CN107655871A - 一种阿仑膦酸钠的高灵敏宽检测范围荧光检测新方法 - Google Patents

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CN107655871A CN201710816613.6A CN201710816613A CN107655871A CN 107655871 A CN107655871 A CN 107655871A CN 201710816613 A CN201710816613 A CN 201710816613A CN 107655871 A CN107655871 A CN 107655871A
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Abstract

本发明提供了一种阿仑膦酸钠的高灵敏度宽检测范围荧光检测新方法，先利用铜离子对寡聚核苷酸‑荧光银纳米簇中银纳米簇的猝灭作用，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离寡聚核苷酸‑荧光银纳米簇，从而使银纳米簇的荧光恢复，通过监测阿仑膦酸钠浓度对铜离子介导的DNA‑AgNCs复合探针的荧光强度的改变，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠含量所做标准曲线计算阿仑膦酸钠含量。本发明方法适用于样品（药物制剂或生物样品如尿样、血清样本等）中阿仑膦酸钠含量的检测，具有宽线性范围、高灵敏度、少干扰，省时、绿色安全等优点，适合大规模推广。

Description

一种阿仑膦酸钠的高灵敏宽检测范围荧光检测新方法
技术领域
本发明涉及阿仑膦酸钠荧光检测，具体涉及一种阿仑膦酸钠的高灵敏宽检测范围荧光检测新方法。
背景技术
阿仑膦酸钠(Alendronate sodium，ALDS)，化学名为(4-氨基-1-羟基亚丁基)二膦酸单钠盐三水合物，是第三代氨基二膦酸盐类骨吸收抑制剂。阿仑膦酸钠与骨内羟基磷灰石有很强亲和力，能进入骨基质羟基磷灰石晶体中抑制破骨细胞活性，并通过成骨细胞间接抑制骨吸收，临床上主要用于治疗骨质疏松症和变形性骨炎。由于阿仑膦酸钠的分子结构中含有两个膦酸基团，极性强，易电离，无发色基团，因而不能直接用常规的紫外检测器或荧光检测器测定该药物含量。现行的国家标准(WS1-(X-312)-2004Z[18])中阿仑膦酸钠片含量采用测量误差较大的钼蓝比色法，不利于控制药品的质量。李赟等人在《药学与临床研究》杂志报道了Cu2+络合反相离子对色谱-紫外检测法测定阿仑膦酸钠片的含量，但该方法需要将阿仑膦酸钠与Cu2+剧烈振摇40min后形成较好的复合物，而且灵敏度差，检测线性范围较窄，不适用于生物样品的检测。另有文献报道采用高效液相色谱法来检测药物制剂或生物样品中阿仑膦酸钠的含量，由于阿仑膦酸钠不具有生色基团，需要先用邻苯二甲醛、重氮甲烷、氯甲酸芴等衍生剂经过衍生化生成紫外吸收基团，该方法需要经过繁琐的固相萃取过程，操作复杂，同时重氮甲烷具有***性和毒性，存在安全隐患。因此，开发操作简便、快速、灵敏度高、检测线性范围更广的阿仑膦酸钠检测新方法具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种阿仑膦酸钠的荧光检测新方法，该方法操作简单，且灵敏度高、检测范围宽。
本发明的目的是这样实现的：
一种阿仑膦酸钠的荧光检测方法，其特征在于：先利用铜离子(Cu2+)猝灭寡聚核苷酸稳定的银纳米簇(以下简称DNA-AgNCs)的荧光，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子通过配位结合形成复合物使得铜离子远离DNA-AgNCs探针，从而使DNA-AgNCs的荧光恢复，其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度呈线性关系，做标准曲线计算样品中阿仑膦酸钠的含量。
本发明阿仑膦酸钠的检测方法，其特征在于：将Cu2+、DNA-AgNCs、含阿仑膦酸钠的样品在PB缓冲液中反应，反应结束后在荧光分光光度计上扫描200-800nm的最大激发波长与最大发射波长，同时做空白试验；根据最大激发波长下，最大发射波长处的荧光强度变化与阿仑膦酸钠标准品浓度所做的标准曲线，即可算出样品中阿仑膦酸钠的含量。
