥药、止吐剂、抗风湿剂、抗雄性激素剂、蒽环类药物、抑烟剂、抗痤疮剂、抗胆碱能剂、抗老化剂、抗组胺剂、抗寄生虫剂、止血剂、血管收缩剂、血管舒张剂、血栓形成剂、抗凝血剂、心血管药物、心绞痛药、***功能障碍药物、性激素、生长激素、异黄酮、整联蛋白结合序列、生物活性配体、细胞贴附介质(cell attachment mediators)、免疫调节剂、肿瘤坏死因子α、抗癌剂、抗肿瘤剂、抗抑郁剂、镇咳剂、抗肿瘤剂、麻醉拮抗剂、抗高胆固醇血症药、细胞凋亡诱导剂、避孕剂、免晒美黑剂、润滑剂、α-羟基酸、麦卢卡蜂蜜、局部维他命A群(topical retinoid)、激素、肿瘤特异性抗体、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、抗VEGF RNA适体、核酸、DNA、DNA片段、DNA质粒、Si-RNA、转染剂、维生素、精油、脂质体、银纳米粒、金纳米粒、含药纳米粒、基于白蛋白的纳米粒、含壳聚糖纳米粒、基于多糖的纳米粒、树枝状纳米粒、磷脂纳米粒、氧化铁纳米粒、铋纳米粒、钆纳米粒、金属纳米粒、陶瓷纳米粒、基于二氧化硅的纳米粒、基于病毒的纳米粒、病毒样纳米粒、含抗生素纳米粒、含一氧化氮纳米粒、纳米壳、纳米棒、聚合物胶束、银盐、锌盐、量子点纳米粒、基于聚合物的微粒、基于聚合物的微球、含药微粒、含药微球、含抗生素微粒、含抗生素微球、抗微生物微粒、抗微生物微球、水杨酸、过氧化苯甲酰、5-氟尿嘧啶、烟酸、***油、可乐定、***、睾酮、尼古丁、抗运动病药、东莨菪碱、芬太尼、双氯芬酸、丁丙诺啡、布比卡因、酮洛芬、阿片样物质、***素、酶、酶抑制剂、寡肽、环肽、多肽、蛋白、前药、蛋白酶抑制剂、细胞因子、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、副交感神经抑制剂、螯合剂、毛发生长剂、脂质、糖脂、糖蛋白、内分泌激素、生长激素、生长因子、分化因子、热休克蛋白、免疫应答调节剂、糖类、多糖、胰岛素和胰岛素衍生物、类固醇、皮质类固醇和非甾体抗炎药物或类似物质，以其盐形式或其中性形式，具有固有的亲水性或包封在亲水性微粒或纳米粒内。该生物活性剂可以是(R)-、(R，S)-或(S)-构型或其组合。

如本文所用，“注射”具有其标准含义，并且包括皮内、皮下、口腔、肌内、粘膜下、皮下、鼻内、***、颊、鞘内、硬膜外，实质内、眼、视网膜下、齿、肿瘤内、心内、关节内、静脉内、海绵体内、骨内、腹膜内、腹内、筋膜内、器官内(intraogan)和玻璃体内操作。

如本文所用，可以向手术产生的空腔/空隙，由疾病引起的空腔/空隙，以及由损伤引起的空腔/空隙之中注射。

如本文所用，“细胞培养”具有其标准含义，并且包括细胞、组织或器官从动物或植物转移，以及随后将其放置在有利于其生存和/或增殖的环境中。

在一些实施方案中，所述可注射的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可包括细胞。可用于本文所述的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的细胞的实例包括但不限于成纤维细胞、角质形成细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、背根神经节、脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞、纤维软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、成肌细胞、肝细胞、肌腱细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞、基质细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、血小板及其组合。在一些实施例中，所述细胞是真核生物的或哺乳动物的。在一些实施方案中，所述细胞是人源的。在一些实施方案中，所述细胞可以是自体的或同种异体的。

在一些实施方案中，所述可注射的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可以包括成体干细胞、胚胎干细胞、羊膜干细胞、诱导性多能干细胞、胎体干细胞、组织干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞、人脐带血干细胞、血液祖细胞、间充质干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、内皮祖细胞、上皮干细胞、表皮干细胞、心脏干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、角膜缘干细胞、围产期干细胞、卫星细胞、侧群细胞、多能干细胞、全能干细胞、单能干细胞及其组合。在一些实施方案中，所述干细胞是哺乳动物的。在一些实施方案中，所述干细胞是人源的。在一些实施方案中，所述干细胞可以是自体的或同种异体的。

在一些实施方案中，本文所述的可注射的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可用作支架基质，以递送治疗有效量的10,000个细胞至约10亿个细胞。

在一些实施方案中，可以将衍生自胎盘组织的产品掺入所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物，用于注射到哺乳动物宿主中。胎盘组织是胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白和生长因子的来源，所述生长因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子β(TGF-β)，其可以支持组织修复和再生。特别地，羊膜组织具有抗粘合和抗微生物性质，并且已经显示该组织能支持软组织修复、减少炎症并最小化瘢痕组织形成，这在治疗软组织损伤方面具有显著的有益效果。

据已描述，羊膜组织具有免疫豁免性，因为人体内的免疫应答很少对羊膜组织的引入发生响应。在一些实施方案中，衍生自羊膜组织的颗粒化的、可流动的组织同种异体移植物可购自BioD，LLC，其商品化名称为BioDRestore^TM Elemental Tissue Matrix，可以添加到PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物中，用于涂覆或注射到软组织中或用于组织替代物周围的放置。例如，PEG化的纤维蛋白原微凝胶颗粒组合物可以包括衍生自羊膜组织的颗粒化的、可流动的组织同种异体移植物。

在一些实施方案中，所述PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可以包括生长因子。可用的生长因子的实例包括但不限于表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生因子(PDGF)、***生长因子(CTGF)、***(IGF)、角质细胞生长因子(KGF)、白介素(IL)家族、基质细胞衍生因子(SDF)、肝素结合生长因子(HBGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、生长分化因子(GDF)、肌肉形态发生因子(MMF)和肿瘤坏死因子-α(TNFα)。

在一些实施方案中，所述多组分PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物可以用作可注射的软组织空隙填充物，并且还可以包括适于充填、加强、支持、修复、重建、愈合、阻塞或填充软组织的任意其它组分。

所述水合微凝胶颗粒组合物的流动性质可以通过流变仪测定，其中生物学上的弱(软)材料如眼组织(玻璃体)和脂肪的储能模量(G’)和损耗模量(G”)基本上低于强材料如肌肉、肌腱和软骨的相关值。在这方面，G’值的范围为1Pa至1MPa，G”值的范围为0.1Pa至1MPa，其包括特定水合微凝胶颗粒组合物的性质(例如，独立的微凝胶颗粒和微凝胶颗粒簇，无论是单独的还是含有游离液体或固体组分)。在一些实施方案中，本文所述的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物的储能模量的范围为10Pa至250,000Pa，50Pa至175,000Pa，以及100Pa至100,000Pa。在一些实施方案中，损耗模量的范围为5Pa至100,000Pa，7.5Pa至50Pa，以及10Pa至10,000Pa。所述交联的、水合的、PEG化的微凝胶颗粒在剪切力下显示假塑性，粘度随剪切速率增加而降低。这种假塑性现象基于所述水不溶性水合颗粒本身而非基于含有可溶性大分子的流体介质。另外，本文所述的微凝胶颗粒组合物(包括独立的和成簇的微凝胶颗粒)的流变性能令人惊奇地与其固体样性能相关，而不是更流体样，正如损耗角正切值(G”/G’)小于1所证明的。

