CN107670028B

CN107670028B - 一种鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107670028B
Application number: CN201711180273.9A
Authority: CN
Inventors: 黄伟; 黎容红; 洪晓萍
Original assignee: Chongqing Gengshang Technology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Gengshang Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN107670028A

Abstract

本发明公开了一种鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗及其制备方法，该复合油乳佐剂疫苗由鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗、矿物质油佐剂和鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体采取三次乳化技术配制而成，为水包油包水(W/O/W)型乳浊液，成品稳定性好，制备操作简单，易于注射接种。该复合油乳佐剂疫苗实现了鸭疫里默氏菌灭活菌苗和其特异抗体相混而不相遇，免疫效果相加互补而无任何不良影响，成功解决了传统灭活菌苗的免疫空白期难题，实现了接种即产生有效免疫力的高效免疫效果。

Description

一种鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗及其制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏菌(Rimerella antipesttifer，RA)是鸭、鹅传染性浆膜炎的病原菌。2～5周龄鸭和10～25日龄鹅特别容易感染RA，发病率为100％，死亡率通常为30％～90％。用甲醛溶液灭活，加入氢氧化铝胶、蜂胶和矿物质油佐剂等疫苗佐剂制备的RA灭活疫苗对鸭、鹅传染性浆膜具有良好的预防效果。已知RA存在25个血清型，不同血清型的RA制备的灭活疫苗缺乏交叉免疫保护。早在2005年我国就批准了RA血清1型灭活油乳剂疫苗商品化生产，2010年又批准了RA血清1、2型二价灭活油乳剂苗的商品化。有了高效的疫苗，理论上鹅、鸭的传染性浆膜炎疫情应该被很好控制，我国鹅、鸭养殖实际情况如何呢？仅从近十年来我国各种文献广泛报道我国各地的浆膜炎发病，不难得出结论，现行的RA灭活油乳剂疫苗没能够有效控制鹅、鸭浆膜炎疫情。究其原因，调查发现，养殖场鸭、鹅传染性浆膜炎70％的病例发生于RA灭活油乳剂疫苗接种后的3～12天内。这段时间即使鸭、鹅对鸭疫里默氏菌最易感的日龄。使用说明书上显示，RA灭活油乳剂疫苗适宜免疫日龄为4～7日龄，免疫诱导期为14天。据此可以推算出，4日龄接种该种疫苗，最早在18日龄才能产生出有效免疫力。10～18日龄是鹅、鸭感染RA的易感日龄，即使接种了疫苗也会发病，这就是现有RA灭活疫苗使用上的瓶颈问题。

RA发病耐过鸭血清中含有可保护小鸭抵抗RA强毒攻击的保护性抗体，但该种耐过鸭血清不可能实现商品化生产。RA灭活疫苗多次免疫蛋鸡，其所产蛋的蛋黄中含有高效价的抗体，注射给药后，小鸭也对RA强毒攻击获得了抵抗力。经过测定，鸡抗RA的特异蛋黄抗体对易感小鸭的免疫保护期可达10天以上。众多研究证明，鸭、鹅对RA的易感日龄为10～35日龄。因此，鸡抗RA蛋黄抗体也不能对鸭、鹅生长期内的全程免疫保护。

由于RA灭活疫苗及鸡抗RA蛋黄抗体均不能给予鸭、鹅全程免疫保护，抗生素就被广泛应用于预防鸭、鹅传染性浆膜炎，导致抗生素在鸭、鹅养殖上大量使用，由此带来的耐药性问题及药物残留已然成为当今中国政府及民众非常担忧的食品安全问题，急需解决。

发明内容

技术问题：

1.抗鸭疫里默氏菌蛋黄抗体溶液注射后机体快速将其吸收入血，形成特异被动免疫效力，但其效力维持时间较短，为10～14天。鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗诱导鸭、鹅自身产生坚强的主动免疫力，其效力维持时间为1～3个月。遗憾的是，鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗在鸭、鹅免疫后存在10～14天的免疫空白期，4～7日龄接种该疫苗后免疫效力产生之前已经感染发病，发生免疫失败。由于鸭、鹅在10～35日龄时对鸭疫里默氏菌高度易感。因此，鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗和其高免蛋黄抗体单独应用时均不能保护鸭、鹅在易感日龄阶段不发生传染性浆膜炎。

