CN1076784A - 磁性微颗粒免疫分离剂及制备 - Google Patents
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Abstract
本发明制备了一种新型免疫分离剂，该分离剂由
Fe3O4微颗粒磁核、包裹在磁核表面的高分子聚合物
薄层和化学交联在薄层表面的抗体组成。用作免疫
分析的分离剂时，非特异结合低，悬浮能力好，解决了
免疫分析中应用醛基固相和磁固相分离剂的问题。
Description
本发明涉及一种新的免疫分离剂及其制备。
在多种免疫分析中，都需要分离抗原、抗体的结合部分与游离部分。改进分离技术不仅能使分析方法快速和简易，而且对改善分析结果的准确性和重复性有重要价值，因此一直是免疫分析方法学研究的重要内容。
应用固相分离技术是免疫分析方法发展过程中的重要改进，研制抗体被化学交联在磁性微颗粒上的免疫分离剂，是前沿性研究课题之一。其中，微晶纤维素磁性抗体已经建立（Forrest，GC.etal：《Immu-noassays for Clinical Chemisty（Edited by W.M.Hunter，etal）》，Churchill Livingstone，p147-162，1983;Read，GF.etal：同上，p163-169）。但是，制备纤维素磁性微颗粒程序繁琐、冗长;另外，这种微颗粒交联抗体前需先将纤维素的羟基活化为活泼的官能团，所用的活化试剂有毒或昂贵，活化产物不稳定，活化条件也难控制。
醛基是活泼的官能团，无需活化即能在普通的条件下直接交联氨基化合物。曾有人使用过化学聚合法（Pourfarzaneh，M.etal：Methods Biochem.Anal.，28：267，1982;Margel，S.etal：J.Cell Sci.，56：157，1982）和辐照聚合法（Rembaum，A：U.S.Patent 4413070，1983;Chang，M.etal：Methods Enzymol.，112：150，1985）制备聚丙烯醛磁性微颗粒。但这些方法复杂，且由这些磁性微颗粒制得的分离剂主要用于细胞的标志和分离，以及亲和色谱分离，当用作免疫分析的分离剂时，则非特异结合很高;和悬浮能力较差，影响免疫反应的完全程度。这两个问题一直没有解决。
本发明的目的是制备一种新的磁性微颗粒分离剂，该分离剂在免疫反应介质中有较好的悬浮能力，且非特异结合低。
本发明的主要内容是：
1、用化学沉淀法制备了Fe3O4微颗粒，作为磁核。
沉淀反应在水介质中进行。Fe+++与Fe++水溶性盐的克分子比为1.5-2.0∶1;沉淀剂与Fe+++和Fe++盐的克当量比为5-8∶1，沉淀剂为氢氧化铵、氢氧化钠或氢氧化钾。反应温度为5-20℃，反应时间为1-2小时。
2、用辐照聚合法在磁核表面包裹聚丙烯醛薄层，作为磁性载体。
聚合反应在水悬液中进行。悬液的组成是：磁核0.5-1.0%（W/V）;丙烯醛和第二单体共3-6%（V/V），其中第二单体占10-40%（V/V）;乳化剂0.5-1%（W/V）。辐照源为60Co，辐照总剂量为5×103-1×104Gy，辐照时间为2-4小时。
上述第二单体为烯类羧酸，如丙烯酸或甲基丙烯酸;乳化剂为十二烷基硫酸钠，十二烷基磺酸钠或十二烷基苯磺酸钠。
3、磁性载体交联可溶性抗体，成为磁性抗体。
交联反应在弱酸性缓冲液悬液中进行。悬液的组成是：磁性载体20-50mg/ml，水溶性抗体和0.1mol/L缓冲液。反应温度为15-25℃，反应时间为10-20小时。
上述抗体可以是经硫酸铵沉淀法纯化过的抗血清或纯γ球蛋白的冻干品，加入量按抗体的滴度确定。缓冲液的pH5-7。
4、封闭磁性抗体粒子上残留的醛基官能团，成为磁性分离剂。
封闭反应在碱性缓冲液悬液中进行。悬液的组成是：磁性抗体20-50mg/ml和含封闭剂的0.1mol/L缓冲液。反应温度为15-25℃，反应时间为3-5小时。
上述封闭剂为低分子量的氨基化合物，如盐酸羟胺，乙醇胺，甘氨酸或三羟甲基胺基甲烷。缓冲液的pH8-10。
如上制备的磁核、磁性载体和磁性分离剂的物理、化学和免疫学性能是：