还公开了本文所述的组合物用于治疗软组织损害或损伤。可以使用本文所述的任意组合物。特别地，所述组合物可用于注射到软组织中。注射可以是皮内、皮下、口腔、肌内、粘膜下、鼻内、***、颊、鞘内、硬膜外，实质内、眼、视网膜下、齿、肿瘤内、心内、关节内、静脉内、海绵体内、骨内、腹膜内、腹内、筋膜内、器官内(intraogan)和玻璃体内的。在一些实施方案中，本文所述组合物的水不溶性微凝胶颗粒是干粉形式，并且所述用途和/或方法进一步包含在所述注射步骤之前水合所述干粉。在该实施方案中，注射后，所述组合物促进血管生成。

实验

实验部分中使用的材料和缩写如下：

ADSC：脂肪干细胞，原代人腹部成形细胞(abdominoplasty cell)。

AHF：冷沉淀的抗血友病因子，南德克萨斯州血液和组织中心，生产批号W1409114212930。

BSA：牛血清白蛋白，bioWORLD，22070004-1，生产批号V11121401。

氯化钙：西格玛C4901，生产批号110M0105V。

卡波姆：路博润，

SF-2，生产批号0101014502。

I型胶原蛋白：康宁公司，产品354236，大鼠尾肌腱，生产批号3298599。

ECM：细胞外基质，Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤，西格玛E1270，生产批号093M4006V。

结兰胶：斯比凯可，Kelcogel CG-LA，生产批号1E0566A。

瓜尔胶：Making Cosmetics，生产批号1092118。

人纤维蛋白原(FGN)：西格玛F3879，生产批号061M7010、071M7032V、SLBH0223V、SLBK3747V。

人凝血酶：西格玛T7009，生产批号041M7007V、011M7009V、SLBB4394V。

羟乙基纤维素，阳离子型：陶氏化学公司，UCare^TM Polymer JR-30M，生产批号XL2850GRXA。

羟丙基甲基纤维素：Amerchol Methocel K15M，生产批号WF15012N01。

颗粒化羊膜：BioD,LLC,BioDRestore^TM，组织ID R0925131。

NaOH：氢氧化钠，Puritan Products 7705，生产批号011043。

针头：18G，BD 305195，生产批号2089215。

PBS：磷酸盐缓冲盐水：pH 7.8-8.0(不含钙和镁)，INCELL ZSOL：F，生产批号A2014SEP10-01、Z2015JAN05-01；或西格玛-奥德里奇D8537，生产批号RNBB9451、RNBC1143、RNBC8400。

PHMB：聚(六亚甲基双胍)盐酸盐：奥麟化工，Cosmocil CQ^TM，生产批号9PL211280，1337261或Lotioncrafter Biguanide 20，生产批号14RC169159-6380。

聚(乙二醇)二丙烯酸酯：分子量575，西格玛-奥德里奇437441，生产批号MKBN7800V。

聚(乙烯醇)：杜邦，

生产批号910113。

PSG-(PEO)₄：季戊四醇四(琥珀酰亚胺基氧基戊二酰基)聚氧乙烯，4臂(四官能团)，NOF美国公司，

PTE-050GS(分子量5,000)，生产批号M8N526；PTE-100GS(分子量10,000)，生产批号M9D105；和PTE200-GS(分子量2000)，生产批号M119691。

普鲁兰多糖：林原公司，生产批号1G3021。

SG-PEG-SG(PEG)：NOF美国公司，α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯，(双官能团)，NOF美国公司；

DE-034GS(分子量3400)，生产批号M83541；DE-100GS(分子量10,000)，生产批号M107543；DE-200GS(分子量20,000)，生产批号M115700。

SG-PEG：α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-甲氧基聚氧乙烯(单官能团)，NOF美国公司,

ME-050GS(分子量5,000)，生产批号M10N587。

黄原胶：鲍勃红磨坊，生产批号143454。

初始水凝胶形成方案：

实施例1：聚(乙二醇)-人纤维蛋白原(PEG-FGN)

以制备摩尔比为20:1的PEG-FGN为例，对各种摩尔比的PEG化的纤维蛋白原(PEG-纤维蛋白原，PEG-FGN)的制备进行说明。将纤维蛋白原(FGN，分子量340kDa)以80mg/mL的浓度溶解于无菌pH 7.8-8.0的PBS(不含钙和镁)中。纤维蛋白原在室温或37℃下溶解。在室温(～22℃)下，将SG-PEG-SG(分子量3.4kDa)以16mg/mL的浓度溶解于无菌pH 7.8-8.0的PBS(不含钙和镁)中。所有测试的大量纤维蛋白原表现相似。用0.20-0.22μm过滤器无菌过滤SG-PEG-SG的反应性双官能团PEG溶液。然后将SG-PEG-SG与FGN以1：1的v/v(等体积)混合。在室温或37℃下，在5-30分钟内发生胶凝化。

还制备了摩尔比为10:1、35:1或50:1的PEG-FGN。已经确定，PEG化程度较低会导致纤维蛋白原掺入的浓度较高(在支架基质中更具生物活性)，增加制造的容易性(更多的PEG保留更多的水，使得冻干更困难，并使得以小颗粒研磨非常困难)，并且与35：1和50：1的PEG-FGN支架相比，在20：1的PEG-FGN支架上的脂肪干细胞(ADSC)在体内优先粘附和增殖。

还使用如下PEG化试剂制备了摩尔比为20:1的PEG-FGN：

PEG二丙烯酸酯(双官能团)；

SG-PEG-SG，Sunbright DE-034GS(分子量3400)，DE-100GS(分子量10,000)，DE-200GS(分子量20,000)(双官能团)；

SG-PEG：

ME-050GS(分子量5,000)(单官能团)；

PSG-(PEO)₄，PTE-050GS(分子量5,000)，Sunbright PTE-100GS(分子量10,000)，PTE200-GS(分子量20,000)(四官能团)；

其中

DE：NHS-OCO(CH₂)₃COO-PEG-CO(CH₂)₃COO-NHS；

ME：PEG-CO(CH₂)₃COO-NHS；

PTE：PEG-(CO(CH₂)₃COO-NHS)₄；以及

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺。

增加PEG化试剂的分子量会产生更坚固的凝胶。与产生流体的单官能团PEG相比，双官能团PEG产生刚性凝胶。当摩尔比例相同时，增加PEG的官能团会产生更坚固的凝胶。在所研究的反应条件下，PEG二丙烯酸酯不形成凝胶。

实施例2：PEG-FGN-PHMB

通过添加量为0至1000ppm的PHMB来制备PEG-FGN水凝胶(20:1摩尔比)。以掺入100ppm(在该浓度中微凝胶以50mg/mL再水合)的PHMB为例，对PEG-FGN-PHMB复合物的制备进行说明，类似地制备了其他浓度的PHMB。

用不含钙和镁的无菌的pH 7.8-8.0的PBS稀释PHMB。待添加的PHMB溶液的计算量基于最终再水合粉末(粉末产品以50mg/mL再水合)中含0.01％w/w PHMB。这需要向初始水凝胶中，每100mL总凝胶体积掺入48μL PHMB溶液。对于100mL批次，向50mL磷酸盐缓冲盐水中添加0.048mL(48μL)PHMB(Cosmocil CQ)。将PEG化试剂以16mg/mL溶解在该稀释的PHMB溶液中。通过添加50mL 80mg/mL的纤维蛋白原溶液引发凝胶形成。

实施例3：制备PEG-FGN-聚合物

通过掺入以下水溶性聚合物来制备PEG-FGN-水溶性聚合物水凝胶(PEG与FGN的摩尔比20:1)：27.6mg/mL的卡波姆，27.6mg/mL的普鲁兰多糖，20.7mg/mL的瓜尔胶，3.4mg/mL的羟乙基纤维素和1.4mg/mL的I型胶原蛋白。卡波姆是一种基于丙烯酸的交联的合成聚合物；普鲁兰多糖和瓜耳胶是天然多糖；羟乙基纤维素是改性多糖；且I型胶原蛋白是一种蛋白，且是人体最丰富的胶原蛋白。在PEG化之前添加所述水溶性聚合物。

