CN107683412A - 被检对象的检测方法以及用于该方法的免疫测定仪器和单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的检测方法，其是对被检对象通过免疫测定进行检测的方法，在该免疫测定中使用单克隆抗体，尽管如此还改善了基于使用单克隆抗体的低灵敏度。被检对象的检测方法是存在可为被检对象的检测的2种类以上抗原的被检对象的检测方法，通过使用识别这些2种类以上抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段的、夹层法等的免疫测定方法来进行。

Description

被检对象的检测方法以及用于该方法的免疫测定仪器和单克 隆抗体

技术领域

本发明涉及通过免疫测定检测病原菌等被检对象的检测方法以及用于该方法的免疫测定仪器和单克隆抗体。

背景技术

由于单克隆抗体仅识别特定的抗原，因此被广泛用于其特定抗原的检测中。例如，专利文献1中记载了：免疫测定肺炎支原体的方法，且是基于将识别肺炎支原体的P30蛋白质的单克隆抗体固化于固相的夹层法的免疫测定方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献：WO2015/025968。

发明内容

发明所要解决的课题

多克隆抗体是识别各种各样的抗原或抗原决定区的各种抗体混杂而成的抗体，由于单克隆抗体具有仅识别某特定抗原的、某特定区域的性质，因此与多克隆抗体比较，通常特异性较高。其另一方面，容易想到的是：在可与抗体结合的抗原种类及其总数中，相对于多克隆抗体，单克隆抗体处于劣势。这会造成：单克隆抗体和使用其的免疫测定方法和免疫测定仪器中，低灵敏度。

本发明的目的在于，提供新型的检测方法，其是对被检对象通过免疫测定进行检测的方法，在该免疫测定中使用单克隆抗体，尽管如此还改善了基于使用单克隆抗体的低灵敏度。而且，本发明的目的在于，提供上述本发明的检测方法中所用的免疫测定仪器。并且，本发明的目的在于，提供可用于基于上述本发明的方法的肺炎支原体的检测的新型的单克隆抗体。

用于解决课题的手段

为了补充单克隆抗体的灵敏度较低的缺陷，考虑使用多个单克隆抗体的免疫测定法。称之为通常的ELISA、免疫色谱法(イムノクロマトグラフィー)的免疫测定法，能够使用的抗体量取决于ELISA板或免疫色谱法条纹的面积或标记物的面积。该情形，与使用单一的单克隆抗体的情形相比，通过使用多个单克隆抗体，可与这些抗体结合的抗原种类及总数，形成优势。虽然相对于所使用的抗体量，抗原量过剩的情形，未见差异，但相对于所使用的抗体量，抗原量不足时，会带来免疫测定法中的高灵敏度。

但是，由于各单克隆抗体的使用量比使用单一的单克隆抗体的情形变少，因此每特定抗原与抗体的相遇概率减少，每单位时间的反应性降低。这是不容易实现免疫测定法中的高灵敏度的因素之一，难以获得能够满意的灵敏度。

本申请发明人专心研究的结果，发现通过使用具有特异性且识别2种类以上抗原的单克隆抗体，相比以往的以单独或多个使用单克隆抗体的方法，灵敏度优异，从而完成了本发明。而且，发现通过使用该单克隆抗体的免疫测定法，与以往的使用单克隆抗体的免疫测定比较，灵敏度优异，从而完成了本发明。

即，本发明提供被检对象的检测方法，其是存在可为被检对象的检测的2种类以上抗原的被检对象的检测方法，前述被检对象的检测方法通过使用识别前述2种类以上抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段的免疫测定方法来进行。另外，本发明提供免疫测定仪器，其是用于进行上述本发明的方法的免疫测定仪器，包含固化有前述单克隆抗体或其抗原结合性片段的固相。而且，本发明提供对于来自肺炎支原体的P1蛋白质和P30蛋白质特异性地进行反应的单克隆抗体。

发明效果

本发明的方法由于在免疫测定中使用单克隆抗体，因此特异性高，尽管如此还改善了基于使用单克隆抗体的低灵敏度。另外，通过本发明提供了用于本发明的新型的检测方法的免疫测定仪器和单克隆抗体。