它们都是黑色的粒子。用透射电子显微镜观测，磁核的外观为不规则的粒子，其平均直径及其相对标准偏差分别为10-50nm和30-40%。磁性载体的外观，呈磁核表面包裹一层聚合物;交联蛋白的容量为200-300mg/g。磁性分离剂在含1%牛血清白蛋白的碱性缓冲液中的半沉降时间为30分钟;3厘米高的悬液置于磁感应强度为0.15特斯拉的磁板表面3-5分钟后，其中的磁性粒子完全被吸留在容器底部，倾出上清液时不会流失;磁性分离剂的缓冲液悬液在40℃放置至少7天，在4℃放置至少6个月，其使用性能不会改变。
同现有的免疫分析的分离技术比较，这种磁性分离剂的优点是：（1）分离剂的制备简便、省时;原料易得，成本低。便于批量生产。（2）使用简便、省时，分析过程中避免了搅拌和离心。适合于分析大批量样品和分析程序的自动化。（3）贮存稳定性好。在较高环境温度下运输，不影响产品的使用性能。（4）通用于多种放射免疫分析项目，如三碘甲腺原氨酸（T3），反T3，游离T3，甲状腺素（T4），游离T4，促甲状腺激素，甲状腺球蛋白（TG）和TG抗体。非特异结合低，重复性好，符合放射免疫分析方法质量控制指标的要求。
实施例
例1.化学沉淀法制备Fe3O4微颗粒
分别溶解9.21克FeCl3·6H2O和3.87克FeCl2·4H2O于80ml和40ml蒸馏水中，冷却至约10℃。25mlNH4OH（含NH325-28%，W/V）加55ml蒸馏水，冷却至约10℃。混合Fe+++和Fe++盐溶液于两口反应瓶中，反应瓶置于冰水浴中，桨式搅拌下滴加NH4OH溶液，速率约3ml/秒，反应1小时，形成黑色Fe3O4微颗粒悬液。悬液用磁板分离沉淀。沉淀用0.9%NaCl充分洗涤，然后用蒸馏水洗涤。最后，沉淀加蒸馏水成悬液。取样，烘干，称重。悬液置于4℃保存。
Fe3O4微颗粒的产额为4.81克，平均直径及其相对标准偏差分别为10.4nm和±34%。
例2.辐照聚合法制备聚丙烯醛微颗粒磁性载体
9.6ml甲基丙烯酸，加丙烯醛38.4ml和例1制得的Fe3O4微颗粒水悬液200ml（48.1mg/ml），加蒸馏水至914ml。通入N2流20分钟，然后加0.1g/ml十二烷基硫酸钠48ml。密封容器，置于翻转搅拌器上，使容器中的悬液呈翻转式搅拌。悬液经60Coγ放射源辐照3小时，总剂量为8×103Gy。聚合产物在磁板上分离沉淀。沉淀用0.9%NaCl充分洗涤，然后用蒸馏水洗涤。最后，沉淀加蒸馏水成悬液。取样，烘干，称重。悬液置于4℃保存。
磁性载体的产额为4.66克;在4℃贮存至少6个月，交联抗体的性能没有改变。
例3.磁性载体交联抗体
例2制得的磁性载体悬液86ml（46.6mg/ml），置于磁板上分离沉淀。沉淀加0.1mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（以下称PB）PH5.4洗一次。沉淀加40ml驴抗兔抗血清（经（NH4）2SO4沉淀法纯化，含总蛋白31.8mg/ml，γ球蛋白G的滴度为1∶32。以下称DXR），0.2mol/L PB pH5.4 80ml和蒸馏水40ml。密封容器，置于翻转搅拌器上搅拌10小时，室温为15℃。反应产物在磁板上分离沉淀。沉淀用0.1mol/L PB pH8.0洗2次。沉淀为磁性抗体。
如上程序，若同时加125I-DXR作为DXR交联反应的示踪剂，在反应的不同时刻取悬液分离沉淀，测量上清液中的125I放射性计数，结果表明：反应5小时，已经基本达到反应平衡;反应10小时，上清液中的125I计数为加入量的16.1%。已知DXR的总蛋白浓度为31.8mg/ml，因此例2制得的磁性载体交联蛋白的容量为267mg/g。
例4.封闭磁性抗体上残留的醛基
例3得到的磁性抗体，加含1%盐酸羟胺的0.1mol/L PB pH 9.5 160ml成悬液。悬液如例3搅拌5小时、磁分离和洗涤。沉淀用0.075mol/L巴比妥缓冲液pH8.5再洗1次。沉淀加1%牛血清白蛋白-0.1% NaN3-0.075mol/L巴比妥缓冲液pH8.5，成5mg/ml悬液，为磁性分离剂悬液，置于4℃备用。