实施例4：PEG-纤维蛋白

制备了摩尔比为10:1至50:1的PEG-纤维蛋白凝胶。PEG化增加超过20：1摩尔比阻碍了凝血酶的活性和纤维蛋白凝胶的形成，且需要更长的反应时间。向PEG-纤维蛋白原中添加凝血酶，以使纤维蛋白原与浓度为2.5-12.5U/mL凝胶的凝血酶交联。

以10:1摩尔比的PEG-纤维蛋白与2.5U/mL的凝血酶为例，对PEG-纤维蛋白凝胶的制备进行说明。将纤维蛋白原(分子量340kDa)以80mg/mL的浓度溶于无菌pH 7.8-8.0的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁)中。在室温下，将SG-PEG-SG(分子量3.4kDa)以8mg/mL溶于无菌pH 7.8-8.0的PBS(不含钙和镁)中。用0.20-0.22μm过滤器无菌过滤反应性PEG溶液。以1：1的v/v(等体积)，将PEG与FGN混合并反应5分钟(PEG化的纤维蛋白原溶液)。将凝血酶(在去离子水中浓度100U/mL)在40mM氯化钙中稀释至5U/mL。在氯化钙中，将1份PEG化的纤维蛋白原溶液与1份PBS和2份5U/mL的凝血酶混合，形成了PEG-纤维蛋白凝胶。在室温或37℃下，在5分钟内发生胶凝化。

根据上述操作，还用浓度为2.5-12.5U/mL凝胶的凝血酶制备了摩尔比为10:1、35:1或50:1的PEG-纤维蛋白。在此之前，已报道了PEG与纤维蛋白原(通过凝血酶转化为纤维蛋白)的摩尔比为1：1、2.5：1、5：1、7.5：1、10：1、15：1、20：1、100：1的PEG-纤维蛋白整体式水凝胶(Zhang等人，Tissue Engineering,12(1),9-19,2006)。

实施例5：PEG-纤维蛋白-聚合物

用以下水溶性聚合物(以2mg/mL的浓度掺入)来制备PEG化的纤维蛋白(10:1)水凝胶：黄原胶、结兰胶、瓜尔胶、阳离子羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚(乙烯醇)。黄原胶、结兰胶和瓜尔胶是天然存在的多糖，阳离子羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素是改性多糖，且聚(乙烯醇)是合成的基于乙烯的聚合物。

还通过掺入以下聚合物来制备PEG化的纤维蛋白(10:1)水凝胶：20mg/mL的卡波姆、20mg/mL的普鲁兰多糖、15mg/mL的瓜尔胶、2.5mg/mL的羟乙基纤维素和1mg/mL的I型胶原蛋白。

PEG：纤维蛋白：聚合物的水凝胶制备如下：通过将摩尔比为10:1的PEG化试剂和纤维蛋白原混合，来使纤维蛋白原PEG化。PEG化5分钟后，向溶液中添加水溶性聚合物，然后添加凝血酶以引发交联。

实施例6：PEG-蛋白

使用与实施例1类似的操作，以20:1的摩尔比使以下蛋白PEG化：纤维蛋白原、牛血清白蛋白、I型胶原蛋白、冷沉淀的抗血友病因子(AHF)和细胞外基质。当用1M NaOH将pH增加至>7.0时，PEG化引发凝胶形成。对于体内应用和蛋白稳定性，可以使用的pH范围为6.6至8.0。通过快速机械搅拌，使水合的PEG化的凝胶转化成微凝胶颗粒。将水合微凝胶颗粒装载到注射器中并使含PBS的微凝胶注射穿过18号针头，在所述18号针头中随剪切力去除而形成微凝胶簇，由此证明了所得微凝胶颗粒的假塑性。

可选地，以20:1的摩尔比使以下蛋白PEG化：牛血清白蛋白、I型胶原蛋白和细胞外基质。使水凝胶干燥、再水合并机械混合以形成微凝胶。将所得水合微凝胶颗粒装载到注射器中并使含PBS的微凝胶颗粒注射穿过18号针头，在所述18号针头中随剪切力去除而形成微凝胶簇，由此证明了微凝胶的假塑性。

微凝胶颗粒形成方案

将PEG化的基于纤维蛋白原和纤维蛋白的水凝胶冻干24-96小时。然后使用杵臼或Spex SamplePrep 6870CryoMill(Metuchen，NJ)研磨冻干的凝胶。然后使用Tyler或Retsch不锈钢试验筛将干燥微凝胶粉末过筛至粒度(<250μm，<150μm，<106μm或<75μm)。用PBS(含有和不含钙和镁)、生理盐水(0.9％氯化钠)、去离子水、细胞培养基(含有和不含细胞)或颗粒化羊膜再水合干燥微凝胶粉末。

图1显示了微凝胶的制备流程，其利用了PEG：纤维蛋白摩尔含量为10:1的交联的PEG化的纤维蛋白，其中将初始整体式凝胶(凝胶状PEG-纤维蛋白)冻干(冻干的PEG-纤维蛋白)，然后通过冷冻研磨研磨成粉末(经研磨的PEG-纤维蛋白)，并再水合成微凝胶颗粒(再水合的PEG-纤维蛋白)。所有微凝胶粉末均通过该操作制备。

PEG-纤维蛋白原和PEG-纤维蛋白微凝胶的膨胀性能

表1中呈现了20：1的PEG-FGN和10：1的PEG-纤维蛋白的微凝胶颗粒的溶胀性能。溶胀基于干燥微凝胶颗粒的水吸收来确定，即水合微凝胶重量/干微凝胶重量。与50:1配制的PEG-FGN和PEG-纤维蛋白相比，纤维蛋白原制剂比纤维蛋白制剂更亲水。这可能与PEG-纤维蛋白中的额外交联有关，因为纤维蛋白原被凝血酶转化成了纤维蛋白。

当向10:1的PEG-纤维蛋白和20:1的PEG-纤维蛋白原微凝胶颗粒中掺入水溶性聚合物时，吸水率增加。这些水溶性亲水性聚合物的掺入增加了微凝胶颗粒网络的亲水性，增加了溶胀度。所检测的亲水性聚合物包括PHMB、卡波姆、普鲁兰多糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素(HEC)和I型胶原蛋白。PEG-纤维蛋白凝胶含有20mg/mL的卡波姆、20mg/mL的普鲁兰多糖、15mg/mL的瓜尔胶，2.5mg/mL的羟乙基纤维素和1mg/mL的I型胶原蛋白。PEG-FGN凝胶用27.6mg/mL的卡波姆、27.6mg/mL的普鲁兰多糖、20.7mg/mL的瓜尔胶、3.4mg/mL的羟乙基纤维素和1.4mg/mL的I型胶原蛋白制备。

表1.PEG-纤维蛋白、PEG-纤维蛋白原的溶胀和水合％

流变性能

经测定，所述水合微凝胶颗粒具有剪切稀化性能。这种出乎意料的性质使得它们特别地可便于用于在具***点注射或放置流体，并且使得所述微凝胶颗粒组合物在注射后立即充当粘弹性固体以保持形状并适应天然周围组织。使用流变仪(Anton-Paar MCR 101或Anton-Paar MCR 302，Ashland，VA)对微凝胶颗粒组合物的假塑性性能和粘弹性性质进行了测定。使用通过冷冻研磨(或杵臼)制备的20:1摩尔比的再水合PEG-纤维蛋白原和10:1的再水合PEG-纤维蛋白微凝胶颗粒为例，图2所示的粘度-剪切速率表明，交联的PEG化的蛋白微凝胶颗粒组合物迅速剪切稀化，如这些图的斜率绝对值所阐明的，其中PEG-纤维蛋白原的斜率为-0.90，PEG-纤维蛋白为-0.98，其中斜率接近-1代表完美的剪切稀化材料。