2.鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗和其抗体的免疫保护作用可否实现相加互补？这正是本发明要解决的核心技术问题。鸭疫里默氏菌灭活菌苗也是免疫原，如果与其特异抗体相遇则会发生反应，生成抗原抗体复合物。这就会导致两者各自的免疫效力下降甚至消失。因此，鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗和其抗体的免疫保护作用要实现相加互补，必须解决鸭疫里默氏菌苗和其特异抗体隔离后相混合，避免相遇。这正是本发明解决技术的关键点。

3.鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗和其抗体的免疫保护作用要实现相加互补，必须实现先抗体后菌苗的程序释放，即抗体迅速入血发挥特异被动免疫保护作用，其效力维持时间正好填补菌苗诱导特异主动免疫所需的免疫空白期，且不影响菌苗的免疫效力。该程序释放技术是本发明要解决的另一个关键技术。

总之，本发明的目的在于提供了一种鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗及其制备方法，其解决的技术问题是将鸭疫里默氏菌抗体和其灭活菌苗隔离后相混，不会发生相遇反应，并程序化释放将各自免疫效力作用发挥最好，前者不会影响后者；实现鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的免疫效力相加互补，为鸭、鹅传染性浆膜炎病防控提供有效的疫苗，有效提高鸭的免疫力和存活率。

为实现以上发明的目的，采用以下实施方案：

在一实施方案中，本发明的一种鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗，由含有包含鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗的免疫原相、含有矿物质油佐剂的油相和含有鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体的抗体相组成，其中，免疫相和抗体相被油相完全隔离，免疫原相在内层，油相在中间体，抗体相在外周层，其特征在于：

免疫原相中含有2.0～4.0％w/v的乳化剂，

油相中含有白油92～96％v/v、乳化剂4～8％v/v和稳定剂0.5～4％w/v，或者油相为矿物质油佐剂Montanide ISA 7VG，

抗体相中含有乳化剂0.3～3.8％w/v。

上述本发明的复合油乳剂疫苗，所述乳剂为水包油包水乳液，其中，免疫原相占15.25～31.67％v/v、油相占40.67～71.25％v/v和抗体相占5.0～39.0％v/v。

上述本发明的复合油乳剂疫苗，免疫原相和抗体相中的乳化剂选自HLB值9.6～16.7的吐温系列中的任一种，优选吐温80。油相中的乳化剂选自HLB值为1.8～6.7的司班(Span)或Arlacel中的任一种，优选司班(Span)80，或者所述油相包括选自Montanide ISA系列中的一种的油相佐剂，优选为MONTANIDE ISA 71VG。

在另一实施方案中，本发明提供了一种制备鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗的方法，包括如下步骤：

1)菌苗的制备：取鸭疫里默氏菌血清1、2型生产菌种分别接种LB肉汤37℃以180～220转/min振荡培养12～18h制备种子液，按种子液加入比例为2-6％进行扩大培养，收获A₅₂₅为2.0±0.2时的菌液，加入含量37％～40％的甲醛溶液使其终浓度为0.15％～0.3％，37℃灭活16h～24h，等量混合两种血清型的灭活菌液，即为鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗；

2)免疫原相的制备：于步骤1)所得鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗溶液中加入乳化剂，使其终浓度为2.0～4.0％，混匀后即得免疫原相；

3)油相的制备：按照白油占92～96％v/v、乳化剂占4～8％v/v和稳定剂占0.5％～4％(w/v)比例混合，灭菌，混匀，即得油相；

4)抗体相的制备：鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制鸡蛋黄抗体，琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:16～64(4log2～6log2)，加入乳化剂，使其终浓度为0.3～3.8％，振摇混匀，即为抗体相；

5)复合油乳剂疫苗的制备：按体积百分比计，含鸭疫里默氏菌血清1、2型二价菌苗的免疫原相占15.25％～31.67％、油相占40.67％～71.25％、含鸭疫里默氏菌血清1、2型精制鸡蛋黄抗体的抗体相占5.0％～39.0％，经过三效次乳化技术：将免疫原相与油相搅拌均质后，再加入抗体相制成水包油包水型乳液，即得鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗。

在上述另一实施方案中，本发明的制备鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗的方法，步骤1)中，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型生产菌种，为自然发病鸭、鹅分离的符合血清型要求的任一免疫原性好的菌株，优选为从鸭分离的血清1型的SC株和血清2型的AF株；步骤1)中，所述鸭疫里默氏菌生产菌种扩大培养条件为220转/min，培养16h；所述鸭疫默氏菌血清1、2型菌液灭活条件优化为甲醛终浓度为0.2％，振摇转速为180转/min,灭活16h。