附图说明

[图1]是显示通过免疫印迹法研究下述实施例中制作的本发明的单克隆抗体的反应性的结果的图。

[图2]是示意性地显示本发明的免疫色谱(イムノクロマト)免疫测定仪器的优选一个方式的图。

具体实施方式

通过本发明的方法所检测的被检对象是存在可进行其检测的2种类以上抗原的被检对象，可举出：细菌、病毒、菌类、立克次体等的各种病原体，但不限于这些。在下述实施例中，被检对象为肺炎支原体，2种类以上的抗原为P1蛋白质和P30蛋白质。需说明的是，即使在定量或半定量被检对象的情形，由于定量或半定量必然性地伴随“检测”，因此也包含在本发明所言及的“检测”中。

本发明的方法中，使用识别上述2种类以上抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段来进行免疫测定。在此，“识别”是指特异性地进行反应、即抗原抗体反应。“特异性”是指在蛋白质和该抗体混合的溶液体系中，该抗体与抗原的蛋白质成分以可检测的水平不引起抗原抗体反应、或即使引起某些的结合反应或缔合反应，相比该抗体与抗原的抗原抗体反应，也仅引起显然弱的反应。

以本发明的单克隆抗体为基础，仅分离了抗原结合部位的抗原结合性片段也可以用于本发明的方法中。即，使用通过公知的方法所制作的、具有Fab、Fab’、F(ab’)₂、单链抗体(scFv)等的特异性的抗原结合性的片段(抗原结合性片段)的情形也包含在本发明的范围内。另外，单克隆抗体的类别不限于IgG，也可为IgM或IgY。

用于本发明的方法的单克隆抗体可以如下获得：使用公知的免疫学方法，将包含目标的2种类以上抗原的复合物或提取物、或2种类以上抗原中的1个抗原或它们的部分肽对被免疫动物进行免疫，使用被免疫动物的细胞制作杂交瘤，从而获得。对用于免疫的肽的长度没有特别限定，可以优选使用5个氨基酸以上、更优选10个氨基酸以上的肽作为免疫原。免疫原也可从培养液中获得，也可以通过将编码任意抗原的DNA***质粒载体，将其导入宿主细胞进行表达而获得。也可以使作为免疫原的任意抗原或其部分肽与以下所例示的蛋白质以融合蛋白质的形式表达，以精制之后或未精制的状态用作免疫原。在融合蛋白质的制作中，本领域技术人员可以利用通常用作“蛋白质表达、精制标签”的、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、Nus标签、S标签、HSV标签、FRAG标签、多组氨酸标签等。与这些的融合蛋白质优选使用消化酶将任意抗原或其部分肽部分与其以外的标签部分切断，分离精制之后用作免疫原。

由已免疫的动物调制单克隆抗体可以通过周知的Kohler等人的方法(Kohler etal., Nature, vol, 256, p495-497(1975))容易地进行。即，由已免疫的动物回收脾细胞或淋巴细胞等抗体产生细胞，通过常规方法使其与小鼠骨髓瘤细胞融合来制作杂交瘤，将所得的杂交瘤通过极限稀释法等进行克隆，在所克隆的各杂交瘤产生的单克隆抗体中，选择与用于动物免疫的抗原进行抗原抗体反应的单克隆抗体。

由于用于本发明的方法的单克隆抗体是识别2种类以上抗原的抗体，因此对于如此操作而选择的、识别2种类以上抗原中的一个的单克隆抗体，进一步筛选识别另一个抗原的单克隆抗体。在使用识别3种类以上抗原的单克隆抗体的情形下，可以进一步重复同样的筛选来选择识别各抗原的单克隆抗体。在本发明的方法中，使用如此操作而获得的识别2种类以上抗原的两者的单克隆抗体或其抗原结合性片段。需说明的是，为了使识别2种类抗原的单克隆抗体能够存在，考虑了下述的各种各样的可能性：在2种类抗原间识别存在于不同抗原中的同源性高的区域的情形、识别存在于不同抗原中的三维结构相似的区域的情形、识别不同抗原形成复合物且跨越其邻接部位的区域的情形、识别不同抗原形成复合物且跨越其邻接部位的三维结构的情形等。因此，本申请发明中所言及的“存在可为被检对象的检测的2种类以上抗原的被检对象的检测方法”，限于可获得识别这些的2种类以上抗原的单克隆抗体的情形。另外，通常，由于所识别的抗原的种类越增加，识别它们的单克隆抗体越难以获得，因此优选单克隆抗体识别的抗原为2种类。需说明的是，在下述实施例中，通过此种筛选，获得了识别肺炎支原体的P1蛋白质和P30蛋白质的单克隆抗体。