作为优化，上述阿仑膦酸钠的检测方法，其特征在于：将DNA-AgNCs、Cu2+、阿仑膦酸钠标准品在PB缓冲液中反应；所述Cu2+的浓度为25-1200nmol/L；所述PB缓冲液的pH为5.8-8.0。
作为进一步优化，上述阿仑膦酸钠的荧光检测方法，其特征在于：将DNA-AgNCs、Cu2+、阿仑膦酸钠标准品在PB缓冲液中反应；所述Cu2+的浓度为500-1200nmol/L；所述PB缓冲液的pH为7.0-8.0。
作为更进一步优化，上述阿仑膦酸钠的荧光检测方法，其特征在于，采用如下步骤：先将阿仑膦酸钠标准品加入到Cu2+(800nmol/L)和PB缓冲液(pH 7.4)混合溶液中混匀，室温下静置15min；然后再加入DNA-AgNCs混匀，室温下静置20min；之后在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605-750nm的荧光发射光谱，以最大发射波长640nm处的荧光强度进行定量，同时做空白试验；所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：
Y＝0.02382X+1.086(标准曲线方程)
式中：
Y为相对荧光强度(F/F0，其中F表示有阿仑膦酸钠时的荧光强度，F0表示没有阿仑膦酸钠时的荧光强度)；X为阿仑膦酸钠标准品的浓度(单位：μmol/L)。
一种阿仑膦酸钠的荧光检测方法，包括空白试验、样品检测及计算结果步骤，其特征在于：
(1)空白试验：
在1.5mL离心管中依次加入40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH 7.4)与40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605-750nm的荧光强度，测定最大发射波长640nm处的荧光强度作为F0；
(2)样品测定：
在1.5mL离心管中依次加入40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH 7.4)与40μL含阿仑膦酸钠的样品溶液涡旋混匀，静置15min，再加入40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605-750nm的最大荧光强度，测定最大发射波长640nm处的荧光强度F；
(3)计算结果
所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：
Y＝0.02382X+1.086(标准曲线方程)
式中：
Y为相对荧光强度(F/F0)；X为阿仑膦酸钠的浓度(单位：μmol/L)。本发明所述原料及试剂均为市售产品。本发明PB(Phosphate Buffer)缓冲液为本领域所熟知的磷酸盐缓冲液。本发明DNA-AgNCs的合成方法为：将DNA溶液中加入AgNO3溶液，在PB缓冲液中涡旋混匀，避光孵育，再加入与AgNO3等摩尔浓度的NaBH4溶液反应制得DNA-AgNCs。本发明中寡聚核苷酸作为制备荧光银纳米簇的模板，它的序列为5’-GGC AGG TTG GGG TGA CTA AAA ACC CTTAAT CCC C-3’(Zhang,P.,Wang,Y.,Chang,Y.,Xiong,Z.H.,Huang,C.Z.,2013.BiosensBioelectron.49,433-437.)。
有益效果：
本发明先利用铜离子猝灭DNA-AgNCs的荧光，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离DNA-AgNCs探针，从而使探针荧光恢复，通过监测阿仑膦酸钠对铜离子介导的DNA-AgNCs探针的荧光强度的改变，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度所做标准曲线，建立了一种低背景信号、高信噪比、快速简便的荧光分析新方法，对样品中阿仑膦酸钠含量实现高灵敏、高选择性检测。