CN107661510B - 甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物及制备方法 - Google Patents
甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及荧光成像剂,具体为甲氧基氟硼吡咯‑核酸‑四氧化三铁复合物及合成方法。以DNA40‑1和DNA40‑1D小分子核酸(DNA)为模版,合成了一种新型荧光DNA‑Fe3O4纳米颗粒。合成的一种新型荧光DNA‑Fe3O4纳米颗粒;纳米颗粒的大小为2‑8nm;它的水溶液显示暗黄色,用500nm绿光激发,540nm处有荧光发射,说明该甲氧基氟硼吡咯@核酸‑四氧化三铁复合物是一种灵敏的荧光成像剂。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像剂,具体为甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物及合成方法,属于核酸纳米材料的制备与运用方面,具体在于报道了一种新型核酸-四氧化三铁复合物颗粒搭载甲氧基氟硼吡咯并将其应用于乳腺癌癌细胞成像。
背景技术
癌症早已被列入到威胁人们生活质量与身体健康的恶性疾病的行列,如果得到及时的治疗,治愈的机会还是非常可观的。癌症是人体免疫***自身无法识别的异物,一般从组织器官的中心开始生长蔓延扩散。早期癌细胞中生物标志物的浓度较低,并且不易探测。在世界范围内,乳腺癌的发病率高居女性恶性肿瘤的第一位,乳腺癌不仅是女性最常见的恶性肿瘤,也是导致女性发病死亡的重要原因之一[Tome LA,Siegel RL,Ward EM,etal.Global Cancer Incidence and Mortality Rates and Trends--An Update[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2016,25:16-27.]。因此实现对乳腺癌的早期诊断与治疗,对提高乳腺癌患者的治愈率具有极其重要的作用。目前,B超和MRI都普遍用于对乳腺癌的影像检测,但都有各自的局限性。[Ali S,Mondal N,Choudhry H,et al.CurrentManagement Strategies in Breast Cancer by Targeting Key Altered MolecularPlayers[J].Front Oncol,2016,6:45.]纳米生物技术,如药物载体、生物传感器和纳米成像技术等,在疾病的诊断与治疗中有着重要作用。BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4,作为一种新型的荧光纳米材料,基于它合成方法简单、颗粒小、良好的稳定性、生物兼容性和低毒性,在细胞成像成像领域具有极大的潜力。双链DNA(dsDNA)负载磁性Fe3O4纳米颗粒表面带正电荷,且具有极大的比表面积,这对后期的进一步设计与应用埋下了伏笔。同时双链DNA(dsDNA),其富含-GC-碱基对可以用于药物搭载和传输。[Juan L,Tuo W,et al.Multifunctionalaptamer-based nanoparticles for targeted drug[J].Biomaterials 91(2016)44-56.]。总之,这种功能性BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4纳米复合物为纳米载体的设计提供了新的思路和方法,在癌细胞的早期检测,药物输送与治疗方面具有极大的潜力。
发明内容
我们以一种序列为DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸(DNA)为模版,上述核酸购自上海生工生物工程有限公司,合成了一种新型荧光DNA-Fe3O4纳米颗粒(标记为BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4);纳米颗粒的大小为2-8nm;它的水溶液显示暗黄色,用500nm绿光激发,540nm处有荧光发射,说明该甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁复合物(BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4)是一种灵敏的荧光成像剂,由图2可见该BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4能够对MCF-7(乳腺癌)细胞进行荧光成像。
新型荧光DNA-Fe3O4纳米复合物(BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4)的合成反应过程如下:分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液(10mM)混合于柠檬酸钠缓冲液中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和1800-2300μM(最佳为2000μM),再将DNA40-1D、维生素C溶液(10mM)和硫酸亚铁铵溶液(10mM)混合于柠檬酸钠缓冲液中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和1000-1500μM(最佳为1110μM);然后分别将以上两种混合溶液转至水浴加热,温度升到60-70℃(最佳为DNA的Tm值67℃)后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入氨水(pH=12),转移至摇床震荡10min-120min(最佳为30min)后,缓慢降温到室温,降温时间为4-6h(最佳为5h);最后在上述溶液中滴入维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入96μL甲氧基氟硼吡咯溶液(1mM),其中甲氧基氟硼吡咯物质的量为DNA40-1物质的量的7.5倍,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
所述的柠檬酸钠缓冲液的pH值为9.0,浓度为10mM。
一号混合液、二号混合液、氨水、滴入的维生素C的体积之比为1014:946:20:20。
反应液的最终体积为2mL。
本发明的优点:
本发明基于小分子核酸序列5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'设计新型甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁,结果表明制备的新型甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁能够很好地对MCF-7(乳腺癌)细胞进行荧光成像;本发明是国际上首次基于小分子核酸5'-GAGGAG-3'序列能够很好地与Fe3+/Fe2+结合的原理,并将其用于合成核酸-四氧化三铁纳米复合物,同时搭载上甲氧基氟硼吡咯,得到了一种新型的稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁纳米复合物,并很好地实现了对MCF-7(乳腺癌)细胞的荧光成像,这是一种方便、快捷、直观、经济的成像方法,该方法也为进一步研究和***细胞提供了理论上和技术上的支撑。
附图说明
图1为BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4的透射电镜图。
图2为BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4对MCF-7(乳腺癌)细胞的荧光成像图。
具体实施方式
试剂和原料
反应中所用的溶剂皆为分析纯,所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理;一水合柠檬酸钠,六水合硫酸亚铁按,六水合三氯化铁,氢氧化钠,维生素C购于国药集团化学试剂有限公司,DNA序列(上海生工生物工程有限公司)。
紫外可见分光光度仪(日本岛津UV-2450型),190-800nm;Carry Eclipse荧光分光光度计(美国瓦里安有限公司);傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司Nicolet Nexus470);milli-q系列超纯水***(Millipore);美国美瑞泰克公司HRC-10便携式近红外光拉曼光谱仪;JEM-200CX型透射电镜(日本电子株式会社);Jasco-810圆二色谱仪(日本分光公司);DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱(上海—恒科技有限公司);DZF-6051型真空干燥箱(上海—恒科技有限公司);TopPette手动单道可调式移液枪(10-100μL)和TopPette手动单道可调式移液枪(20-200μL);PHS-3C酸度计(上海第二分析仪器厂);恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限公司)。
化合物的合成方法:
实施案例1(最佳合成条件):
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和和1110μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到67℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡30min后,缓慢降温到室温,降温时间为5h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例2:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=5,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=5,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、2000μM和和2000μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到70℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡2h后,缓慢降温到室温,降温时间为6h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例3:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=7,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=7,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、2000μM和2000μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到70℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡2h后,缓慢降温到室温,降温时间为6h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例4:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=10,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=10,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、2000μM和2000μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到70℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡2h后,缓慢降温到室温,降温时间为6h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例5:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和1110μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到70℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡2h后,缓慢降温到室温,降温时间为5h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例6:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和1110μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到65℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡2h后,缓慢降温到室温,降温时间为4h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例7:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和1110μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到67℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡15min后,缓慢降温到室温,降温时间为5h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
实施案例8:
分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3+的浓度分别为6.4μM和2000μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液(pH=9,10mM)中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和1110μM;然后分别将以上两种混合溶液转到水浴加热,温度升到67℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入20μL氨水(pH=12),转移至摇床震荡1h后,缓慢降温到室温,降温时间为5h;最后在上述溶液中滴入20μL维生素C(10mM)溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4纳米复合物的颗粒大小为2-8nm,如图1所示。
BODIPY-OCH3@DNA-Fe3O4实现了对MCF-7(乳腺癌)细胞的荧光成像,如图2。
5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'
5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'
Claims (7)
1.甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,所述甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物为纳米颗粒,纳米颗粒的大小为2-8nm;复合物的水溶液显示暗黄色,用500nm绿光激发,540nm处有荧光发射,是一种灵敏的荧光成像剂,能够对乳腺癌细胞进行荧光成像,其特征在于,制备方法具体步骤如下:分别以DNA40-1:5'-GAGGAGACAACAACAGCGCGCGC-3'和DNA40-1D:5'-GCGCGCGCACAACAACAGAGGAG-3'的小分子核酸为模版,将DNA40-1和三氯化铁溶液混合于柠檬酸钠缓冲液中,得到一号混合液,DNA40-1与Fe3 +的浓度分别为6.4μM和1800-2300μM,再将DNA40-1D、维生素C溶液和硫酸亚铁铵溶液混合于柠檬酸钠缓冲液中,得到二号混合液,DNA40-1D与、维生素C与Fe2+的浓度分别为6.4μM、1000μM和1000-1500μM;然后分别将以上两种混合溶液转至水浴加热,温度升到60-70℃后稳定三分钟,迅速将一号和二号混合液混合均匀,迅速滴入氨水,转移至摇床震荡10min-120min后,缓慢降温到室温,降温时间为4-6h;最后在上述溶液中滴入维生素C溶液,混匀于室温避光保存5min后转到4℃避光保存4h,然后滴入甲氧基氟硼吡咯溶液,其中甲氧基氟硼吡咯物质的量为DNA40-1物质的量的7.5倍,作用3h后置于DMSO溶剂中透析3h,在置于超纯水中透析12h;浓缩之后即可得到稳定的甲氧基氟硼吡咯@核酸-四氧化三铁。
2.如权利要求1所述的甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,其特征在于:所述的柠檬酸钠缓冲液的pH值为9.0,浓度为10mM。
3.如权利要求1所述的甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,其特征在于:一号混合液中,Fe3+的浓度为2000μM。
4.如权利要求1所述的甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,其特征在于:二号混合液中,Fe2+的浓度为1110μM。
5.如权利要求1所述的甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,其特征在于:水浴加热温度为67℃。
6.如权利要求1所述的甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,其特征在于:所述氨水的pH值为12,滴入的维生素C溶液浓度为10mM,甲氧基氟硼吡咯溶液的浓度为1mM,一号混合液、二号混合液、氨水、维生素C溶液的体积比1014:946:20:20。
7.如权利要求1所述的甲氧基氟硼吡咯-核酸-四氧化三铁复合物的制备方法,其特征在于:震荡时间为30min;降温时间为5h。
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