从腹水或培养上清中精制单克隆抗体可以使用公知的免疫球蛋白精制法。例如可举出：基于使用硫酸铵或硫酸钠的盐析的分馏法、PEG分馏法、乙醇分馏法、DEAE离子交换色谱法、凝胶过滤法等。另外，根据免疫动物种和单克隆抗体的类别，还可以通过使用结合有蛋白A、蛋白G、蛋白L的任一者的载体的亲和性色谱法进行精制。

本发明的免疫测定方法中，通过利用如上操作而制作的识别2种类以上抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段(以下，在实施例之前为止的记述中，从文脉上看明确并非如此的情形除外，“抗体”是指“抗体或其抗原结合性片段”)与检体中抗原的抗原抗体反应的免疫测定进行测定。作为用于该测定的免疫测定法，还可以使用竞争法、凝集法、免疫印迹法、免疫染色法、夹层法等本领域技术人员所周知的任一种方法。需说明的是，本发明中，“测定”也包含定量、半定量、检测的任一者。

作为免疫测定，优选夹层法。夹层法本身在免疫测定领域中是周知的，例如可以通过免疫色谱法或ELISA法进行。这些夹层法本身均为周知的，本发明的方法除了使用上述的本发明的识别2种类以上抗原的单克隆抗体以外，可以通过周知的夹层法进行。

夹层法中使用识别抗原的2种类抗体(固化于固相上的抗体和标记抗体)，但在本发明的方法中，这些的2种类抗体中，至少任一方是上述的识别2种类以上抗原的单克隆抗体。如后所述，由于固化于固相上的抗体在每单位面积上可固化的抗体量受限，因此为了更好实现称之为灵敏度提升的本发明的目的，优选至少在固化抗体上使用上述的识别2种类以上抗原的单克隆抗体。需说明的是，单一的分子或单一的复合物之中，在通过该单克隆抗体所识别的抗原至少存在2种类的情形下，还可以将单一种类的该单克隆抗体用作固相化抗体和标记抗体来进行夹层法(参照下述实施例)。

以夹层法为检测原理的免疫测定中，作为固化抗体的固相，可以使用通过公知技术可固定抗体的所有固相，例如可以任意地选择：具有毛细管作用的多孔薄膜(膜)、粒子状物质、试验管、树脂平板等公知的固相。另外，作为标记抗体的物质，可以使用：酶、放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色粒子、胶体粒子等。即使是基于前述的各种材料的免疫测定法之中，特别是从临床检查的简便性和快速性的观点出发，也优选使用膜的横向流动式的免疫测定法。

本发明还提供使用识别2种类以上抗原的单克隆抗体可以横向流动式地进行免疫测定的免疫测定仪器。本发明所提供的免疫测定仪器为下述的免疫测定仪器，其包含：具有固化有捕捉测定对象物(抗原)的抗体(抗体1)的检测区域的支持体；具有可移动的标记抗体(抗体2)的标记物区域；滴加检体的样品垫；吸收已展开的检体液的吸收带；用于将这些部件贴合成1个的包装片，抗体1和抗体2的至少一方为本发明的识别2种类以上抗原的单克隆抗体。

需说明的是，检测区域的数目和标记物区域所含的标记抗体的种类不限于1，通过使用对应于多个测定对象物的抗体，可以利用同一免疫测定仪器检测2种以上的抗原。

图2是显示本发明的免疫色谱免疫测定仪器的优选1个方式的图。1指支持体、2指标记物区域、3指检测区域、4指样品垫、5指吸收带、6指包装片。

图2的上为俯视图、下为切断截面图。图的例子中，在包装片上分别层叠形成有2个检测区域的支持体、吸收带、标记物区域、样品垫等。而且，如图所示，吸收带的一方的端部与支持体的一方的端部、支持体的另一方的端部与标记物区域的一方的端部、标记物区域的另一方的端部与样品垫的一方的端部分别重叠，由此，形成连续的横向流动的流路。

支持体是具有将用于捕捉抗原的抗体固化的性能的材料，且具有不妨碍液体沿水平方向通行的性能。优选为具有毛细管作用的多孔薄膜，是通过吸收可输送液体和分散于液体中的成分的材料。对形成支持体的材质没有特别限定，例如可举出：纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纤维、尼龙、聚酮等。其中，更优选使用硝化纤维素制成的薄膜。