本发明方法不仅适用于药物制剂和生物样品中阿仑膦酸钠含量的检测，而且片剂辅料和生物样品中其他可能共存的物质如尿素、淀粉、甘露醇、葡萄糖、钠离子、钙离子、镁离子、钾离子、硝酸根离子、硫酸根离子等干扰物质，对检测结果影响小，即使干扰物为阿仑膦酸钠浓度的100倍时其相对荧光强度也不会发生明显改变，方法实用性较强；尤其是样品中阿仑膦酸钠的浓度在0.0008-200μmol/L范围内时，阿仑膦酸钠含量与体系的荧光强度呈良好的线性关系(R2＝0.9920)，标准曲线方程为Y＝0.02382X+1.086。本发明方法用于阿仑膦酸钠片中阿仑膦酸钠的含量检测，RSD为0.70-1.3％，加标回收率为103.5-110.0％；用于尿样中阿仑膦酸钠含量检测，RSD为1.1-1.7％，加标回收率为90.90-98.80％；用于血清样本中阿仑膦酸钠含量检测，RSD为0.40-1.8％，其加标回收率为92.80-105.9％；可见本发明无论是用于药物制剂还是生物样品(如尿样、血清样本)中阿仑膦酸钠含量的检测，不仅精密度高而且具有很强的实用性。与现有技术相比，本发明方法用于阿仑膦酸钠含量的检测，操作简便，对技术人员要求相对较低；同时具有宽线性范围、高灵敏度、省时、绿色安全等优点，适合大规模推广。
附图说明
图1是DNA-AgNCs高分辨透射电镜图；
图2是DNA-AgNCs荧光激发和发射光谱图；
图3是不同浓度Cu2+对DNA-AgNCs荧光的猝灭图；
图4是不同pH值对荧光强度的影响；
图5是试剂的加入顺序对荧光强度的影响；
图6是阿仑膦酸钠使Cu2+-DNA-AgNCs复合探针的荧光恢复的光谱图；
图7是荧光恢复程度(以F/F0表示)相对于阿仑膦酸钠浓度所拟合的线性关系图；
图8是不同条件下的Zeta电位表征；
图9是不同干扰物质对荧光恢复程度(以F/F0表示)的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
仪器与材料
仪器
RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津)用于样品溶液荧光的测定；ZatasizerNano-ZEN3600(马尔文公司)用于Zeta电位的测定；MX-S涡旋混合仪(北京大龙有限公司)用来混匀溶液；BY-R18高速冷冻医用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)用于片剂、尿样、血清样品的离心；Sartorius电子天平(德国)用于样品的称量。
材料
寡聚核苷酸作为制备荧光银纳米簇的模板，它的序列为5’-GGC AGG TTG GGG TGACTA AAA ACC CTT AAT CCC C-3’(上海生工生物技术有限公司)；阿仑膦酸钠、硝酸银、硼氢化钠(美国Sigma-Aldrich)；硝酸铜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、甘露醇、可溶性淀粉、D-葡萄糖、尿素(上海阿拉丁试剂公司)；阿仑膦酸钠片(万特制药(海南)有限公司，批号：20160701；石家庄制药集团欧意制药有限公司，批号：152160601、152160603)；尿样、血清样本(重庆医科大学附属第一医院)；磷酸缓冲液(0.2mol/L)用于调节体系的酸度；所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水(18.2MΩ·cm)。
实施例1 DNA-AgNCs的合成与光谱测定
DNA储备液的配制
将DNA的冻干粉末于6000rpm离心10min，缓慢加入PB缓冲液(pH 6.6)31μL配制成100μmol/L的储备液，于4℃冰箱中保存，备用。
DNA-AgNCs的合成
于配置好的DNA溶液中以1:6摩尔比的量加入AgNO3溶液(18.6μmol/L)，在20mmol/L的PB缓冲液(pH 6.6)中涡旋混匀5min，避光孵育20min，再快速加入与AgNO3等摩尔浓度的NaBH4溶液(18.6mol/L)，置于4℃冰箱中保存，备用。
对合成的DNA-AgNCs进行高分辨透射电镜成像，透射电镜型号：Tecnai G2F20S-TWIN；测定条件：加速电压300kV。结果见图1，图1中a、b是不同放大倍率下DNA-AgNCs高分辨透射电镜成像图，从图a中可明显看出本发明合成的DNA-AgNCs是单个分散的、粒径均匀；从图b中可以看出DNA-AgNCs的大小均一，平均粒径为2.1nm±0.2nm。