例5.磁性分离剂在放射免疫分析中的使用方法和效果
这种磁性分离剂可用于放射免疫分析，使用方法是：抗原同它的第一抗体的反应完成后，加磁性分离剂0.5mg/管，37℃温育10分钟;加0.9% NaCl 1ml/管洗涤。反应管置于磁板上3-5分钟后，反应管同磁板一起倒置，倾去上清液，并置于多层吸水纸上流尽残液。然后再进行此后的分析程序。
这种磁性分离剂用于T3和T4的放射免疫分析，非特异结合率分别为4.3%和1.8%，零管特异结合率分别为57.8%和58.3%;变异系数：批内＜6%，批间＜12%;标准曲线的相关系数分别为-0.9994和-0.9990;用于其它放射免疫分析项目的效果类似。这些结果均符合放射免疫分析质量控制指标的要求。这种磁性分离剂，与用经典的液双抗体+聚乙二醇作分离剂，同时分析T3或T4的三种不同浓度的质量控制血清，两种分离剂的结果彼此吻合。
Claims (4)
1、一种聚丙烯醛磁性微颗粒免疫分离剂，由磁核、包裹在磁核表面的高分子聚合物薄层和化学交联在薄层表面的抗体组成，其特征是可用作免疫分析的分离剂。
2、一种制备权利要求1所述的分离剂的方法，该分离剂的高分子聚合物薄层是磁核在含有单体的水溶液中反应而包裹在磁核表面的，其特征是单体的组成为丙烯醛和第二单体，二者配比（体积）为9∶1-6∶4。
3、根据权利要求2所述的第二单体，其特征是成份为烯类羧酸。
4、根据权利要求2所述的磁核的制备方法，是Fe+++与Fe++的盐溶液中滴加碱沉淀而得，其特征是Fe+++盐与Fe++盐的克分子比为1.5-2.0∶1，碱与铁盐的克当量比为5-8∶1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 93102451 CN1076784A (zh) | 1993-03-10 | 1993-03-10 | 磁性微颗粒免疫分离剂及制备 |
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|---|---|---|---|
| CN 93102451 CN1076784A (zh) | 1993-03-10 | 1993-03-10 | 磁性微颗粒免疫分离剂及制备 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN1076784A true CN1076784A (zh) | 1993-09-29 |
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| CN 93102451 Pending CN1076784A (zh) | 1993-03-10 | 1993-03-10 | 磁性微颗粒免疫分离剂及制备 |
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|---|---|
| CN (1) | CN1076784A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100343670C (zh) * | 2001-12-21 | 2007-10-17 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 用于测量微阵列上磁性纳米粒子面密度的传感器和方法 |
| CN114236122A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-03-25 | 深圳市雅为泓源生物科技有限公司 | 试剂盒及其制备方法和应用 |
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1993
- 1993-03-10 CN CN 93102451 patent/CN1076784A/zh active Pending
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