CN107703112A - 基于碳量子点猝灭的荧光标记dna的比例性荧光方法检测肝素钠 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于碳量子点猝灭的荧光标记DNA的比例型荧光方法检测肝素钠。其特征是肝素钠可以恢复被碳量子点猝灭的FAM标记DNA的荧光，而且随着肝素钠浓度的升高，FAM的恢复随之增加，同时碳量子点原先的荧光强度保持稳定，据此，建立检测肝素钠的比率型荧光新方法。本发明所述的肝素钠检测方法步骤简单，肝素钠对DNA的荧光恢复呈现良好的线性相关，检测限较低，达到9.04 ng/mL。实际兔血清样品的肝素钠加标回收率在95.47−111.95%范围内。模拟血清的肝素钠测定的拟合曲线与标准曲线相近，因此，血清样品不会干扰检测的结果。与其他肝素钠检测方法相比，本方法具有检测性能优异，操作简便的特点，为临床肝素钠检测提供了新的方法选择。

Description

基于碳量子点猝灭的荧光标记DNA的比例性荧光方法检测肝 素钠

技术领域

本发明涉及碳纳米材料的应用领域，具体地，涉及一种基于碳量子点猝灭FAM标记的ssDNA的比例性荧光方法检测肝素钠。

背景技术

（1）肝素(Heparin，简称为 Hep)由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的黏多糖硫酸脂，相对平均分子量为15 KD，有较强酸性，同时带有很强的负性电荷。肝素钠可以使凝血变得缓慢或者减轻，是一种十分有效的抗凝血药物。在医院中，肝素可以用来防治血栓，并且对需要进行血液透析的病人来说是一种常用的抗凝血药物。但是对于不同的疾病，肝素都会有不同的最适宜剂量，这是由于肝素的最主要副作用是可引起自发性出血和血小板减少症，这些副作用是肝素治疗过程中严重的并发症，给患者带来极大的痛苦，也可能造成医药纠纷，因此在临床上，需要对肝素的使用量以及病人体内肝素含量进行监测，这样既能防止发生出血或血栓等不良事件，又能有效指导和调整临床合理用药。

（2）测定肝素的方法有很多，主要包括生物方法以及一些化学方法。在临床治疗诊断中常采用生物的方法来进行检测，对防止肝素不当使用引起的各种并发症有重要作用。但是由于生物个体较大，生物方法对肝素的监测适用范围有限，存在一定的限制。肝素监测的化学方法有光度法、高效液相色谱法、共振散射法、毛细管电泳法、电化学传感器、修饰电极法等。其中荧光分析法由于它较高的准确度和灵敏度以及可操作性，被广泛用于各种生化物质和药物的监测。据报道金纳米粒子可以用于肝素的测定，但是仍然未见到关于比率型荧光分析方法测定肝素的报道。

（3）碳量子点（CQDs）具有特殊的物理和化学性质，被科学家广泛研究。通常情况下，碳量子点既有大的π键，而且具备一系列新的光学性质。由于碳量子点所表现的生物相容性、低毒性、化学惰性、稳定性、光致发光等性能，使得碳量子点在生物传感成像、光电器件等方面有广阔的应用前景。根据本实验室最新实验发现特定制备的碳量子点可以猝灭FAM等荧光染料标记的ssDNA的荧光信号的特点，本发明利用肝素钠与碳量子点猝灭的FAM标记的ssDNA体系作用，发现肝素钠可以恢复原先被猝灭的FAM荧光，而碳量子点自身的荧光强度保持稳定。两者的发光波长显著差异，信号比值随着肝素钠浓度的变化而敏感变化，基于此建立比率型荧光分析新方法测定肝素钠。

发明内容

（1）有鉴于此，本发明的目的是通过加入肝素钠与碳量子点猝灭FAM标记的ssDNA体系作用，建立比例性荧光方法检测肝素钠，该方法操作简单，灵敏度高。

（2）为了实现上述目的，本发明提供了一种基于碳量子点猝灭的荧光标记DNA的比率型荧光检测肝素钠的方法，其特征在于，包括如下步骤：配置不同浓度的肝素钠缓冲溶液，加入碳量子点和FAM标记DNA，分别检测碳量子点和FAM标记DNA的荧光。其中，试剂配置操作简单，反应条件易操纵。

（3）制备的试剂室温避光反应10分钟，移入荧光分光光度计，分别在345 nm和488nm的波长激发，分别读取420 nm和520 nm的荧光强度。反应、测定条件简单。

（4）为获得测定基于CQDs猝灭平台肝素钠最大荧光恢复效率的反应体系，作为优选，检测不同浓度CQDs条件下FAM标记DNA对加入肝素钠前后的荧光变化值。

（5）时间动力学的检测方法为：迅速配好样品，混匀后开始计时，每隔一段时间检测一次荧光强度，早期每隔一分钟检测一次，后期可相应延长时间，直到检测1小时，考察检测肝素钠所需的时间。