标记物区域由包含标记抗体的多孔基材构成，基材的材质可以使用通常所用的玻璃纤维或无纺布等。为了含浸多量的标记抗体，该基材优选为厚度0.3mm～0.6mm左右的垫状。

检测区域指固化有捕捉抗原的抗体的支持体的一部分的区域。关于检测区域，至少设置1个固化有识别2种类以上抗原的单克隆抗体的区域，而且设置用于检测标记抗体的检测区域，这对于实际的辅助诊断而言优选。

样品垫是用于滴加检体或使用检体而调制的试样的部位，是具有吸水性的多孔材料。该材料可以使用通常所用的纤维素、玻璃纤维、无纺布等。为了将多量的检体用于免疫测定，优选为厚度0.3mm～1mm左右的垫状。需说明的是，样品垫与前述的标记物区域终归是功能性的区别，没有必要一定是个别的材料。即，设为样品垫的材料的一部分区域也可具有标记物区域的功能。

吸收带是用于吸收在支持体上供给、在检测区域未参与反应的成分的部件。该材料可以使用由通常的天然高分子化合物、合成高分子化合物等构成的保水性高的滤纸、海绵等，但为了促进检体的展开，优选吸水性高的材料。

包装片是用于使前述的所有材料、即支持体、样品垫、标记物区域、吸收带等以部分性重叠的方式进行粘附、固定的部件。关于包装片，这些材料等只要以最佳的间隔进行配置、固定，则并非一定必要，但从制造上或使用上的便利性出发，通常优选使用。

图2中说明的方式的免疫测定仪器中，检体流过由样品垫、标记物区域、支持体、检测区域、吸收带等的一连串的连接而形成的多孔流路。由此，在本方式中，所有这些成为检体移动区域。根据各构成材料的材质或方式，也可以有检体不浸透材料内部而通行界面的方式，但本说明书中所定义的检体移动区域不追究材料的内部还是界面，因此该方式的免疫测定仪器也包含在本说明书的范围内。

基于图2的方式，对本发明的免疫测定仪器的使用方法进行描述。通过将检体或使用检体而调制的试样滴加到样品垫上而开始测定。优选所滴加的检体试样预先使用包含表面活性剂的缓冲液稀释至2～20倍左右。

滴加于样品垫的检体试样由于毛管作用而依次沿水平方向标记物区域、支持体、吸收带展开。在标记物区域，与检体试样的展开一同标记抗体释放到溶液中，向支持体展开。检体试样中存在抗原的情形下，在支持体的检测区域，通过捕捉抗体特异性地捕捉抗原，而且抗原还与标记抗体特异性反应而形成复合物。由此，在检测区域达成使抗原介于中间的抗体的夹层，可以在检测区域测定标记抗体-抗原复合物。

作为具有特异性同时识别2种类以上抗原的单克隆抗体，认为可能有下述的各种各样的情形：识别存在于不同抗原中的同源性高的区域的情形、识别存在于不同抗原中的三维结构相似的区域的情形、识别不同抗原形成复合物且跨越其邻接部位的区域的情形、识别不同抗原形成复合物且跨越其邻接部位的三维结构的情形等，但更期望单一的单克隆抗体所识别的2种以上抗原包含在同一复合物中。需说明的是，在此，“复合物”是指在检体中多个分子由于某些作用进行集合而得者，例如，被检对象为菌体的情形，可以认为处于菌体上的各抗原形成复合物。下述实施例中，认为肺炎支原体的P1蛋白质和P30蛋白质形成在此言及的“复合物”。

