CN107653286B - 一种干酪抗氧化肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干酪抗氧化肽的制备方法，以干酪为原料，通过提取水溶物、大孔树脂初步分离和多级色谱分离纯化技术，制出一些小分子量并具有抗氧化活性的干酪蛋白水解肽，为工业化生产提供理论基础和技术支撑。本发明采用多级色谱进行分离纯化，所得组分纯度以及抗氧化活性(DPPH自由基清除率)更高，在一级色谱凝胶过滤时采用去离子水作为洗脱液，与以往的盐类洗脱液相比更加温和，能很好的达到分离效果，并且不会带来多余的盐离子。本发明所得产品安全性极高，无毒副作用，分离纯化后的产品具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率达到89.32％，且经模拟胃肠道试验后，其DPPH自由基清除率位83.25％，活性稳定，可用于食品和医药行业，具有良好的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种干酪抗氧化肽的制备方法，属于生物技术领域，涉及的是具有抗氧化功能的干酪抗氧化肽的制备方法以及分离纯化技术。
背景技术
近年来，随着人类社会的进步和科技的发展，人们的膳食营养水都有大幅度提升，但随之而来的人们的健康隐患也在无形中增加，高血压、糖尿病、癌症等疾病的发病率逐年升高，其原因是摄入较多的脂肪及体内存在过多的自由基。过多的自由基会导致膜脂质、酶、蛋白质和DNA的氧化损伤。食源性天然抗氧化物质与人工合成抗氧化物质相比，具有安全、易消化、营养功能等特点，因此天然抗营养化物质的研究具有重要意义。
目前很多研究学者把目标指向了天然的抗氧化物质，研究发现，许多食源性蛋白都具有隐性抗氧化活性，经微生物作用或酶解后可释放出具有抗氧化活性的肽类，继而掀起了研究开发抗氧化肽的热潮。
干酪的营养成分丰富、易被消化，同时还拥有较高的生物学价值，日渐受到国内消费者的欢迎。近年来，越来越多消费者对食品的关注已经不满足于食品本身的安全性及营养价值，而是更加关心这些食品食用后是否能够对人体发挥出健康有益的功效，这样的消费趋势为功能性食品的发展提供了强大动力。
然而，在体内很多活性肤不能够抵抗胃肠道的消化作用，也就不能到达靶部位发挥生理学作用。因此，要开发出能抵抗胃肠道的消化作用的抗氧化肽至关重要。但是，在既往各种研究中未发现同时具有良好抗氧化活性和胃肠道稳定性的干酪抗氧化肽，本发明所述的具有较高DPPH自由基清除率的干酪活性肽，同时具有较强的人体胃肠道稳定性，有利于其在体内吸收和转运，继而发挥降抗氧化的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种干酪抗氧化肽的制备方法，在保证分离纯化得到抗氧化活性良好活性肽的同时，具有良好的抵抗胃肠道消化的能力，使其在体内发挥生物活性。弥补利用干酪分离纯化具有抗氧化功能的活性肽的技术参数不成熟和活性、稳定性较低的缺陷。
本发明是通过以下操作实现的：
1、干酪水溶物的制备：将30g干酪切碎后加入到100mL 50mM磷酸盐缓冲液中，20000r/min匀浆2min后，于40℃水浴1h，并温和搅拌(150rmp)。然后在4℃，3000×g下离心30min。悬浮液通过Whatman no.2滤纸过滤，将滤液冷冻干燥。
2、大孔树脂脱盐初步纯化：将干酪提取物冻干粉用去离子水配置成浓度为10mg/mL的溶液，称取处理好的湿DA201-C型树脂于250mL锥形瓶中，加入50mL配置好的溶液，湿树脂与水溶液的体积比为1:1-2:1，在25℃振荡培养箱振荡24h后取出，在流速为1BV/h-1.5BV/h条件下，先用去离子水洗柱子，洗至流出液电导率与去离子水一致时，用70％-75％的乙醇进行洗脱，收集流出液后冻干成粉。
3、Sephadex G-25凝胶色谱进行一级色谱分离：采用AKTA蛋白纯化***。冻干粉用洗脱液配制成浓度为10mg/mL-20mg/mL的溶液，通过进样环进样。调节压力为1.0MPa，流速为0.3mL/min-0.5mL/min上样量为6mL，紫外检测器波长选择280nm进行检测。得到的第二个组分峰的DPPH自由基清除率最高，为78.65％。
4、测定各组分峰的DPPH自由基清除能力：收集[0010]中的各组分峰，分别用去离子水配置成50mg/mL的溶液，取0.1mL，与3.9mL新制备的60μM DPPH-甲醇溶液混合，室温避光45min后用在517nm下测吸收值，并用去离子水代替样品作空白。计算其DPPH自由基清除率。