在上述另一实施方案中，本发明的制备鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗的方法，步骤2)和4)中，所述乳化剂为亲水型乳化剂中HLB值9.6～16.7的吐温系列中的任一种，优选吐温(Tween)80，其在免疫原相中的终浓度为2％。步骤3)中，所述的矿物质油选自精制白油10号、进口白油和植物油中的任一种，或者所述油相为MONTANIDE^TM ISA 71VG；所述乳化剂为亲油性乳化剂HLB值为1.8～6.7的司班或Arlacel中的任一种，优选司班80。

优选的，上述本发明的方法，步骤3)中，所述油相中各组分的百分比为：白油94％v/v、乳化剂6％v/v、硬脂酸铝2％w/v。

优选的，上述本发明的方法，步骤4)中，所述的鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体为含有鸭疫里默氏菌血清1、2型高效价抗体的鸡、鸭、鹅蛋中提取的无脂类和无病毒、细菌微生物的精制蛋黄抗体中的任一种，所述的鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体为注射液、冻干和无菌粉中的任一种；所述琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:32(5log2)。

优选的，上述本发明的方法，步骤4)中，所述抗体相中乳化剂的终浓度为0.3％。步骤5)中，所述水包油包水型乳液中，免疫原相、油相和抗体相的体积百分比为20.33％、40.67％和39％；所述三次乳化技术为，第一次乳化，免疫原相加入油相中，匀浆机转速初期6500转/min，免疫原相加毕，匀浆机转速为24000转/min，搅拌时间为5min；第二次乳化，再加入抗体相，匀浆机转速6500转/min搅拌30秒；第三次乳化，颠倒罐体频率为20次～30次/min，时间为3min～5min；所制得的复合油乳佐剂疫苗为水包油包水型(w/o/w)乳白色乳浊液，其常规检测指标包括滴于水面呈云雾状扩散，10mL样品经3000转/min离心15min后下层澄明液体量小于等于2.2mL，即为合格产品。

在一具体实施方案中，本发明的一种制备鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗的方法，包括以下步骤：

1)菌苗的制备：取鸭疫里默氏菌血清1、2型菌种，分别接种兔血巧克力LB琼脂平板，37℃培养16□24h，纯碎检验和血清型检测合格，挑单个菌落接种LB肉汤，以180～220转/min振荡培养12～18h制备成种子液。按种子液加入比例为2％□6％进行扩大培养，收获A₅₂₅为2.0±0.2时的菌液，加入终浓度为0.15％～0.3％的甲醛溶液(含量37％～40％)，密封瓶口，37℃振摇(转速为160～180转/min)灭活16h□24h，无菌检验合格即得鸭疫里默氏菌的灭活菌苗。将鸭疫里默氏菌血清1、2型的灭活菌液等量混合即制成鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗；

2)免疫原相的制备：于步骤1)所制得的鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗溶液中加入乳化剂，使其终浓度为2.0％～4.0％，振摇混匀，即得免疫原相。

3)油相的制备：按照精制白油(10号)或进口白油占92％～96％、乳化剂占4％～8％和稳定剂占0.5％～4％(w/v)比例混合，121℃高压灭菌20min，振摇混匀，即得油相；

4)抗体相的制备：鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体溶液，需无脂类、无菌及病毒等微生物检验合格，用鸭疫里默氏菌血清1、2型抗原测定其琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:16～64(4log2～6log2)，加入乳化剂，使其终浓度为0.3％～3.8％，振摇混匀，即为抗体相；