以20∶1的PEG-纤维蛋白原为例，在反复暴露于1％应力后，机械性质完全恢复，粘弹性无损失(图3)。

另外，PEG-纤维蛋白原和PEG-纤维蛋白水合微凝胶颗粒组合物均作为储能模量大于损耗模量的粘弹性固体(图4，G’＞G”或损耗角正切＜1)(表2)。

表2.在1 1/sec的频率下，10∶1的PEG-纤维蛋白、PEG-纤维蛋白原和PEG-FGN-PHMB的损耗角正切

制剂	损耗角正切
		PEG-纤维蛋白10∶1	0.18
PEG-FGN 20∶1	0.29
		PEG-FGN 35∶1	0.22
PEG-FGN 50∶1	0.19
		PEG-FGN-PHMB 1000ppm	0.21

通过杵臼研磨和通过冷冻研磨的50∶1的PEG-纤维蛋白原微凝胶的剪切稀化性能的粘度-剪切速率的图示于图5。通过杵臼获得的干燥微凝胶颗粒更扁平且更薄片样，而通过冷冻研磨获得的干燥颗粒更球形化。微凝胶在磷酸盐缓冲盐水中以300mg/mL再水合。用杵臼时，曲线的斜率为0.86，冷冻研磨时为0.84。冷冻研磨的颗粒稍微更加粘稠，可能是由于粒度分布减小和平均粒度降低的原因。

人脂肪干细胞

从人腹部脂肪中分离人脂肪干细胞(ADSC)，并在含有生长补充剂和1％青霉素-链霉素的MesenPRO RS^TM培养基(Life Technologies)中传代培养。在12孔板(n＝3)上，在细胞培养池(透明PET膜，尺寸＝8.0μm，BD Biosciences)中，使10∶1、20∶1和50∶1(15mg)的PEG-FGN和PEG-纤维蛋白的粉末状样品与400μL的2.5×10⁵细胞/mL悬浮液结合。向池中添加另外600μL培养基并另外添加1mL到外部，得到2mL总培养基体积。每日更换培养基，并根据制造商的方案，使用CellTiter

Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)(Promega)检查细胞生长。然后，细胞用钙黄绿素AM(4mM)染色，活细胞染色45分钟并用10％***固定。分别使用数码相机和共焦显微镜获取每个样品的宏观和荧光图像。

图6显示，从第1天到第4天微凝胶上的干细胞数量显著增加。从第4天至第7天，20:1和50:1制剂上的细胞继续增殖。图7中所示的活细胞染色显示，ADSC可在所有测试的微凝胶颗粒组合物上存活。细胞似乎要在20：1的PEG-纤维蛋白原和50：1的PEG-纤维蛋白原微凝胶上形成网络。

因此，微凝胶颗粒组合物的显著应用是其在注射或被流体移动之后重新形成微凝胶颗粒簇的能力。在图8中示出了在大鼠体外皮下注射的20：1的PEG化的纤维蛋白原微凝胶，其中微凝胶颗粒在注射部位形成凝结的固体并保持其形状。

抗微生物性质

为了赋予PEG化的微凝胶颗粒组合物抗微生物性质，将PHMB掺入与纤维蛋白原的PEG化反应中。图9显示了与20:1的PEG-FGN相比，20:1的PEG-FGN-PHMB(PHMB浓度为1,000ppm)三元复合物的假塑性。PEG-FGN的斜率值为-1.01，PEG-FGN-PHMB为-1.06，斜率接近-1代表完美的剪切稀化材料。

图10显示了含有和不含PHMB的20:1的PEG-FGN凝胶的储能和损耗模量的模量-频率图。角频率为1sec^-1时，PEG-FGN的损耗角正切为0.25，PEG-FGN-PHMB的损耗角正切为0.21。模量数据表明，与PEG-FGN相比，PHMB的添加增加了PEG-FGN-PHMB复合物的固体样性能，表明PHMB共价掺入到了PEG化反应中。

在共价结合PHMB(PHMB被包括在纤维蛋白原的PEG化中)和未结合PHMB(PHMB被随后添加到PGE-纤维蛋白原的形成中)的抑制区(ZOI)研究中的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，ATCC#700787)的杀生活性的抗微生物研究中，证实了PHMB共价结合到PEG化的纤维蛋白原复合物中，形成共价结合的PEG-FGN-PHMB三元复合物。未结合PHMB的PEG-纤维蛋白原复合物的ZOI<1.0mm，而共价结合PHMB的三元复合物的ZOI无可测量ZOI，仅在微凝胶粉末下有抑制。据估计，由于游离PHMB(其可能是离子键结合，非共价结合)向纤维蛋白原上阴离子位点迁移，未结合的阳离子PHMB具有显著较大的ZOI，而共价键合的PHMB则需要微生物与微凝胶颗粒直接接触。

体内皮下注射

对单独的和结合了自体干细胞(大鼠ADSC)或BioDRestore^TM颗粒化羊膜的PEG-FGN(20：1摩尔)进行了评估。用21号针将用氧乙烯灭菌的微凝胶注射进入大鼠背侧皮下区域中。对五个测试组进行两次评估：大鼠ADSC、BioDRestore^TM、PEG-FGN、PEG-FGN与大鼠ADSC、以及PEG-FGN与BioDRestore^TM。结果表明，所述微胶凝剂易于注射，形成凝结的固体，并在第7天和第14天时保留在注射部位。

在第7和14天，使用苏木精&伊红(H&E)对固定组织切片进行染色，以观察细胞、胶原蛋白和组织重塑。H&E染色显示微凝胶的宿主细胞重塑具有最小的炎症反应。微凝胶的重塑在第14天更为明显，特别是与ADSC或BioDRestore^TM结合时。

平滑肌肌动蛋白(SMA)染色(一种用于周细胞的指示)显示，在第7天和第14天微凝胶内有血管浸润。向微凝胶体系中掺入同种异体ADSC或颗粒化羊膜产品(BioD)会增强血管形成。图11显示了在微凝胶中心的血管浸润。使用整体式水凝胶体系，如果有血管形成发生，其很少到达水凝胶的中心。

此外，注射微凝胶颗粒体系会增强细胞的存活能力，这似乎可以使细胞免遭剪切应力的影响。用CM-diI标记的大鼠ADSC(2.0×10⁵细胞/mL)注射的PEG-FGN微凝胶组合物在第7天和第14天时保留在注射位点。图12显示了在体内7天和14天后，微凝胶中的干细胞的存活能力。血管生成的DAPI核染色和SMA染色显示，即使在体内14天后，微凝胶中的细胞仍连接、扩散、存活并促进血管生成。

具体实施方案

第一个具体实施方案涉及一种组合物，其包含：水不溶性微凝胶颗粒，当水合时其具有假塑性，其中，所述微凝胶颗粒包含交联的PEG化的蛋白、交联的PEG化的基于蛋白的生物大分子，其中，当水合时，所述微凝胶颗粒的簇的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下其重新形成微凝胶簇，其中，当水合时，所述水合微凝胶颗粒具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值。

第二个具体实施方案涉及第一个具体实施方案，其中PEG化试剂与蛋白和基于蛋白的生物大分子的摩尔比为1:1至100:1。

第三个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其中所述微凝胶颗粒是水合的。

第四个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其中所述组合物的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下形成微凝胶簇，其中，所述组合物具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值。