DNA-AgNCs的光谱扫描
取400μL已合成的DNA-AgNCs，用RF-5301PC荧光分光光度计于200-800nm范围内分别扫描其最大激发波长与最大发射波长，结果见图2。由图2可以看出，合成的DNA-AgNCs最大激发波长和最大发射波长分别为590nm、640nm。并且该DNA-AgNCs在室灯下无色，但在紫外灯(λex:254nm)下显示亮红色的荧光，说明成功制备了DNA-AgNCs。本发明选择590nm为后续检测的最大激发波长。
实施例2 溶液的配制及检测方法
阿仑膦酸钠标准品储备液的配制
精密称取阿仑膦酸钠0.0162g于棕色小瓶中，超纯水溶解并稀释至5mL，配制成10- 2mol/L的标准品储备液，于4℃冰箱保存。临用前稀释成浓度分别为：10-3、5×10-4、10-4、5×10-5、10-5、5×10-6、10-6、10-7、10-8mol/L的系列标准溶液。
阿仑膦酸钠供试品溶液的配制
分别取3个批号的阿仑膦酸钠片各20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于阿仑膦酸1mg)，置8mL量瓶中，加水适量超声使阿仑膦酸钠溶解，用水稀释至刻度，摇匀，以3000rpm离心3min，取上清液，滤过，取续滤液分别作为供试品溶液1、供试品溶液2、供试品溶液3备用。
检测方法
空白组1：在1.5mL离心管中依次加入40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH 7.4)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上测定荧光强度(激发波长：590nm；发射光谱扫描范围：605-750nm；扫描速度：Very Fast；狭缝宽度：ex：10nm，em：10nm)，测定的荧光强度作为DNA-AgNCs的空白强度。
空白组2：在1.5mL离心管中依次加入40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH7.4)与40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上测定荧光强度(激发波长：590nm；发射光谱扫描范围：605-750nm；扫描速度：Very Fast；狭缝宽度：ex：10nm，em：10nm)，测定的荧光强度记为F0。
实验组：在1.5mL离心管中依次加入40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH7.4)与一定体积不同浓度的阿仑膦酸钠溶液，涡旋混匀，静置15min，再加入40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上测定荧光强度(激发波长：590nm；发射光谱扫描范围：605-750nm；扫描速度：Very Fast；狭缝宽度：ex：10nm，em：10nm)，测定的荧光强度记为F。
参照实施例1和2，运行施例3-9，测定样品中阿仑膦酸钠的含量。
实施例3 影响因素考察
发明人研究了Cu2+浓度、体系的pH及试剂加入顺序对检测结果的影响，具体如下。
Cu2+浓度对检测结果的影响：将某一浓度的Cu2+溶液加入到PB缓冲液(pH 7.4)与DNA-AgNCs(310nmol/L)的混合溶液中涡旋混匀，室温下静置15min，最后用超纯水定容至400μL，室温下静置20min，按实施例2荧光参数进行测定。Cu2+浓度在0-1200nmol/L时，体系中DNA-AgNCs荧光强度如图3所示。由图3可知，当Cu2+加入后，DNA-AgNCs的荧光迅速被猝灭，随着Cu2+浓度的增加，荧光强度逐渐降低直到完全猝灭。本发明选择Cu2+浓度为800nmol/L作为后续检测条件。
体系的pH对检测结果的影响：分别取DNA-AgNCs(310nmol/L)、Cu2+(800nmol/L)混合液或DNA-AgNCs(310nmol/L)、Cu2+(800nmol/L)、阿仑膦酸钠(10μmol/L)的混合液分别于pH值为5.8、6.6、7.0、7.4、8.0的PB缓冲液中涡旋混匀，室温下静置15min，最后用超纯水定容至400μL，室温下静置20min；按实施例2荧光参数测定其对荧光强度的影响，每组实验分别重复做三次，测定结果如图4所示。由图4可知，pH值的改变对荧光强度的猝灭作用无显著影响，但对恢复有一定的影响，所以我们选择生理缓冲pH 7.4进行后续的实验。