5)复合油乳佐剂疫苗的制备：按体积计，鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗中，用鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗制得的免疫原相占15.25％～31.67％、矿物油佐剂制备的油相占40.67％～71.25％、鸭疫里默氏菌血清1、2型精制鸡蛋黄抗体制备的抗体相占5.0％～39.0％。采取三次乳化技术，将免疫原相、油相和抗体相加工制成水包油包水型(w/o/w)乳浊液，即得鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤1)中，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型菌种，为自然发病鸭、鹅分离的符合血清型要求的免疫原性好的任一菌株，优选为从病死鸭分离的血清1型的SC株和血清2型的AF株；所述鸭疫里默氏菌菌种的扩大培养条件优选为振荡培养转速为220转/min，时间为16h；鸭疫默氏菌血清1、2型菌液灭活条件优化为甲醛终浓度为0.2％，振摇转速为180转/min,灭活时间为16h。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤2)和4)中，所述亲水型乳化剂为HLB值9.6～16.7的吐温(Tween)系列中的任一种，优选吐温(Tween)80，其在免疫原相中的终浓度优化为2％。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤3)中，所述矿物质油为精制白油(10号)、进口白油的任一种，还包括植物油，所述油相为矿物质油和植物油配制的油相，具体选自商品化油佐剂ONTANIDE^TM ISA系列中的任一种，如：MONTANIDE^TM ISA 71VG；所述亲油性乳化剂为HLB值1.8～6.7的司班(Span)或Arlacel中的任一种，优化为司班(Span)80，优选的，所述油相各组分的配合比优选为精制白油(10号)或进口白油94％(v/v)、乳化剂6％(v/v)、硬脂酸铝2％(w/v)。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤4)中，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体为含有鸭疫里默氏菌血清1、2型高效价抗体的鸡、鸭、鹅蛋中提取的无脂类和无病毒、细菌等微生物的精制蛋黄抗体中的任一种；所述鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体的形态为注射液、冻干剂和无菌粉针剂中的任一种。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤4)，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体效价的检测方法中，使用的检测抗原为超声波法、高压裂解法及热酚法制备的抗原中的任一种，优选为热酚法制备的多糖类物质抗原，琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:32(5log2)；所述抗体相中乳化剂的终浓度优化为0.3％。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤5)中，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗制备的免疫原相、矿物油乳佐剂的油相和鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体制备的抗体相的配合比例优化为20.33％、40.67％和39％(v/v)；所述三次乳化条件优化为，第一次乳化，匀浆机转速初期6500转/min，免疫原相加毕后调至24000转/min以上，搅拌时间为5min；第二次乳化，匀浆机转速6500转/min，搅拌30秒；第三次乳化，颠倒罐体，频率为20次～30次/min，时间为3min～5min；所得的复合油乳佐剂疫苗为水包油包水型(w/o/w)乳白色乳浊液，其常规检测指标包括滴于水面呈云雾状扩散，10mL样品经3000转/min离心15min后下层澄明液体小于等于2.2mL即为合格产品。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤5)中，所述鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗成品可进一步区分为稳定乳浊液和短期稳定乳浊液中的任一种；鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗成品中的一种为稳定乳浊液，系指其4～8℃或室温保存时无分层现象，给动物注射接种时无需振摇混匀，成品中的另一种为短期稳定乳浊液，系指4～8℃或室温放置3h以后将出现分层现象，上层为乳白色乳液，下层为浑浊不透明液体逐渐变为澄清透明的水溶液。该种成品经过振摇1min后3h内呈均匀乳白色乳浊液状，无分层现象，可以确保其在给动物注射接种期间的均匀性。换言之，该种类型的鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗临用时必须振摇混匀。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，步骤5)中所述鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗成品可进一步区分为稳定乳浊液和短期稳定乳浊液中的任一种。所述成品的短期稳定乳浊液，4～8℃或室温保存后分为上下两层，上层为乳白色乳液，下层液体初为浑浊不透明，逐渐变为澄清透明的水溶液。该种短期稳定乳液经过振摇1min后，在3h内呈均匀乳白色乳浊液。因此，该种成品使用时必须振摇混匀。

附图说明

图1：鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗制造工艺流程示意图；

图2：鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗成品两种物理外观性状。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐明和理解本发明的精神实质，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1鸭疫里默氏菌复合乳剂疫苗的制备

(制备工艺流程图见图1)

1)菌苗的制备：取鸭疫里默氏菌血清1型的SC株和血清2型的AF株生产菌种，分别接种于兔血巧克力LB平板，37℃培养24～36h，纯碎检查合格后，挑取单个菌落接种于5mL的LB肉汤，37℃以220转/min振摇培养16h，纯碎检验合格后为种子液。按照种子液加入比例为4％，进行500mL扩大培养，待菌液A₅₂₅为2.0±0.2时，加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(含量37％～40％)，密封瓶口。置转速180/min，37℃振荡灭活16h，无菌检验合格，将SC株和AF株灭活菌液等量混合，即为鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗。

2)免疫原相的制备：于上述1)所得灭活菌苗中加入无菌吐温(Tween)80，使其终浓度为2.0％(体积浓度v/v)。振摇混匀，即为免疫原相。

3)油相的制备：取进口白油470mL，司班8030mL，硬脂酸铝10g，加入500mL规格盐水瓶中，121℃高压灭菌20min，振摇混匀，即为油相；

4)抗体相的制备：采取辛酸法提取鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制鸡蛋黄抗体，无菌和病毒检测合格，热酚法制备的鸭疫里默氏菌血清1、2型抗原测定琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:16(4log2)，加入无菌吐温(Tween)80，使其终浓度为0.3％(v/v)，振摇混匀后即为抗体相。