5、反相高效液相色谱二级分离纯化：用反相高效液相色谱对[0010]中DPPH清除率较高的组分进一步分离纯化。色谱柱：C18色谱柱，，柱温：33℃-35℃，流动相：A-超纯水(体积分数0.05％TFA)，B-乙腈(体积分数0.05％TFA)，检测波长：220nm，进样量：10μL，进样浓度：10mg/m L，流动相流速：0.5mL/min-1.0mL/min。采用梯度洗脱程序，多次上样收集各个洗脱峰，检测其DPPH自由基清除率。收DPPH自由基清除率最高的洗脱组分，冷冻干燥，得粉末状具有抗氧化功能的活性肽。
6、测定各组分峰的DPPH自由基清除能力：收集[0012]中的各组分峰，分别用去离子水配置成50mg/mL的溶液，取0.1mL，与3.9mL新制备的60μM DPPH-甲醇溶液混合，室温避光45min后用在517nm下测吸收值，并用去离子水代替样品作空白。计算其DPPH自由基清除率。
模拟胃肠道消化实验：将[0013]中DPPH自由基清除能力最好的组分冷冻干燥，进行模拟胃肠道试验。将肽冻干粉按1％(w/v)的比例加入到0.1mol/L的KCl-HCl缓冲溶液(pH2.0)中，在37℃条件下处理5h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100℃保持15min灭酶活，然后用0.05mol/L的NaOH中和至pH为7.0，溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。经胃蛋白酶处理后的肽溶液再用2％(w/v)的胰蛋白酶在37℃条件下处理4h，然后加热到100℃保持，最后反应溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。
所述凝胶过滤层析采用的是AKTA prime蛋白纯化***，填料为Sephadex G-25，层析柱为玻璃层析柱Φ1.5×70cm；所述液相色谱是Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为Kromasil C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)。
本发明分离纯化的干酪抗氧化肽，DPPH自由基清除能力为89.32％。
上述方法分离纯化的干酪抗氧化肽可用于生物体内抗氧化功能。
本发明的优点：本发明分离纯化的干酪抗氧化肽，经体外抗氧化试验证实其DPPH自由基清除率为89.32％，经模拟胃肠道试验证明其稳定性较强，其DPPH自由基清除率为83.25％。本发明分离纯化的干酪抗氧化肽可用于抗氧化保健食品和药品的制备，且效果显著，具有很好的应用前景和市场前景。
附图说明
图1为采用SepHadex-25凝胶过滤色谱纯化干酪抗氧化肽图谱；
图2为反相高效液相色谱纯化干酪抗氧化肽图谱。
具体实施方式
原料：水分含量在30％-40％的干酪
取30g干酪，切碎后加入到100mL 50mM磷酸盐缓冲液中，20000r/min匀浆2min，在40℃条件下水浴1h，并温和搅拌。然后在4℃，3000×g下离心30min。悬浮液通过Whatmanno.2滤纸过滤，将滤液冷冻干燥。
将上述步骤得到的提取物冻干粉用去离子水配置成10mg/m L的溶液，取50mL与处理好的DA201-C型大孔树脂于250mL锥形瓶中，湿树脂与水溶液的体积比为1:1-2:1，25℃恒温摇床150r/min培养24h，使其充分吸附后弃去未吸附的盐溶液，用70％-75％的乙醇洗脱，流速为1BV/h-1.5BV/h，收集洗脱液并旋转蒸发除去乙醇、冷冻干燥。
将上述步骤得到的冻干粉用洗脱液配制成浓度为10mg/mL-20mg/mL的溶液。采用AKTA蛋白纯化***，利用Sephadex G-25凝胶色谱进行一级色谱分离。通过进样环进样。调节压力为1.0MPa，流速为0.3mL/min-0.5mL/min上样量为6mL，紫外检测器波长选择280nm进行检测，并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对上述步骤中得到的组分2进行进一步分离纯化。色谱仪为Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为KromasilC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温33℃-35℃，220nm下检测，进样量：10μL，进样浓度为10mg/m L，流动相流速：0.5mL/min-1.0mL/min，流动相：A-超纯水(体积分数0.05％TFA)，B-乙腈(体积分数0.05％TFA)。