通过包含在同一复合物中，与以单体存在的情形相比，接受抗体间的立***阻的可能性降低，上述免疫测定法中的夹层达成的概率提高。

认为通过本发明的方法提升免疫测定的灵敏度的原理如下。在夹层法中，使用固化于固相上的抗体，但可固化于固相的每单位面积的抗体量受限。另外，抗原抗体反应的时间也受限。特别是，免疫色谱法中，由于检体或使用检体而调制的试样(检体的稀释物等)仅在自上游起流下来而流过检测区域的之间进行抗原抗体反应，因此在该时间内未能与抗体结合的抗原直接向检测区域的下游流动，不能进行检测。在检体中的抗原量少的情形下，作为固相化抗体，相比使用识别1种类抗原的1种类单克隆抗体(通常的夹层法)，使用识别2种类以上抗原的单克隆抗体的情形与抗体结合的抗原量增加，因此灵敏度提升。另外，作为固相化抗体，在将2种类的分别识别1种类抗原的单克隆抗体组合使用的情形，所固相化的各单克隆抗体的量分别为全固相化抗体量的半份，因此在抗原抗体反应的时间短的情形下，某抗原和可与该抗原结合的单克隆抗体以规定的方向碰撞而结合的概率，与固相化抗体的全部为识别其抗原的单克隆抗体的情形比较，为1/2。另一方面，在使用识别2种类以上抗原的单克隆抗体的情形下，2种类以上抗原的任一者如果与固相化抗体以规定的方向碰撞就会抗体结合，因此固相化抗体所捕捉的抗原量相比将2种类的分别识别1种类抗原的单克隆抗体组合使用的情形变多，因此，免疫测定的灵敏度提升。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明。理所当然，本发明不限于下述的实施例。

实施例1 抗肺炎支原体单克隆抗体的制作

1. 肺炎支原体抗原的调制

培养肺炎支原体，将其培养液通过60℃、30分钟的热处理进行灭活，使用所得灭活物。

2. 抗肺炎支原体单克隆抗体的制作

将1.的支原体灭活抗原对BALB/c小鼠进行免疫，自饲养一定期间的小鼠摘出脾脏，利用Kohler等人的方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))，与小鼠骨髓瘤细胞(P3×63)融合。将所得的融合细胞(杂交瘤)在37℃保温箱中维持，通过使用固相有肺炎支原体P1抗原的板和固相有肺炎支原体P30抗原的板的ELISA，确认上清的抗体活性，同时进行细胞的纯化(单克隆化)。

其结果，如表1所示，获得了多个产生抗肺炎支原体P1抗体、抗肺炎支原体P30抗体和抗肺炎支原体P1-P30抗体的杂交瘤细胞株。

[表]

克隆名称	反应抗原
		P1A	P1
P1B	P1
		P30A	P30
P30B	P30
		P1-P30A	P1、P30
P1-P30B	P1、P30

需说明的是，用于该ELISA的P1、P30通过凝胶过滤和离子交换色谱进行调制。

将已获取的细胞株对经过降植烷处理的BALB/c小鼠进行腹腔给予，约2周后，采取含有抗体的腹水。从所得的腹水中，通过使用蛋白A柱的亲和性色谱法，精制IgG，获得了多个精制的抗肺炎支原体单克隆抗体。

以下的实施例中，在多个所得的抗肺炎支原体单克隆抗体之中，使用了考虑反应性和抗原表位而选择的抗体。

实施例2 抗肺炎支原体单克隆抗体的反应性

通过免疫印迹确认了实施例1中所得的各单克隆抗体与肺炎支原体的反应性。肺炎支原体利用PPLO Broth进行培养，将其培养液作为样品。

将肺炎支原体的培养液和分子量标记物用常规方法的SDS-PAGE进行电泳。电泳后，转印至PVDF膜上。利用脱脂乳进行封闭后，利用PBS-Tween充分地洗净。使利用PBS-Tween调整至1μg/mL的抗P30抗体在室温下反应1小时。利用PBS-Tween充分地洗净后，使稀释至3000倍的HRP标记抗小鼠抗体在室温下反应1小时。利用PBS-Tween充分地洗净后，使用ECL试剂(GE Healthcare)或POD免疫染色试剂盒(和光)检测了信号。

免疫印迹的结果示于图1。如图1所示，实施例1中所得的单克隆抗体与ELISA的结果同样地可以确认到与各抗原特异性地进行反应。需说明的是，图1的左上的图(通过ECL进行荧光检测)显示P1A和P1B的结果，各右的泳道显示菌体的结果、左的泳道显示分子量标记物(图1中的其它图也同样)。在各右的泳道中P1蛋白质的带是明确的。图1的右上的图(POD染色后，利用密度计进行拍摄)显示P30A和P30B的结果。在各左的泳道中P30蛋白质的带是明确的。图1的左下的图(POD染色后，利用密度计进行拍摄)显示P1-P30A的结果。左的泳道中，P1蛋白质的带和P30蛋白质的带是明确的。图1的右下的图(通过ECL试剂进行荧光检测)显示P1-P30B的结果。P30蛋白质的带是明确的，P1蛋白质的带也可以确认到但较弱。