（6）为体现反应体系的普遍性，选择FAM标记的不同长度和序列的探针A₁₀（5’-FAM-AAAAAAAAAA-3’），A₂₀，A₄₀代替原有碱基序列的DNA进行试验。

（7）针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种操作简便、灵敏度高，能有效测得肝素钠的碳量子点的新型应用领域。

（8）为了实现上述目的，本发明提供了一种肝素钠的定量检测方法，通过荧光分光光度法进行肝素钠的检测，其特征在于，所述荧光分光光度法中的溶剂通过缓冲溶液、CQDs、FAM-ssDNA和肝素钠混合而成。

（9）本发明的有益效果是，本发明将石墨烯量子点和FAM标记的ssDNA进行反应，碳量子点会猝灭DNA 的荧光，猝灭效率达到85%，接着加入肝素钠会恢复DNA的荧光，而碳量子点在整个过程中均保持相对稳定的荧光强度。通过加入肝素钠测定FAM标记DNA荧光强度的变化程度，建立FAM标记DNA荧光信号变化和稳定荧光强度的碳量子点的比率型荧光检测方法检测肝素钠，获得了良好的效果，且操作方便，灵敏度高，肝素钠的最低检出限可达到9.04 ng/mL。

（10）本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是CQDs对FAM-ssDNA荧光的猝灭效果以及肝素钠对FAM-ssDNA荧光恢复的同步扫描荧光光谱图。

图2 是CQDs的透射电镜照片。

图3是不同浓度CQDs时肝素钠对ssDNA荧光的恢复效率关系图。

图4 是CQDs猝灭FAM标记ssDNA以及肝素钠恢复CQDs猝灭FAM标记ssDNA的荧光强度变化动力学关系图。

图5 是不同的干扰物质下CQDs猝灭FAM-ssDNA体系的荧光的恢复效率的对比图。

图6是CQDs对FAM标记的不同探针的猝灭和恢复的对比图。

图7 是CQDs-ssDNA在加入不同浓度的肝素钠后的CQDs和ssDNA的荧光强度图谱。

图8 是PBS溶液中ssDNA和CQDs的荧光强度比值和肝素钠浓度之间的关系图。

图9是PBS溶液中ssDNA和CQDs的荧光强度比值和肝素钠浓度之间的线性关系图。

图10 是PBS和模拟血清中ssDNA和CQDs荧光强度比值和肝素钠浓度之间的线性关系比较图。

具体实施方式

（1）下面结合具体实施方式和附图对本发明进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

（2）实施例（可行性分析）

本实施例的可行性实验的样品通过以下步骤制得：

配置以下溶液：溶液1为CQDs；溶液2为FAM-ssDNA；溶液3为CQDs+FAM-ssDNA；溶液4为CQDs，FAM-ssDNA和肝素钠。其中CQDs浓度6.25 μg/mL，FAM-ssDNA浓度50 nM，肝素钠浓度2.0 μg/mL，三种组分溶液都是用磷酸盐缓冲液配的，本发明实施例用的缓冲溶液（缓冲溶液由Na₂HPO₄﹒12H₂O、NaH₂PO₄﹒2H₂O、NaCl组成）的浓度为10 mM， 且缓冲溶液的pH为7.4。所述碳量子点（CQDs），由2.0 g柠檬酸和0.6 g谷胱甘肽熔融后分步加入10.0 mL多乙烯多胺反应1小时制得。FAM-ssDNA指6-羧基荧光素标记单链DNA，5’-FAM-AAAAAAAAAA-3’。

（3）对本实施例制得的溶液进行同步荧光检测，设置检测参数Δλ为50，扫描200nm到600 nm的荧光光谱，分别读取CQDs (420 nm)，FAM-ssDNA（520 nm）。图1表明单独CQDs和FAM-ssDNA的荧光光谱不会互相干扰，两者混合及加入肝素钠前后时，CQDs的荧光始终不变，而DNA呈现猝灭和恢复两种结果，并且恢复效率会随浓度变化。说明可以建立比例型荧光检测方法。

（4）图2为本实施例中CQDs的透射电镜图，如图2所示，CQDs颗粒分布均匀，尺寸为2.6 nm。

（5）图3为不同浓度CQDs时肝素钠对ssDNA荧光的恢复效率关系图，如图3所示，6.25 μg/mL为最佳浓度。

（6）图4是CQDs-ssDNA以及CQDs-ssDNA加入肝素钠的反应动力学的结果，如图4所示，混合物在10分钟后的荧光强度保持稳定。

（7）图5是不同的干扰物质下FAM-ssDNA荧光的恢复效率的结果，如图5所示，肝素钠的恢复效果最好，说明本发明的检测方法特异性好。

（8）图6是CQDs对FAM标记的不同探针的猝灭和肝素钠恢复荧光强度图谱，如图6所示，A₁₀，A₂₀，A₄₀，和本实施例的探针都有猝灭和恢复的结果。

（9）本发明提供了一种肝素钠的检测方法，通过荧光分光光度法进行肝素钠的检测，其中，所述荧光分光光度法中的溶液通过缓冲溶液、FAM-ssDNA、石墨烯量子点和肝素钠混合而成。