并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，将[0024]中得到的DPPH自由基清除率最高的组分冷冻干燥，将肽粉按照1％(w/v)的比例加入到0.1mol/L KCl-HCl缓冲溶液(pH2.0)中，在37℃条件下处理5h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100℃保持15min灭酶活，然后用0.05mol/L的NaOH中和至pH为7.0，溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。经胃蛋白酶处理后的肽溶液再用2％(w/v)的胰蛋白酶在37℃条件下处理4h，然后加热到100℃保持，最后反应溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。表3为模拟胃肠道消化后产品的抗氧化活性，可知，产品的DPPH自由基清除率从89.32％下降到83.25％，活性降低不明显，证明了产品的稳定性。
实施例1
原料：契达干酪(水分含量30％左右)
取30g契达干酪，切碎后加入到100mL 50mM磷酸盐缓冲液中，20000r/min匀浆2min，在40℃条件下水浴1h，并温和搅拌。然后在4℃，3000×g下离心30min。悬浮液通过Whatman no.2滤纸过滤，将滤液冷冻干燥。
将上述步骤得到的提取物冻干粉用去离子水配置成10mg/m L的溶液，取50mL与处理好的DA201-C型大孔树脂于250mL锥形瓶中，湿树脂与水溶液的体积比为1:1，25℃恒温摇床150r/min培养24h，使其充分吸附后弃去未吸附的盐溶液，用75％的乙醇洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液并旋转蒸发除去乙醇、冷冻干燥。
将上述步骤得到的冻干粉用洗脱液配制成浓度为20mg/mL的溶液。采用AKTA蛋白纯化***，利用Sephadex G-25凝胶色谱进行一级色谱分离。通过进样环进样。调节压力为1.0MPa，流速为0.5mL/min上样量为6mL，紫外检测器波长选择280nm进行检测，并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
表1 凝胶过滤色谱各洗脱组分的DPPH自由基清除能力
| 洗脱组分 | 出峰时间(min) | 各组分含量(％) | DPPH自由基清除能力(％) |
| 组分1 | 38.92±3.08<sup>a</sup> | 57.34±1.29<sup>a</sup> | 34.75±2.32<sup>a</sup> |
| 组分2 | 72.03±2.74<sup>b</sup> | 17.24±0.98<sup>b</sup> | 78.65±3.52<sup>b</sup> |
| 组分3 | 95.05±2.25<sup>c</sup> | 25.42±1.45<sup>c</sup> | 10.74±1.06<sup>c</sup> |
注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P<0.05)。
利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对上述步骤中得到的组分2进行进一步分离纯化。色谱仪为Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为KromasilC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温35℃，220nm下检测，进样量：10μL，进样浓度为10mg/m L，流动相流速：1.0mL/min，流动相：A-超纯水(体积分数0.05％TFA)，B-乙腈(体积分数0.05％TFA)。并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
表2 反相高效液相色谱分离部分组分的DPPH自由基清除能力
| 洗脱组分 | DPPH自由基清除能力(％) |
| 组分1 | 24.82±2.70<sup>a</sup> |
| 组分2 | 10.25±3.44<sup>b</sup> |
| 组分3 | 89.32±1.49<sup>c</sup> |
| 组分4 | 46.20±1.92<sup>d</sup> |
| 组分5 | 5.97±1.82<sup>e</sup> |
注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P<0.05)。