试剂加入顺序对检测结果的影响：分别按照以下顺序进行测定1)将DNA-AgNCs(310nmol/L)、Cu2+(800nmol/L)、PB缓冲液(pH 7.4)混合液涡旋混匀，静置15min，再加入阿仑膦酸钠(10μmol/L)，最后用超纯水定容至400μL室温下静置20min；2)将DNA-AgNCs(310nmol/L)、阿仑膦酸钠(10μmol/L)、PB缓冲液(pH 7.4)混合液涡旋混匀，静置15min，再加入Cu2+(800nmol/L)，最后用超纯水定容至400μL，室温下静置20min；3)将Cu2+(800nmol/L)、阿仑膦酸钠(10μmol/L)、PB缓冲液(pH 7.4)混合液涡旋混匀，静置15min，再加入DNA-AgNCs(310nmol/L)，最后用超纯水定容至400μL，室温下静置20min；按实施例2荧光参数测定其对荧光强度的影响，每种顺序测定三次，测定结果如图5所示。由图5可以看出，试剂的加入顺序对荧光的恢复也有一定的影响；当Cu2+与阿仑膦酸钠最先加入到反应体系并静置15min钟后再加入DNA-AgNCs时，荧光恢复效率最高。
实施例4 标准曲线的绘制
某一特定浓度的阿仑膦酸钠标准溶液加入到Cu2+(800nmol/L)和PB缓冲液(pH7.4)的混合溶液中混匀，室温下静置15min，然后向其中加入DNA-AgNCs(310nmol/L)混匀，最后用超纯水定容至400μL，室温下静置20min后，按实施例2荧光参数进行测定。重复做三次实验。由图6可知，DNA-AgNCs的荧光强度随着阿仑膦酸钠浓度的增加而逐渐恢复。从图7我们可以看出，以相对荧光强度(F/F0)为纵坐标，阿仑膦酸钠浓度为横坐标，拟合线性，在0.0008–200μmol/L浓度范围内具有良好的线性关系(R2＝0.992)，标准曲线方程为：Y＝0.02382X+1.086。与现有技术相比，本发明检测方法具有更高的灵敏度、更宽的线性范围、更简便快速，可以使每个样品平均检测的时间缩短至1min以内。
实施例5 Zeta电位测定
分别按照以下顺序：1)DNA-AgNCs(310nmol/L)；2)Cu2+(800nmol/L)与DNA-AgNCs(310nmol/L)的混合溶液；3)Cu2+(800nmol/L)、DNA-AgNCs(310nmol/L)、阿仑膦酸钠(100μmol/L)混合液；4)Cu2+(800nmol/L)、DNA-AgNCs(310nmol/L)、阿仑膦酸钠(200μmol/L)混合液；5)Cu2+(800nmol/L)、DNA-AgNCs(310nmol/L)、阿仑膦酸钠(800μmol/L)混合液进行Zeta电位测定，每组测定三次。图8中，1)DNA-AgNCs,(2)Cu2+-DNA-AgNCs复合物,(3)Cu2+-DNA-AgNCs复合探针和100μM的阿仑膦酸钠,(4)Cu2+-DNA-AgNCs复合探针和200μM的阿仑膦酸钠,(5)Cu2+-DNA-AgNCs复合探针和800μM的阿仑膦酸钠。从图8可以看出，DNA-AgNCs的平均Zeta电位为–38.1mV，表明有大量的负电荷暴露在DNA-AgNCs的表面。当Cu2+加入后，由于Cu2+中和了DNA-AgNCs表面的负电荷而使Zeta电位升高。然而，当阿仑膦酸钠的不断加入，我们发现Zeta电位逐渐升高至–0.31mV。这一变化说明阿仑膦酸钠在pH 7.4的环境下带正电荷，并且它与Cu2+的配位作用大于静电作用。所以，荧光强度也随着阿仑膦酸钠的不断加入而逐渐增强。
实施例6 阿仑膦酸钠片的含量测定
试剂空白：在1.5mL离心管中依次加入40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH7.4)与40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min，按实施例2荧光参数进行测定，测定的荧光强度作为F0，得到空白组荧光强度F0为82.29。