第五个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其中所述蛋白和基于蛋白的生物大分子选自由细胞外基质、糖蛋白、结构蛋白、纤维蛋白、酶、蛋白聚糖、天然多肽、合成多肽、球状蛋白、膜蛋白、血浆蛋白、肽、寡肽、抗微生物肽、肽激素、伴侣蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、凝血蛋白、免疫***蛋白、离子通道蛋白、细胞粘附蛋白、神经肽、核蛋白、硬蛋白、色素蛋白、缀合蛋白、蛋白-蛋白复合物、蛋白-多糖复合物、蛋白-脂质复合物、运动蛋白、黏蛋白、磷蛋白、收缩蛋白、转运蛋白、信号蛋白、调节蛋白、生长因子蛋白、感觉蛋白、防御蛋白、储存蛋白、受体蛋白、抗体、重组蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白、明胶、角蛋白、层粘连蛋白及其组合构成的组。

第六个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其中所述蛋白PEG化交联剂选自由α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯(SG-PEG-SG)、α-氨基丙基-ω-氨基丙氧基聚氧乙烯、α-氨基丙基-ω-羧基戊氧基聚氧乙烯、α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]乙基}聚乙二醇、α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基ω-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙氧基聚氧乙烯、季戊四醇四(氨基丙基)聚氧乙烯，α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-(琥珀酰亚胺基氧羧基)聚氧乙烯、季戊四醇四(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯、六聚甘油八(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、六聚甘油八(4-硝基苯氧羰基)聚氧乙烯、4-臂聚(乙二醇)四丙烯酸酯、4-臂琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、双(聚氧乙烯双[咪唑基羰基])、O-(3-羧丙基)-O′-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双(2-叠氮基乙基)聚乙二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二环氧甘油醚、聚(乙二醇)二(对-硝基苯基碳酸酯)、聚(乙二醇)二(乙烯砜)、聚(乙二醇)二(丙醛)、聚(乙二醇)二(苯并***基碳酸酯)及其组合构成的组。

第七个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其中所述组合物的储能模量值，所述水合的水不溶性微凝胶颗粒的储能模量值或两者的储能模量值在10Pa至250,000Pa之间且所述损耗模量值在5Pa至100,000Pa之间。

第八个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其进一步包含抗细菌剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂、抗生素、单酰基甘油，单烷基二醇、双(二胍)及其盐、聚(六亚甲基双胍)及其盐、甘油单月桂酸酯、氯己定、氯己定二葡萄糖酸盐、氯己定双乙酸盐、阿来西定、盐酸阿来西定、银盐、苯扎氯铵、苄索氯铵、硫酸庆大霉素、碘、聚维酮碘、淀粉碘、硫酸新霉素、多粘菌素B、杆菌肽、四环素、克林霉素、庆大霉素、呋喃西林、醋酸磺胺米隆、磺胺嘧啶银、盐酸特比萘芬、硝酸咪康唑、酮康唑、克霉唑、伊曲康唑、甲硝唑、抗微生物肽、聚季铵盐-1、聚季铵盐-6、聚季铵盐-10、阳离子瓜尔胶、壳聚糖的水溶性衍生物、其盐及其组合。

第九个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其进一步包含浓度为0.01重量％至25重量％的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物选自由聚(乙二醇)、聚(氧乙烯)、聚(乙烯醇)和共聚物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)和共聚物、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、瓜尔胶、羟乙基瓜尔胶、羟丙基瓜尔胶、明胶、白蛋白、羟丙基甲基瓜尔胶、羧甲基瓜尔胶、羧甲基壳聚糖、刺槐豆胶、角叉菜胶、黄原胶、结兰胶、普鲁兰多糖、右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、芦荟凝胶、硬葡聚糖、裂裥多糖、***树胶、罗望子胶、聚(甲基乙烯基醚)、氧乙烯-环氧丙烷-氧乙烯嵌段共聚物、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、右旋糖酐、卡波姆及其盐、聚(丙烯酸)及其盐、聚(甲基丙烯酸)及其盐、聚(乙烯-丙烯酸)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基磷酸)盐、聚(乙烯基磺酸)盐、聚(2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸)钠、(多种)聚丙烯酰胺、聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(N-乙烯基乙酰胺)、聚(N-乙烯基甲酰胺)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甘油酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚(N-乙烯基己内酰胺)，后两者在低于其低临界溶解温度下水合，聚季铵盐-1、聚季铵盐-6、聚季铵盐-10、紫罗烯聚合物、阳离子瓜尔胶、吡啶鎓(pyridinium)聚合物、咪唑鎓(imidazolium)聚合物、二烯丙基二甲基铵聚合物、聚(L-赖氨酸)、丙烯酰基-、甲基丙烯酰基-和苯乙烯基-三甲基铵聚合物、丙烯酰胺基-和甲基丙烯酰胺基-三甲基铵聚合物和抗微生物肽构成的组。

第十个具体实施方案涉及第九个具体实施方案，其中所述组合物是干燥或水合膜的形式。

第十一个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其进一步包含一种生物组分，所述生物组分选自由细胞；干细胞；颗粒化羊膜组织；胎盘组织；切碎的组织，包括切碎的皮肤组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脂肪组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、膀胱组织、肠道组织、心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织、和声带组织；微粒化组织和微粒化脱细胞组织，包括皮肤组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脂肪组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、膀胱组织、肠道组织、心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织、声带组织；合成或天然衍生的细胞外基质组分，包括胶原蛋白、糖胺聚糖、纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白；羟基磷灰石；颗粒状交联牛肌腱胶原蛋白和糖胺聚糖；蜂蜜；多糖；可生物降解的聚合物，包括聚乙交酯、聚丙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、聚二噁烷酮、聚己内酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚氨基甲酸酯、聚(酯酰胺)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚磷腈和细菌聚酯；及其组合构成的组。

第十二个具体实施方案涉及第十一个具体实施方案，其中所述干细胞选自由成体干细胞、胚胎干细胞、羊膜干细胞、诱导性多能干细胞、胎体干细胞、组织干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞、人脐带血干细胞、血液祖细胞、间充质干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、内皮祖细胞、上皮干细胞、表皮干细胞、心脏干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、角膜缘干细胞、围产期干细胞、卫星细胞、侧群细胞、多能干细胞、全能干细胞、单能干细胞及其混合物构成的组。

第十三个具体实施方案涉及第十一个具体实施方案，其中所述细胞选自由成纤维细胞、角质形成细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、背根神经节、脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞、纤维软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、成肌细胞、肝细胞、肌腱细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞、基质细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、周细胞、血小板及其混合物构成的组。