体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，将[0033]中得到的组分3冷冻干燥，将肽粉按照1％(w/v)的比例加入到0.1mol/L KCl-HCl缓冲溶液(pH2.0)中，在37℃条件下处理5h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100℃保持15min灭酶活，然后用0.05mol/L的NaOH中和至pH为7.0，溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。经胃蛋白酶处理后的肽溶液再用2％(w/v)的胰蛋白酶在37℃条件下处理4h，然后加热到100℃保持，最后反应溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。表3为模拟胃肠道消化后产品的抗氧化活性，可知，产品的DPPH自由基清除率从89.32％下降到83.25％，活性降低不明显，证明了产品的稳定性。
表3 模拟胃肠道前后产品DPPH自由基清除率的变化
| 处理方式 | DPPH自由基清除率(％) |
| 原分离纯化的干酪抗氧化肽 | 89.32±1.49<sup>a</sup> |
| 胃蛋白酶消化 | 85.76±2.03<sup>a</sup> |
| 胰蛋白酶消化 | 83.25±2.40<sup>a</sup> |
实施例2
原料：高达干酪(水分含量40％左右)
取30g高达干酪，切碎后加入到100mL 50mM磷酸盐缓冲液中，20000r/min匀浆2min，在40℃条件下水浴1h，并温和搅拌。然后在4℃，3000×g下离心30min。悬浮液通过Whatman no.2滤纸过滤，将滤液冷冻干燥。
将上述步骤得到的提取物冻干粉用去离子水配置成10mg/m L的溶液，取50mL与处理好的DA201-C型大孔树脂于250mL锥形瓶中，湿树脂与水溶液的体积比为1:1，25℃恒温摇床150r/min培养24h，使其充分吸附后弃去未吸附的盐溶液，用70％的乙醇洗脱，流速为1.5BV/h，收集洗脱液并旋转蒸发除去乙醇、冷冻干燥。
将上述步骤得到的冻干粉用洗脱液配制成浓度为20mg/mL的溶液。采用AKTA蛋白纯化***，利用Sephadex G-25凝胶色谱进行一级色谱分离。通过进样环进样。调节压力为1.0MPa，流速为0.3mL/min上样量为6mL，紫外检测器波长选择280nm进行检测，并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
表4 凝胶过滤色谱各洗脱组分的DPPH自由基清除能力
| 洗脱组分 | 出峰时间(min) | 各组分含量(％) | DPPH自由基清除能力(％) |
| 组分1 | 36.54±0.88<sup>a</sup> | 54.58±0.92<sup>a</sup> | 14.68±2.29<sup>a</sup> |
| 组分2 | 73.93±1.75<sup>b</sup> | 20.75±0.96<sup>b</sup> | 69.95±1.98<sup>b</sup> |
| 组分3 | 88.05±0.95<sup>c</sup> | 24.67±1.07<sup>c</sup> | 25.49±2.45<sup>c</sup> |
注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P<0.05)。
利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对上述步骤中得到的组分2进行进一步分离纯化。色谱仪为Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为KromasilC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温33℃，220nm下检测，进样量：10μL，进样浓度为10mg/m L，流动相流速：0.5mL/min，流动相：A-超纯水(体积分数0.05％TFA)，B-乙腈(体积分数0.05％TFA)。并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
表5 反相高效液相色谱分离部分组分的DPPH自由基清除能力
| 洗脱组分 | DPPH自由基清除能力(％) |
| 组分3 | 32.02±1.92<sup>a</sup> |
| 组分4 | 5.25±2.44<sup>b</sup> |
| 组分5 | 87.66±1.52<sup>c</sup> |