样品溶液：在1.5mL离心管中依次加入40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH7.4)与40μL含阿仑膦酸钠的供试品溶液涡旋混匀，静置15min，再加入40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min，按实施例2荧光参数进行测定，读取荧光强度F，每个阿仑膦酸钠供试品溶液分别测量三次后，得到供试品溶液1、供试品溶液2、供试品溶液3的平均荧光强度分别为186.0、192.1、188.5。
由上可知，上述供试品溶液1、供试品溶液2、供试品溶液3的平均相对荧光强度Y(F/F0)分别为2.260、2.225、2.296；将算出的平均相对荧光强度(F/F0)带入公式Y＝0.02382X+1.086，计算X，得出阿仑膦酸钠平均供试品浓度c供试品1、c供试品2、c供试品3分别为49.27、52.42、50.78μmol/L。
实施例7 干扰实验
发明人还考察了片剂辅料和生物样品中其他可能共存的物质对本发明检测方法的干扰情况，如图9所示，主要考察了只存在阿仑膦酸钠(1号)、阿仑膦酸钠与尿素共存(2号)、阿仑膦酸钠与淀粉共存(3号)、阿仑膦酸钠与甘露醇共存(4号)、阿仑膦酸钠与葡萄糖共存(5号)、阿仑膦酸钠与钠离子共存(6号)、阿仑膦酸钠与钙离子共存(7号)、阿仑膦酸钠与镁离子共存(8号)、阿仑膦酸钠与钾离子共存(9号)、阿仑膦酸钠与硝酸根离子共存(10号)、阿仑膦酸钠与硫酸根离子共存(11号)所获得信号的差值，用于说明样品中可能存在的常见干扰物质对该方法的影响。实验结果表明：当一些常见的片剂辅料和共存离子的浓度为阿仑膦酸钠的100倍时，其相对荧光强度没有明显的变化。所以，本方法可实现高选择性检测阿仑膦酸钠而不受其他辅料或离子的影响。
实施例8 阿仑膦酸钠片中阿仑膦酸钠含量测定及加标回收实验
在1.5mL离心管中分别取阿仑膦酸钠标准品(500μmol/L)各40、80、120μL，并分别加入40μL阿仑膦酸钠供试品溶液(500μmol/L)、40μL Cu2+(800nmol/L)、40μL PB缓冲液(pH7.4)，涡旋混匀，静置15min，再加入40μL DNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min，按实施例2荧光参数进行测定。将相对荧光强度(F/F0)带入拟合出的线性方程Y＝0.02382X+1.086，计算出阿仑膦酸钠供试品浓度加标后的浓度c供试品+标准品，并根据公式：回收率(％)＝(c供试品+标准品–c供试品)/c标准品×100％计算加标回收率。测定结果见表1。
表1 阿仑膦酸钠片中阿仑膦酸钠含量测定及加标回收实验结果
由表1可以看出，阿仑膦酸钠片中阿仑膦酸钠的测得量与标示量无显著性差异，每个片剂样品平行测量三次后RSD为0.70-1.3％，并且加标回收率为103.5-110.0％，可见该方法具有良好的准确性。
实施例9 生物样品加标回收实验
首先，将生物样品(尿样、血清样本)于10000rpm离心30min，然后稀释1000倍；然后将40μL生物样品分别与浓度为40、60、100μmol/L的阿仑膦酸钠标准溶液加入到Cu2+(800nmol/L)、PB缓冲液(pH 7.4)和DNA-AgNCs(310nmol/L)的混合溶液中混匀，用超纯水定容至400μL涡旋混匀，室温下静置20min，按实施例2荧光参数进行测定。将相对荧光强度(F/F0)带入拟合出的线性方程Y＝0.02382X+1.086，计算出阿仑膦酸钠供试品浓度加标后的浓度c供试品+标准品，并根据公式：回收率(％)＝(c供试品+标准品–c供试品)/c标准品×100％；计算尿样、血样加标回收率。阿仑膦酸钠在空白尿样中的加标回收测定结果见表2。阿仑膦酸钠在空白血清样本中的加标回收测定结果见表3。
表2 尿样中阿仑膦酸钠的测定及加标回收实验结果
由表2可以看出，每个尿样平行测量三次后RSD为1.1-1.7％，其加标回收率为90.90-98.80％，结果表明了该方法用于尿样中阿仑膦酸钠的检测，精密度高且实用性强。
表3 血清样本中阿仑膦酸钠的测定及加标回收实验结果

Claims (7)