第十四个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任一个，其进一步包含生物活性剂，所述生物活性剂选自由纳米粒、微粒、防腐剂、抗感染剂、抗微生物剂、杀孢子剂和抗寄生虫剂、周围神经病变剂、神经性剂、趋化剂、镇痛剂、抗炎剂、抗过敏剂、抗高血压剂、丝裂霉素型抗生素、多烯抗真菌剂、止汗剂、减充血剂、抗晕动病剂(anti-kinetosisagents)、中枢神经***剂、伤口愈合剂、抗VEGF剂、抗肿瘤剂、腐蚀剂、抗牛皮癣剂、抗糖尿病药、抗关节炎药、抗瘙痒剂(anti-itching agents)、止痒剂(antipruritic agents)、麻醉剂、抗疟剂、皮肤病药剂、抗心律失常剂、抗惊厥药、止吐剂、抗风湿剂、抗雄性激素剂、蒽环类药物、抑烟剂、抗痤疮剂、抗胆碱能剂、抗老化剂、抗组胺剂、抗寄生虫剂、止血剂、血管收缩剂、血管舒张剂、血栓形成剂、抗凝血剂、心血管药物、心绞痛药、***功能障碍药物、性激素、生长激素、异黄酮、整联蛋白结合序列、生物活性配体、细胞贴附介质、免疫调节剂、肿瘤坏死因子α、抗癌剂、抗肿瘤剂、抗抑郁剂、镇咳剂、抗肿瘤剂、麻醉拮抗剂、抗高胆固醇血症药、细胞凋亡诱导剂、避孕剂、免晒美黑剂、润滑剂、α-羟基酸、麦卢卡蜂蜜、局部维他命A群、激素、肿瘤特异性抗体、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、抗VEGF RNA适体、核酸、DNA、DNA片段、DNA质粒、Si-RNA、转染剂、维生素、精油、脂质体、银纳米粒、金纳米粒、含药纳米粒、基于白蛋白的纳米粒、含壳聚糖纳米粒、基于多糖的纳米粒、树枝状纳米粒、磷脂纳米粒、氧化铁纳米粒、铋纳米粒、钆纳米粒、金属纳米粒、陶瓷纳米粒、基于二氧化硅的纳米粒、基于病毒的纳米粒、病毒样纳米粒、含抗生素纳米粒、含一氧化氮纳米粒、纳米壳、纳米棒、聚合物胶束、银盐、锌盐、量子点纳米粒、基于聚合物的微粒、基于聚合物的微球、含药微粒、含药微球、含抗生素微粒、含抗生素微球、抗微生物微粒、抗微生物微球、水杨酸、过氧化苯甲酰、5-氟尿嘧啶、烟酸、***油、可乐定、***、睾酮、尼古丁、抗运动病药、东莨菪碱、芬太尼、双氯芬酸、丁丙诺啡、布比卡因、酮洛芬、阿片样物质、***素、酶、酶抑制剂、寡肽、环肽、多肽、蛋白、前药、蛋白酶抑制剂、细胞因子、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、副交感神经抑制剂、螯合剂、毛发生长剂、脂质、糖脂、糖蛋白、内分泌激素、生长激素、生长因子、分化因子、热休克蛋白、免疫应答调节剂、糖类、多糖、胰岛素和胰岛素衍生物、类固醇、皮质类固醇、非甾体抗炎药物，以其盐形式或其中性形式，及其组合构成的组。

第十五个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任意一个，其中所述水不溶性微凝胶颗粒是干粉形式。

第十六个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任意一个，其进一步包含水性介质，所述水性介质选自水、等渗盐水、平衡盐溶液、缓冲溶液、林格氏溶液、细胞培养基、干细胞培养基、血清、血浆、羊水、华通氏胶、营养液、防腐溶液或其组合。

第十七个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任意一个，其进一步包含溶液、悬浮液、乳膏剂、洗剂、凝胶、糊剂、乳液、香脂、喷雾剂、泡沫剂、气雾剂或其他制剂。

第十八个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任意一个，其中所述蛋白选自由纤维蛋白原、纤维蛋白、细胞外基质、血浆蛋白和胶原蛋白构成的组；且所述PEG化试剂是α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯(SG-PEG-SG)。

第十九个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任意一个，其中所述蛋白选自纤维蛋白原和纤维蛋白，并且所述微凝胶颗粒在哺乳动物体内诱导血管生成。

第二十个具体实施方案涉及前述具体实施方案中的任意一个，其中所述蛋白选自纤维蛋白原和纤维蛋白，所述PEG化试剂是α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯(SG-PEG-SG)，且所述活性生物剂是聚(六亚甲基双胍)及其盐。

第二十一个具体实施方案涉及一种水不溶性微凝胶颗粒的制备方法，其包含：提供一种生物原材料，所述生物原材料包含蛋白、基于蛋白的生物大分子或两者的组合；使所述生物原材料与PEG化试剂反应；通过交联所述生物原材料与所述PEG化试剂来PEG化所述生物原材料，以形成双官能团至多官能团PEG化，在水合或脱水条件下，研磨或剪切所述PEG化的生物原材料以产生众多微凝胶颗粒，其中所述微凝胶颗粒在水溶液中是假塑性的，其中所述水合微凝胶颗粒的溶液的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下重新形成微凝胶簇，其中PEG化试剂与生物原材料的摩尔比为1:1至100:1，以及其中所述水合微凝胶颗粒具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值。

第二十二个具体实施方案涉及一种治疗软组织损害或损伤的方法，其包含：提供一种根据第一个具体实施方案的组合物，以及将所述组合物注射到软组织中，其中所述注射是皮内、皮下、口腔、肌内、粘膜下、鼻内、***、颊、鞘内、硬膜外，实质内、眼、视网膜下、齿、肿瘤内、心内、关节内、静脉内、海绵体内、骨内、腹膜内、腹内、筋膜内、器官内(intraogan)和玻璃体内的。

第二十三个具体实施方案涉及第二十二个具体实施方案，其中权利要求1所述的水不溶性微凝胶颗粒为干粉形式，并且所述方法进一步包含在所述注射步骤之前水合所述干粉。

第二十四个具体实施方案涉及第二十二个具体实施方案或第二十三个具体实施方案，其中，在注射后，所述组合物促进血管生成。

第二十五个具体实施方案涉及一种试剂盒，其包含水不溶性微凝胶颗粒，当水合时，所述水不溶性微凝胶颗粒是假塑性的，其中所述微凝胶颗粒包含交联的PEG化的蛋白、交联的PEG化的基于蛋白的生物大分子；其中，当水合时，所述微凝胶颗粒的簇(bed)的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下重新形成微凝胶簇，其中PEG化试剂与基于蛋白的生物大分子的摩尔比为1:1至100:1；其中，当水合时，所述水合微凝胶颗粒具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值；以及用于将所述水不溶性微凝胶颗粒放置在哺乳动物体内或其上的说明书。

第二十六个具体实施方案涉及第二十五个具体实施方案，其中所述水不溶性微凝胶颗粒为干粉形式；其中所述干燥微凝胶颗粒的尺寸范围为1至250μm；以及其中所述说明书包括水合所述干粉形式的水不溶性微凝胶颗粒。

第二十七个具体实施方案涉及第二十五个或二十六个具体实施方案，其中根据使用说明，所述水合微凝胶与细胞混合，以及其中将所述水合细胞-微凝胶组合物放置在哺乳动物体内或其上。

第二十八个具体实施方案涉及第二十五个、第二十六个或第二十七个具体实施方案，其进一步包含抗微生物剂；以及根据使用说明，所述说明包括将包含所述水不溶性微凝胶颗粒和抗微生物剂的治疗组合物施用于哺乳动物体内或其上。

第二十九个具体实施方案涉及第二十五、第二十六个、第二十七个或第二十八个具体实施方案，其中当放置在哺乳动物体内或其上时，所述微凝胶促进血管生成。

虽然上述说明书包含许多细节，但其不应被解释为对本发明范围的限制，而是其优选实施方案的实例。可能有许多其他变形。因此，本发明的范围不应由所示实施方案来确定，而是由所附权利要求及其法律等同内容来确定。

Claims

1.一种组合物，其包含：

水不溶性微凝胶颗粒，当水合时其是假塑性的，其中，所述微凝胶颗粒包含交联的PEG化的蛋白、交联的PEG化的基于蛋白的生物大分子，

其中，当水合时，所述组合物是可注射的，由此所述微凝胶颗粒的簇的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下其重新形成微凝胶簇，

其中，当水合时，所述水合微凝胶颗粒具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值，其中PEG化试剂与蛋白和基于蛋白的生物大分子的摩尔比为1:1至100:1，其中所述微凝胶颗粒具有选自由椭圆形、角形、或不规则形状组成的组的形状；

其中所述蛋白和基于蛋白的生物大分子选自由细胞外基质、糖蛋白、结构蛋白、纤维蛋白、酶、蛋白聚糖、球状蛋白、膜蛋白、血浆蛋白、肽激素、伴侣蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、凝血蛋白、免疫***蛋白、离子通道蛋白、细胞粘附蛋白、核蛋白、硬蛋白、色素蛋白、缀合蛋白、蛋白-蛋白复合物、蛋白-多糖复合物、蛋白-脂质复合物、运动蛋白、黏蛋白、磷蛋白、收缩蛋白、转运蛋白、信号蛋白、调节蛋白、生长因子蛋白、感觉蛋白、防御蛋白、储存蛋白、受体蛋白、抗体、重组蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白、明胶、角蛋白、层粘连蛋白及其组合构成的组，