5)复合油乳剂疫苗的制备：按体积百分计，鸭疫里默氏菌血清1、2型二价菌苗制备的免疫原相、矿物油佐剂制备的油相和鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体制备的抗体相配合比例为20.33％、40.67％和39％。按照无菌操作，先将油相120mL加入匀浆机的乳化罐中，调转速至6500r/min，边搅拌边缓慢加入免疫原相60mL，加毕，调高转速至21500r/min，乳化3min，停机，此为第一次乳化。取第一次乳化产品61mL加入另一个无菌乳化罐中，加入抗体相39mL。启动匀浆机，转速调为6500r/min，乳化时间为30秒得到乳液，停机，此为第二次乳化。将乳液倒入100mL无菌盐水瓶中，反口胶塞密封瓶口。静置1h后，将瓶颠倒混匀3min，频率大约为20次～30次/min。取样检验，合格即得含有鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗，见图2。

6)上步所得的鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗免疫攻毒试验。10日龄非免鸭，分为8个组，每组11只。鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗注射剂量为0.5mL/只，鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活油乳佐剂疫苗注射剂量为0.3mL/只，鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体注射剂量为0.2mL/只,疫苗或抗体采取腿部肌内注射，攻毒剂量为200LD50。攻毒后连续观察7天。结果见表1.

7)步骤5)所得鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗免疫效力，采取同源菌株攻毒，试验结果详见表2。

从表1的数据可见，鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂苗免疫后7天以发病率统计的相对保护率(RPR)达到了81.8％，比传统的鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗组的54.5％增加了27.3个百分点。免疫后18天，鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗组和传统的鸭疫里默氏菌灭活油乳剂苗组的相对保护率均为100％。而单独的鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体组相对保护率为36.4％。结果显示，本发明的鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳剂疫苗中的抗体自然消失，并没有影响菌苗的主动免疫效力。表2为鸭疫里默氏菌血清2型同源菌株的攻毒试验结果，显示与上述类似的效果。

表1鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗免疫鸭后用血清1型同源菌株攻毒试验结果

§发病数或死亡数/接种动物数，

发病率计算的相对保护率/死亡率计算的相对保护率。RPR(Relative protection rate的缩写)，即相对保护率，计算公式为(对照组发病或死亡率-试验组发病或死亡率)/对照组发病或死亡率*100。表2鸭疫里默氏菌灭活菌苗和抗体的复合油乳佐剂疫苗免疫鸭后用血清2型同源菌株攻毒结果

§发病数或死亡数/接种动物数，

发病率计算的相对保护率/死亡率计算的相对保护率。RPR(Relative protection rate的缩写)，即相对保护率，计算公式为(对照组发病或死亡率-试验组发病或死亡率)/对照组发病或死亡率*100。

本发明不限于上述实施案例，采用与本发明上述实施案例相同或其他血清型的菌种及配方，在不偏离本发明精神实质范围内均属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗，由含有包含鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗的免疫原相、含有矿物质油佐剂的油相和含有鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体的抗体相组成，其中，免疫相和抗体相被油相完全隔离，免疫原相在内层，油相在中间体，抗体相在外周层，其特征在于：所述乳剂为水包油包水体系，其中，免疫原相占15.25～31.67％v/v、油相占40.67～71.25％v/v和抗体相占5.0～39.0％v/v；

其中，免疫原相中含有2.0～4.0％w/v的乳化剂，油相中含有白油92～96％v/v、乳化剂4～8％v/v和稳定剂0.5～4％w/v，或油相为商品化矿物油佐剂MONTANIDE TMISA 71VG，抗体相中含有乳化剂0.3～3.8％w/v。

2.如权利要求1所述的复合油乳剂疫苗，免疫原相和抗体相中的乳化剂选自HLB值9.6～16.7的吐温系列中的任一种。

3.如权利要求2所述的复合油乳剂疫苗，免疫原相和抗体相中的乳化剂为吐温80。

4.如权利要求1所述的复合油乳剂疫苗，油相中的乳化剂选自HLB值为1.8～6.7的司班或Arlacel中的任一种。

5.如权利要求1所述的复合油乳剂疫苗，油相中的乳化剂为司班(Span)80。

6.如权利要求1所述的复合油乳剂疫苗，所述油相为MONTANIDE ISA 71VG。

7.一种制备鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗的方法，包括如下步骤：

1)菌苗的制备：取鸭疫里默氏菌血清1、2型生产菌种分别接种LB肉汤37℃以180～220转/min振荡培养12～18h制备种子液，按种子液加入比例为2-6％进行扩大培养，收获A ₅₂₅为2.0±0.2时的菌液，加入含量37％～40％的甲醛溶液使其终浓度为0.15％～0.3％，37℃灭活16h～24h，等量混合两种血清型的灭活菌液，即为鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗；