1.一种阿仑膦酸钠的荧光检测新方法，其特征在于：先利用铜离子对寡聚核苷酸-荧光银纳米簇中银纳米簇荧光的猝灭作用，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离寡聚核苷酸-银纳米簇，银纳米簇荧光得以恢复，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度所做标准曲线计算样品中阿仑膦酸钠的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将Cu2+、DNA-AgNCs、含阿仑膦酸钠的样品在PB缓冲液中反应，反应结束后在荧光分光光度计上扫描200‒800 nm范围内的荧光激发和发射光谱，同时做空白试验；根据最大激发波长下，最大发射波长处的荧光强度变化与阿仑膦酸钠浓度所做的标准曲线，即可算出样品中阿仑膦酸钠的含量。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于： DNA-AgNCs、Cu2+、含阿仑膦酸钠的标准品在PB缓冲液中反应；所述Cu2+的浓度为25‒1200 nmol/L；所述PB缓冲液的pH为5.8‒8.0。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Cu2+的浓度为500‒1200 nmol/L；所述PB缓冲液的pH为7.0‒8.0。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用如下步骤：先将含阿仑膦酸钠的标准品加入到浓度为800 nmol/L 的Cu2+和pH 7.4 的PB缓冲液的混合溶液中混匀，室温下静置15min；然后再加入DNA-AgNCs混匀，室温下静置20 min；之后在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590 nm，扫描605‒750 nm的荧光发射光谱，以最大发射波长640 nm处的荧光强度进行定量，同时做空白试验；所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：
Y=0.02382X+1.086
式中：
Y为相对荧光强度F / F 0；X为标准品中阿仑膦酸钠的浓度，单位为μmol/L。
6.一种阿仑膦酸钠的荧光检测方法，包括空白试验、样品检测及计算结果步骤：其特征在于：
（1）空白试验：
空白组1：在1.5 mL离心管中依次加入40μL 浓度为800 nmol/L 的Cu2+、40μL pH 7.4的PB缓冲液与40μL 浓度为310 nmol/L 的DNA-AgNCs，加水补充至400 μL，涡旋混匀，室温下静置20 min；在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590 nm，扫描605‒750 nm的荧光发射光谱，以最大发射波长640 nm处的荧光强度进行定量，测定的荧光强度作为F 0；
（2）样品测定：
在1.5 mL离心管中依次加入40μL 浓度为800 nmol/L 的Cu2+、40μL pH 7.4的PB缓冲液与40 μL含阿仑膦酸钠的样品溶液涡旋混匀，静置15 min，再加入40μL 浓度为310 nmol/L的 DNA-AgNCs，加水补充至400 μL，涡旋混匀，室温下静置20 min；在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590 nm，扫描605-750 nm的荧光发射光谱，以最大发射波长640 nm处的荧光强度进行定量，测定的荧光强度F；
（3）计算结果
所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：
Y=0.02382X+1.086
式中：
Y为相对荧光强度F / F 0；X为样品中阿仑膦酸钠的浓度，单位为μmol/L。
7.如权利要求2‒6任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA-AgNCs的合成方法采用以下步骤：将DNA溶液中加入AgNO3溶液，在PB缓冲液中涡旋混匀，避光孵育，再加入与AgNO3等摩尔浓度的NaBH4溶液反应制得。
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