其中所述蛋白PEG化交联剂选自由α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯、α-氨基丙基-ω-氨基丙氧基聚氧乙烯、α-氨基丙基-ω-羧基戊氧基聚氧乙烯、α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]乙基}聚乙二醇、α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基ω-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙氧基聚氧乙烯、季戊四醇四(氨基丙基)聚氧乙烯、α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-(琥珀酰亚胺基氧羧基)聚氧乙烯、季戊四醇四(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯、六聚甘油八(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、六聚甘油八(4-硝基苯氧羰基)聚氧乙烯、4-臂聚(乙二醇)四丙烯酸酯、4-臂琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、双(聚氧乙烯双[咪唑基羰基])、O-(3-羧丙基)-O′-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双(2-叠氮基乙基)聚乙二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二环氧甘油醚、聚(乙二醇)二(对-硝基苯基碳酸酯)、聚(乙二醇)二(乙烯砜)、聚(乙二醇)二(丙醛)、聚(乙二醇)二(苯并***基碳酸酯)及其组合构成的组。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽激素选自天然多肽、合成多肽、寡肽、抗微生物肽、神经肽；所述酶是凝血酶。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述微凝胶颗粒是水合的。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下形成微凝胶簇，

其中所述组合物具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的所述储能模量值、水合的所述水不溶性微凝胶颗粒的所述储能模量值或两者的所述储能模量值在10Pa至250,000Pa之间并且所述损耗模量值在5Pa至100,000Pa之间。

6.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含抗细菌剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂、抗生素、抗微生物肽、其盐及其组合。

7.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含单酰基甘油、单烷基乙二醇、双(二胍)及其盐、聚(六亚甲基双胍)及其盐、甘油单月桂酸酯、氯己定、氯己定二葡萄糖酸盐、氯己定双乙酸盐、阿来西定、盐酸阿来西定、银盐、苯扎氯铵、苄索氯铵、硫酸庆大霉素、碘、聚维酮碘、淀粉碘、硫酸新霉素、多粘菌素B、杆菌肽、四环素、克林霉素、庆大霉素、呋喃西林、醋酸磺胺米隆、磺胺嘧啶银、盐酸特比萘芬、硝酸咪康唑、酮康唑、克霉唑、伊曲康唑、甲硝唑、聚季铵盐-1、聚季铵盐-6、聚季铵盐-10、阳离子瓜尔胶、壳聚糖的水溶性衍生物、及其组合。

8.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含浓度为0.01重量％至25重量％的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物选自由聚(乙二醇)、聚(氧乙烯)、聚(乙烯醇)和共聚物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)和共聚物、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、瓜尔胶、羟乙基瓜尔胶、羟丙基瓜尔胶、明胶、白蛋白、羟丙基甲基瓜尔胶、羧甲基瓜尔胶、羧甲基壳聚糖、刺槐豆胶、角叉菜胶、黄原胶、结兰胶、普鲁兰多糖、右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、芦荟凝胶、硬葡聚糖、裂裥多糖、***树胶、罗望子胶、氧乙烯-环氧丙烷-氧乙烯嵌段共聚物、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、卡波姆及其盐、聚(丙烯酸)及其盐、聚(甲基丙烯酸)及其盐、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基磷酸)盐、聚(乙烯基磺酸)盐、聚(2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸)钠、聚丙烯酰胺、聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(N-乙烯基乙酰胺)、聚(N-乙烯基甲酰胺)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甘油酯)、在低于其低临界溶解温度下水合的聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚季铵盐-1、聚季铵盐-6、聚季铵盐-10、紫罗烯聚合物、阳离子瓜尔胶、吡啶鎓聚合物、咪唑鎓聚合物、二烯丙基二甲基铵聚合物、聚(L-赖氨酸)、丙烯酰基-、甲基丙烯酰基-和苯乙烯基-三甲基铵聚合物、丙烯酰胺基-和甲基丙烯酰胺基-三甲基铵聚合物和抗微生物肽构成的组。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物是干燥或水合膜的形式。

10.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含一种组分，所述组分选自由细胞；颗粒化羊膜组织；胎盘组织；切碎的组织；微粒化组织和微粒化脱细胞组织；合成或天然衍生的细胞外基质组分；羟基磷灰石；颗粒状交联牛肌腱胶原蛋白和糖胺聚糖；蜂蜜；多糖；可生物降解的聚合物；及其组合构成的组。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述切碎的组织选自切碎的皮肤组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脂肪组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、膀胱组织、肠道组织、心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织、和声带组织；所述微粒化组织和微粒化脱细胞组织选自皮肤组织、肌肉组织、血管组织、神经组织、脂肪组织、软骨组织、骨组织、肌腱组织、膀胱组织、肠道组织、心脏组织、肺组织、肾组织、肝组织、胰腺组织、声带组织；所述合成或天然衍生的细胞外基质组分选自胶原蛋白、糖胺聚糖、纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白；所述可生物降解的聚合物选自聚乙交酯、聚丙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、聚二噁烷酮、聚己内酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚氨基甲酸酯、聚(酯酰胺)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚磷腈和细菌聚酯。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组分选自干细胞，所述干细胞选自由成体干细胞、诱导性多能干细胞、胎体干细胞、组织干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞、血液祖细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、上皮干细胞、外胚层干细胞、心脏干细胞、胰腺干细胞、角膜缘干细胞、围产期干细胞、侧群细胞、全能干细胞、单能干细胞及其混合物构成的组。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述干细胞选自由胚胎干细胞、多能干细胞、神经干细胞、卫星细胞、表皮干细胞、人脐带血干细胞、羊膜干细胞及其混合物构成的组。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述成体干细胞为造血干细胞。

15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细胞选自由成纤维细胞、角质形成细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、雪旺氏细胞、背根神经节、脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞、纤维软骨细胞、肌细胞、肝细胞、基质细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、周细胞、血小板及其混合物构成的组。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述细胞选自肠上皮细胞、心肌细胞、成肌细胞和肌腱细胞。

17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述肌细胞为平滑肌细胞。

18.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含活性剂，所述活性剂选自由银纳米粒、金纳米粒、铋纳米粒、钆纳米粒、含抗生素纳米粒、含一氧化氮纳米粒、含药微粒、抗微生物剂、杀孢子剂和抗寄生虫剂、神经性剂、镇痛剂、抗炎剂、抗过敏剂、止汗剂、抗晕动病剂、伤口愈合剂、抗VEGF剂、抗肿瘤剂、抗糖尿病药、抗关节炎药、止痒剂、麻醉剂、皮肤病药剂、止吐剂、抗风湿剂、抗雄性激素剂、抑烟剂、抗老化剂、止血剂、血管收缩剂、抗凝血剂、心血管药物、***功能障碍药物、生物活性配体、细胞贴附介质、免疫调节剂、抗抑郁剂、镇咳剂、麻醉拮抗剂、避孕剂、免晒美黑剂、麦卢卡蜂蜜、激素、转染剂、阿片样物质、酶、酶抑制剂、多肽、蛋白、前药、螯合剂、毛发生长剂、脂质、糖类、类固醇、以其盐形式或其中性形式、及其组合构成的组。