实施例3 测定肺炎支原体的免疫测定仪器

1. 抗肺炎支原体抗体在硝化纤维素膜上的固化

准备将实施例1中制作的抗体用精制水稀释成1.0mg/mL的溶液和抗小鼠IgG抗体，在由PET膜衬里的硝化纤维素膜的样品垫侧将抗体、在吸收体侧将抗小鼠IgG抗体分别涂布成线状。其后，使硝化纤维素膜于45℃干燥30分钟，获得了抗肺炎支原体抗体固化膜。本实施例中称为抗体固化膜。

2. 抗肺炎支原体抗体在着色聚苯乙烯粒子上的固化

将实施例1中制作的抗体用精制水稀释成1.0mg/mL，向其中加入着色聚苯乙烯粒子使达到0.1％，搅拌后，加入碳二亚胺使达到1％，进一步进行搅拌。通过离心操作去除上清，再悬浮于50mM Tris(pH9.0)、3％BSA中，获得了结合抗肺炎支原体抗体的着色聚苯乙烯粒子。本实施例中称为抗体固化粒子。

3. 测定肺炎支原体P1、P30和P1及P30的试验片的制作

将1中制作的抗体固化膜与其它部件(包装片、吸收带、样品垫)贴合，切断成5mm的宽度，作为肺炎支原体试验片(参照图2)。这些在本实施例中称为试验片。

实施例4、比较例1、比较例2

测定P1、P30和P1及P30的免疫测定仪器的灵敏度比较

将实施例1中所得的单克隆抗体以表2的组合通过实施例3的步骤制作了P1试验片(比较例1)、P30试验片(比较例2)、P1-P30试验片(实施例4)的3种类。

[表2]

在各试验片上滴加50μL的包含任意地稀释的肺炎支原体抗原和2中制作的抗体固化粒子的检体悬浮液，静置15分钟。

将在抗小鼠IgG抗体和抗肺炎支原体抗体的两者的涂布位置可以目视确认到显色的情形判定为+。将仅在抗小鼠IgG抗体的涂布位置可以目视确认到显色、在抗肺炎支原体抗体的涂布位置不能目视确认到显色的情形判定为-。另外，将在抗小鼠IgG抗体的涂布位置不能目视确认到显色的情形判定为无效。

各试验片的结果示于表3。

[表3]

Blank

x32

x64

x128

x256

x512

x1024

P1试验片(比较例1)

−

+

−

−

−

−

−

P30试验片(比较例2)

−

+

+

±

−

−

−

P1-P30试验片(实施例4)

−

+

+

+

+

+

±

如表3所示，本发明的测定肺炎支原体的P1和P30两者的免疫测定仪器，与单独测定P1的免疫测定仪器比较显示出16倍优异的灵敏度，与单独测定P30的免疫测定仪器比较显示出8倍优异的灵敏度。

实施例5

将P1-P30试验片的使用抗体以P1-P30A与P1-P30B的组合，与实施例4同样地进行了试验。其结果，与仅P1-P30A的组合(实施例4)比较，显示出2～4倍优异的灵敏度。

符号说明

1 支持体

2 标记物部

3 检测区域

4 样品垫

5 吸收带

6 包装片。

Claims (11)

1.被检对象的检测方法，其是存在可为被检对象的检测的2种类以上抗原的被检对象的检测方法，通过使用识别前述2种类以上抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段的免疫测定方法来进行。

2.权利要求1所述的方法，其中，前述单克隆抗体或其抗原结合性片段用于标记或固相的至少任一方的、前述免疫测定方法为夹层法。

3.权利要求2所述的方法，其中，前述免疫测定方法为免疫色谱法。

4.权利要求1～3的任一项中所述的方法，其中，通过前述单克隆抗体所识别的前述2种类以上抗原形成复合物。

5.权利要求1～4的任一项中所述的方法，其中，前述被检对象为肺炎支原体。

6.权利要求5所述的方法，其中，前述2种类以上抗原为P1蛋白质和P30蛋白质。

7.免疫测定仪器，其为用于进行权利要求1所述的方法的免疫测定仪器，前述单克隆抗体或其抗原结合性片段用于标记或固相的至少任一方。

8.权利要求7所述的免疫测定仪器，其为免疫色谱试验片。

9.权利要求7或8所述的免疫测定仪器，其中，前述被检对象为肺炎支原体。

10.权利要求9所述的免疫测定仪器，其中，前述2种类以上抗原为P1蛋白质和P30蛋白质。

11.单克隆抗体，其对于来自肺炎支原体的P1蛋白质和P30蛋白质特异性地进行反应。