2)免疫原相的制备：于步骤1)所得鸭疫里默氏菌血清1、2型二价灭活菌苗溶液中加入乳化剂，使其终浓度为2.0～4.0％v/v，混匀后即得免疫原相；

3)油相的制备：按照白油占92～96％v/v、乳化剂占4～8％v/v和稳定剂占0.5％～4％w/v比例混合，灭菌，混匀，即得油相；

4)抗体相的制备：鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制鸡蛋黄抗体，琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:16～64，加入乳化剂，使其终浓度为0.3～3.8％，振摇混匀，即为抗体相；

5)复合油乳剂疫苗的制备：按体积百分比计，含鸭疫里默氏菌血清1、2型二价菌苗的免疫原相占15.25～31.67％、油相占40.67～71.25％、含鸭疫里默氏菌血清1、2型精制鸡蛋黄抗体的抗体相占5.0～39.0％，经过三次乳化技术：将免疫原相与油相搅拌均质后，再加入抗体相制成水包油包水型乳液，即得鸭疫里默氏菌复合油乳剂疫苗。

8.如权利要求7所述的方法，步骤1)中，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型生产菌种，为自然发病鸭、鹅分离的符合血清型要求的任一具有免疫原性的菌株。

9.如权利要求8所述的方法，步骤1)中，所述鸭疫里默氏菌血清1、2型生产菌种为从鸭分离的血清1型的SC株和血清2型的AF株。

10.如权利要求7所述的方法，步骤1)中，所述鸭疫里默氏菌生产菌种扩大培养条件为220转/min，培养16h。

11.如权利要求7所述的方法，步骤1)中，所述鸭疫默氏菌血清1、2型菌液灭活条件优化为甲醛终浓度为0.2％，振摇转速为180转/min,灭活16h。

12.如权利要求7所述的方法，步骤2)和4)中，所述乳化剂为吐温80，其在免疫原相中的终浓度为2％。

13.如权利要求7所述的方法，步骤3)中，所述的白油选自精制白油10号和进口白油中的任一种。

14.如权利要求7所述的方法，步骤3)中，所述油相为商品化油佐剂MONTANIDE TMISA71VG。

15.如权利要求7所述的方法，步骤3)中，所述乳化剂为司班80。

16.如权利要求7所述的方法，步骤3)中，所述油相中各组分的百分比为：白油94％v/v、乳化剂6％v/v、硬脂酸铝2％w/v。

17.如权利要求7所述的方法，步骤4)中，所述的鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体为含有鸭疫里默氏菌血清1、2型高效价抗体的鸡、鸭、鹅蛋中提取的无脂类和无病毒、细菌微生物的精制蛋黄抗体中的任一种。

18.如权利要求7所述的方法，步骤4)中，所述的鸭疫里默氏菌血清1、2型二价精制蛋黄抗体为注射液、冻干和无菌粉中的任一种。

19.如权利要求7所述的方法，步骤4)中，所述琼脂免疫扩散试验抗体效价为1:32。

20.如权利要求7所述的方法，步骤4)中，所述抗体相中乳化剂的终浓度为0.3％。

21.如权利要求7所述的方法，步骤5)中，所述水包油包水型乳液中，免疫原相、油相和抗体相的体积百分比为20.33％、40.67％和39％。

22.如权利要求7所述的方法，步骤5)中，所述三次乳化技术为，第一次乳化，免疫原相加入油相中，匀浆机转速初期6500转/min，免疫原相加毕，匀浆机转速为24000转/min，搅拌时间为5min；第二次乳化，再加入抗体相，匀浆机转速6500转/min搅拌30秒；第三次乳化，颠倒罐体频率为20次～30次/min，时间为3min～5min。

23.如权利要求7所述的方法，步骤5)中，所述复合油乳佐剂疫苗为水包油包水型乳白色乳浊液，其常规检测指标包括滴于水面呈云雾状扩散，10mL样品经3000转/min离心15min后下层澄明液体量小于等于2.2mL。