| 组分6 | 22.60±2.54<sup>d</sup> |
| 组分7 | 11.64±1.98<sup>e</sup> |
注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P<0.05)。
体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，将[0042]中得到的组分5冷冻干燥，将肽粉按照1％(w/v)的比例加入到0.1mol/L KCl-HCl缓冲溶液(pH2.0)中，在37℃条件下处理5h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100℃保持15min灭酶活，然后用0.05mol/L的NaOH中和至pH为7.0，溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。经胃蛋白酶处理后的肽溶液再用2％(w/v)的胰蛋白酶在37℃条件下处理4h，然后加热到100℃保持，最后反应溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。表6为模拟胃肠道消化后产品的抗氧化活性，可知，产品的DPPH自由基清除率从87.66％下降到82.95％，活性降低不明显，证明了产品的稳定性。
表6 模拟胃肠道前后产品DPPH自由基清除率的变化
| 处理方式 | DPPH自由基清除率(％) |
| 原分离纯化的干酪抗氧化肽 | 87.66±1.52<sup>a</sup> |
| 胃蛋白酶消化 | 84.76±2.43<sup>a</sup> |
| 胰蛋白酶消化 | 82.95±2.03<sup>a</sup> |
实施例3
原料：埃门塔尔干酪(水分含量30％左右)
取30g埃门塔尔干酪，切碎后加入到100mL 50mM磷酸盐缓冲液中，20000r/min匀浆2min，在40℃条件下水浴1h，并温和搅拌。然后在4℃，3000×g下离心30min。悬浮液通过Whatman no.2滤纸过滤，将滤液冷冻干燥。
将上述步骤得到的提取物冻干粉用去离子水配置成10mg/m L的溶液，取50mL与处理好的DA201-C型大孔树脂于250mL锥形瓶中，湿树脂与水溶液的体积比为2:1，25℃恒温摇床150r/min培养24h，使其充分吸附后弃去未吸附的盐溶液，用70％的乙醇洗脱，流速为1.5BV/h，收集洗脱液并旋转蒸发除去乙醇、冷冻干燥。
将上述步骤得到的冻干粉用洗脱液配制成浓度为10mg/mL的溶液。采用AKTA蛋白纯化***，利用Sephadex G-25凝胶色谱进行一级色谱分离。通过进样环进样。调节压力为1.0MPa，流速为0.3mL/min上样量为6mL，紫外检测器波长选择280nm进行检测，并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
表7 凝胶过滤色谱各洗脱组分的DPPH自由基清除能力
| 洗脱组分 | 出峰时间(min) | 各组分含量(％) | DPPH自由基清除能力(％) |
| 组分1 | 41.04±3.08<sup>a</sup> | 66.83±1.84<sup>a</sup> | 27.74±2.32<sup>a</sup> |
| 组分2 | 80.32±2.74<sup>b</sup> | 33.17±1.24<sup>b</sup> | 73.62±2.42<sup>b</sup> |
注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P<0.05)。
利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对上述步骤中得到的组分2进行进一步分离纯化。色谱仪为Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为KromasilC18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温34℃，220nm下检测，进样量：10μL，进样浓度为10mg/m L，流动相流速：0.8mL/min，流动相：A-超纯水(体积分数0.05％TFA)，B-乙腈(体积分数0.05％TFA)。并收集各峰的组分，测定其DPPH自由基清除能力。
表8 反相高效液相色谱分离部分组分的DPPH自由基清除能力
| 洗脱组分 | DPPH自由基清除能力(％) |
| 组分1 | 15.85±2.44<sup>a</sup> |
| 组分2 | 25.26±2.71<sup>b</sup> |