①准确量取10 µL CQDs溶液、10 µL FAM-ssDNA和10 µL一系列不同浓度肝素钠，保持总体积为200 µL，避光反应10 min后将所得溶液置于荧光分光光度计中。其中，所有的组分溶液都是用磷酸盐缓冲液配的，CQDs浓度6.25 μg/mL，FAM-ssDNA浓度50 nM。

②在激发波长488 nm条件下，读取发射波长520 nm处荧光强度值，根据荧光强度数据可以得出已知FAM-ssDNA的荧光强度值，绘制标准曲线。

③在本发明提供的一种优选的实施方式中，所述溶液中各组分的含量具体为：CQDs的浓度为6.25 µg/mL，缓冲溶液（缓冲溶液由Na₂HPO₄﹒12H₂O、NaH₂PO₄﹒2H₂O、NaCl组成）的浓度为10 mM， 且所述缓冲溶液的pH为7.4。图7中的曲线自下而上对应的肝素钠浓度为0µg/mL、0.01 µg/mL、0.05 µg/mL、0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1.0 µg/mL、1.5 µg/mL、2.0 µg/mL、2.5 µg/mL、3.0 µg/mL、5.0 µg/mL、10 µg/mL，从而可以看出，随着肝素钠浓度的增大，DNA的荧光强度逐渐增大，大于3.0 µg/mL后保持稳定。图8中纵坐标为DNA荧光和CQDs荧光的比例值，随着肝素钠浓度的增大，DNA的荧光强度逐渐增大，大于3.0 µg/mL后保持稳定，通过图9可以看出，待测肝素钠浓度在0-2 µg/mL时，其浓度与ssDNA和CQDs的荧光比值有着良好的线性关系，线性方程为：F/F_CQDs=0.20791+0.52224X，且R²为0.99796，F和F_CQDs分别为加入肝素钠后ssDNA和碳量子点的荧光值；X为肝素钠浓度最低检测限（LOD）=9.04 ng/mL（S/N=3）。图10为PBS和模拟血清中ssDNA和CQDs荧光强度比值和肝素钠浓度之间的线性比较图，两条线性相近，说明模拟血清不会干扰肝素钠的检测。

④本发明考察基于CQDs猝灭荧光标记的DNA测定不同活性浓度肝素钠的重现性，在步骤③的测定条件下，重复、独立分别测定0.01 µg/mL、0.1 µg/mL六次，测定的RSD分别为4.23%和4.76%。

⑤以上实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于碳量子点猝灭的荧光标记DNA的比率型荧光检测肝素钠的方法，其特征在于，包括如下步骤：配置含有不同浓度肝素钠的缓冲溶液，加入碳量子点和荧光标记DNA，分别检测碳量子点和DNA的荧光。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA为5’末端标记FAM的单链DNA（FAM-ssDNA），序列为5’-FAM-TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A-3’。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述碳量子点（CQDs），由2.0 g柠檬酸和0.6 g谷胱甘肽熔融后分步加入10.0 mL多乙烯多胺反应1小时制得。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CQDs最大激发波长345 nm。

5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，对CQDs浓度在3.125~25 μg/mL、和反应时间在0~60分钟范围进行优化。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，选择最佳CQDs浓度为6.25 μg/mL。

7.如权利要求1-5所述的方法，其特征在于，加入肝素钠与碳量子点和荧光标记DNA后溶液混匀室温避光放置反应10 min，再进行荧光检测。

8.如权利要求1-7所述的方法，其特征在于，缓冲溶液为PBS，缓冲液浓度为10 mM，且所述缓冲液pH为7.4。

9.一种肝素钠的检测方法，通过荧光分光光度法对加入不同浓度肝素钠前后FAM-ssDNA的 荧光进行检测，其特征在于，所述荧光分光光度法中使用的溶液由缓冲溶液、CQDs、FAM-ssDNA和肝素钠混合而成。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，通过所述荧光分光光度法绘制的吸收光谱曲线方程为：Y=0.20791+0.52224X，R²=0.99796，Y为F/F_CQD，F和F_CQDs分别为加入肝素钠后ssDNA和碳量子点的荧光值；x为肝素钠浓度，最低检测限(LOD)=9.04 ng/mL；所述溶液中各组分的含量为：CQDs的浓度为6.25 μg/mL，FAM-ssDNA的浓度为50 nM。