19.根据权利要求18所述的组合物，所述活性剂选自含抗生素微球、抗微生物微球、丝裂霉素型抗生素、多烯抗真菌剂、银盐、水杨酸、抗疟剂、抗牛皮癣剂、抗痤疮剂、周围神经病变剂、减充血剂、中枢神经***剂、副交感神经抑制剂、布比卡因、生长激素、性激素、皮质类固醇、抗组胺剂、蒽环类药物、肿瘤坏死因子α、细胞凋亡诱导剂、肿瘤特异性抗体、非甾体抗炎药物、5-氟尿嘧啶、抗高血压剂、心绞痛药、抗心律失常剂、抗高胆固醇血症药、抗胆碱能剂、异黄酮、精油、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、寡肽、环肽、蛋白酶抑制剂、DNA、DNA片段、DNA质粒、反义寡核苷酸、小干扰RNA、抗VEGF RNA适体、整联蛋白结合序列、糖蛋白、热休克蛋白、细胞因子、糖脂。

20.根据权利要求19所述的组合物，所述活性剂选自α-羟基酸、烟酸、***素、***、睾酮、血管舒张剂、可乐定、***油、抗惊厥药、尼古丁、东莨菪碱、酮洛芬、双氯芬酸、芬太尼、丁丙诺啡、维生素、胰岛素和胰岛素衍生物、趋化剂、局部维他命A群、锌盐、生长因子、分化因子、核酸。

21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水不溶性微凝胶颗粒是干粉形式。

22.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含水性介质，所述水性介质选自水、等渗盐水、平衡盐溶液、缓冲溶液、林格氏溶液、细胞培养基、血清、血浆、羊水、华通氏胶、营养液、防腐溶液或其组合。

23.根据权利要求22所述的组合物，所述水性介质选自干细胞培养基。

24.根据权利要求22所述的组合物，其进一步包含溶液、悬浮液、乳膏剂、洗剂、凝胶、糊剂、乳液、香脂、喷雾剂、泡沫剂、气雾剂或其他制剂。

25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白选自由纤维蛋白原、纤维蛋白、细胞外基质、血浆蛋白和胶原蛋白构成的组；且PEG化试剂是α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯。

26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白选自纤维蛋白原和纤维蛋白，并且所述微凝胶颗粒在哺乳动物体内诱导血管生成。

27.根据权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白选自纤维蛋白原和纤维蛋白，PEG化试剂是α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯，且活性生物剂是聚(六亚甲基双胍)及其盐。

28.一种水不溶性微凝胶颗粒的制备方法，其包含：

提供一种生物原材料，所述生物原材料包含蛋白、基于蛋白的生物大分子或两者的组合；

使所述生物原材料与PEG化试剂反应；

通过交联所述生物原材料与所述PEG化试剂来PEG化所述生物原材料，以形成双官能团至多官能团PEG化，

在水合或脱水条件下，研磨或剪切所述PEG化的生物原材料以产生众多微凝胶颗粒，其中所述微凝胶颗粒在水溶液中是假塑性和可注射的，

其中所述水合微凝胶颗粒的溶液的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下重新形成微凝胶簇，

其中所述PEG化试剂与所述生物原材料的摩尔比为1:1至100:1，以及

其中所述水合微凝胶颗粒具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值，其中所述微凝胶颗粒具有选自由椭圆形、角形、或不规则形状组成的组的形状；

其中所述蛋白PEG化交联剂选自由α-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基-ω-琥珀酰亚胺基氧戊二酰基氧聚氧乙烯、α-氨基丙基-ω-氨基丙氧基聚氧乙烯、α-氨基丙基-ω-羧基戊氧基聚氧乙烯、α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]乙基}聚乙二醇、α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基ω-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙氧基聚氧乙烯、季戊四醇四(氨基丙基)聚氧乙烯，α-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-(琥珀酰亚胺基氧羧基)聚氧乙烯、季戊四醇四(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯、六聚甘油八(琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、六聚甘油八(4-硝基苯氧羰基)聚氧乙烯、4-臂聚(乙二醇)四丙烯酸酯、4-臂琥珀酰亚胺基氧戊二酰基)聚氧乙烯、双(聚氧乙烯双[咪唑基羰基])、O-(3-羧丙基)-O′-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇、O,O′-双(2-叠氮基乙基)聚乙二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二环氧甘油醚、聚(乙二醇)二(对-硝基苯基碳酸酯)、聚(乙二醇)二(乙烯砜)、聚(乙二醇)二(丙醛)、聚(乙二醇)二(苯并***基碳酸酯)及其组合构成的组。

29.权利要求1所述的组合物在制备治疗软组织损害或损伤的药物中的用途，其中所述肽激素是天然多肽、合成多肽、寡肽、抗微生物肽、神经肽；所述酶是凝血酶。

30.权利要求1所述的组合物在制备治疗软组织损害或损伤的药物中的用途，其包含：

提供根据权利要求1所述的组合物，以及

将所述组合物注射到软组织中，其中所述注射是皮内、皮下、口腔、肌内、粘膜下、鼻内、***、颊、鞘内、硬膜外、实质内、视网膜下、齿、肿瘤内、心内、关节内、静脉内、海绵体内、骨内、腹膜内、腹内、筋膜内、和玻璃体内的。

31.根据权利要求30所述的用途，其中权利要求1所述的水不溶性微凝胶颗粒为干粉形式，并且所述用途进一步包含在所述注射步骤之前水合所述干粉。

32.根据权利要求30所述的用途，其中，在注射后，所述组合物促进血管生成。

33.一种试剂盒，其包含：

水不溶性微凝胶颗粒，当水合时，所述水不溶性微凝胶颗粒是假塑性和可注射的，其中所述微凝胶颗粒包含交联的PEG化的蛋白、交联的PEG化的基于蛋白的生物大分子，

其中，当水合时，所述微凝胶颗粒的簇的粘度随剪切力的施加而降低，并且在不存在剪切力的情况下重新形成微凝胶簇，

其中PEG化试剂与基于蛋白的生物大分子的摩尔比为1:1至100:1；

其中，当水合时，水合微凝胶颗粒具有粘弹性固体性质、大于损耗模量的储能模量以及小于1的损耗角正切值；其中所述微凝胶颗粒具有选自由椭圆形、角形、或不规则形状组成的组的形状；以及

用于将所述水不溶性微凝胶颗粒放置在哺乳动物体内或其上的说明书，

其中所述蛋白和基于蛋白的生物大分子选自由细胞外基质、糖蛋白、结构蛋白、纤维蛋白、酶、蛋白聚糖、球状蛋白、膜蛋白、血浆蛋白、肽激素、伴侣蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、凝血蛋白、免疫***蛋白、离子通道蛋白、细胞粘附蛋白、核蛋白、硬蛋白、色素蛋白、缀合蛋白、蛋白-蛋白复合物、蛋白-多糖复合物、蛋白-脂质复合物、运动蛋白、黏蛋白、磷蛋白、收缩蛋白、转运蛋白、信号蛋白、调节蛋白、生长因子蛋白、感觉蛋白、防御蛋白、储存蛋白、受体蛋白、抗体、重组蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白、明胶、角蛋白、层粘连蛋白及其组合构成的组，

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述肽激素是天然多肽、合成多肽、寡肽、抗微生物肽、神经肽；所述酶是凝血酶。

35.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述水不溶性微凝胶颗粒为干粉形式；

其中干燥微凝胶颗粒的尺寸范围为1至250μm；以及

其中所述说明书包括水合干粉形式的所述水不溶性微凝胶颗粒。

36.根据权利要求33所述的试剂盒，

其中水合微凝胶与细胞混合，以及

其中根据使用说明，将所述水合细胞-微凝胶组合物放置在哺乳动物体内或其上。

37.根据权利要求33所述的试剂盒，其进一步包含抗微生物剂，以及

根据使用说明，所述说明包括将治疗组合物施用于哺乳动物体内或其上，所述治疗组合物包含所述水不溶性微凝胶颗粒和抗微生物剂。

38.根据权利要求33所述的试剂盒，其中当放置在哺乳动物体内或其上时，微凝胶促进血管生成。