| 组分3 | 85.52±1.42<sup>c</sup> |
| 组分4 | 6.23±3.10<sup>d</sup> |
| 组分5 | 15.07±2.26<sup>e</sup> |
注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P<0.05)。
体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，将[0052]中得到的组分3冷冻干燥，将肽粉按照1％(w/v)的比例加入到0.1mol/L KCl-HCl缓冲溶液(pH2.0)中，在37℃条件下处理5h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100℃保持15min灭酶活，然后用0.05mol/L的NaOH中和至pH为7.0，溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。经胃蛋白酶处理后的肽溶液再用2％(w/v)的胰蛋白酶在37℃条件下处理4h，然后加热到100℃保持，最后反应溶液经10000×g离心40min，并测定其DPPH自由基清除能力。表6为模拟胃肠道消化后产品的抗氧化活性，可知，产品的DPPH自由基清除率从85.52％下降到80.89％，活性降低不明显，证明了产品的稳定性。
表9 模拟胃肠道前后产品DPPH自由基清除率的变化
Claims (2)
1.一种干酪抗氧化肽的制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备：
(1)干酪冻干粉的制备：将30g干酪切碎后加入到100mL 50mM磷酸盐缓冲液中，20000r/min匀浆2min后于40℃水浴1h，并以150r/min温和搅拌；然后在4℃，3000×g下离心30min；悬浮液通过Whatman no.2滤纸过滤，将滤液冷冻干燥；
(2)大孔树脂脱盐初步纯化：将干酪冻干粉用去离子水配置成浓度为10mg/mL的溶液，称取处理好的湿DA201-C型树脂于250mL锥形瓶中，加入50mL配置好的溶液，湿树脂与水溶液的体积比为1:1-2:1，在25℃振荡培养箱振荡24h后取出，在流速为1BV/h-1.5BV/h条件下，先用去离子水洗柱子，洗至流出液电导率与去离子水一致时，用70％-75％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液并旋转蒸发除去乙醇、冷冻干燥成粉；
(3)一级色谱分离：将步骤(2)得到的冻干粉，采用Sephadex G-25凝胶色谱进行一级色谱分离，采用AKTA蛋白纯化***，冻干粉用洗脱液配制成浓度为10mg/mL-20mg/mL的溶液，通过进样环进样，调节压力为1.0MPa，流速为0.3mL/min-0.5mL/min，上样量为6mL，紫外检测器波长选择280nm进行检测；(4)测定各组分峰的DPPH自由基清除能力：收集上述步骤中的各组分峰，分别用去离子水配置成50mg/mL的溶液，取0.1mL，与3.9mL新制备的60μMDPPH-甲醇溶液混合，室温避光45min后在517nm下测吸收值，并用去离子水代替样品作空白，计算其DPPH自由基清除率，得到的第二个组分峰的DPPH自由基清除率最高，为78.65％；
(5)二级分离纯化：用反相高效液相色谱对步骤(4)中DPPH清除率较高的组分进一步分离纯化，色谱仪为Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为KromasilC18色谱柱5μm，250mm×4.6mm，柱温：33℃-35℃，流动相A-超纯水，含体积分数0.05％TFA，流动相B-乙腈，含体积分数0.05％TFA，检测波长：220nm，进样量：10μL，进样浓度：10mg/mL，流动相流速：0.5mL/min-1.0mL/min；采用梯度洗脱程序，多次上样收集各个洗脱峰，检测其DPPH自由基清除率；收DPPH自由基清除率最高的洗脱组分，得到的第3个组分峰的DPPH自由基清除率最高，为89.32％，冷冻干燥，得粉末状具有抗氧化功能的活性肽。
2.一种干酪抗氧化肽，其特征在于，按照权利要求1所述方法制备得到，体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，并分别测定消化前后其DPPH清除能力的变化，来确定其稳定性，经过两个阶段的消化过程，产品的DPPH自由基清除率从89.32％下降到83.25％。
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