CN107653226A - 一种人脐带间充质干细胞分离培养方法 - Google Patents

一种人脐带间充质干细胞分离培养方法 Download PDF

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陈文均
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Abstract

本发明属于生物制品细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括如下步骤：取足月剖宫产胎儿离体脐带，放入无菌的组织保存液中保存；用生理盐水冲洗数次，去除残留血迹；用带齿镊子剔除组织块的两条脐静脉和两条脐动脉，用无菌剪刀将华通胶完全剪碎；将步骤剪碎的华通胶转移至培养基中振荡后离心；将离心沉淀部分转移至细胞培养瓶中；培养第5‑6天可见部分细胞从组织小块周围爬出，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养；在第14天左右可见细胞融合度达80％以上，呈漩涡式生长；之后每3天传一代，可得到充足的间充质干细胞。本发明比传统的组织块法更加容易，干细胞纯度和得率更高。

Description

一种人脐带间充质干细胞分离培养方法
技术领域
本发明属于生物制品细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞分离培养方法。
背景技术
间充质干细胞(MSCs))是一类来源于中胚层及外胚层、具有自我更新、多向分化能力的多能干细胞，同时具有造血支持及免疫调节功能，成为国内外广泛研究的热点干细胞，其主要存在于成人骨髓及多种组织中。目前成人骨髓中的间充质干细胞成为研究的主要来源，但其数量较少，且增殖分化潜能随年龄的增大会下降，病毒感染率较高，免疫原性较强，加之需进行骨髓穿刺术采集，故其研究及应用受到限制；近年来，有大量研究表明人脐带及脂肪组织中也存在间充质干细胞，且具有组织来源广泛、取材方便、无伦理限制、免疫原性低、分离培养相对简单等优点，正逐渐成为间充质干细胞研究的主要材料来源及热点之一。
人脐带约有40g，长度60-65cm左右，内部是两根动脉和一根静脉，脐带间充质干细胞存在血管之间的***中，所以尽可能的剥离血管及其外膜是提高间充质干细胞得率的有效方法。
近年来，随着脐带间充质干细胞研究的深入，人们对其需求量大大增加，促使科研工作者不断改进间充质干细胞的分离培养方法。目前主要是以酶消化法、组织块贴壁法分离间充质干细胞。但酶消化法需要多种酶作用，操作繁琐，时间较长；同时还存在消化时间较难控制，细胞得率较少等缺陷。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提出一种更加容易，干细胞纯度和得率更高人脐带间充质干细胞分离培养方法。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括如下步骤：
(1)取足月剖宫产胎儿离体脐带，放入无菌的组织保存液中在4℃条件下保存12-24小时；
(2)在无菌条件下从无菌的组织保存液中取出脐带，用生理盐水冲洗数次，去除残留血迹；
(3)用无菌剪刀将步骤(2)中洗净的脐带剪成2-3cm的小块，将小块纵向剪开，用带齿镊子剔除组织块的两条脐静脉和两条脐动脉，剥离华通胶放入生理盐水中，用无菌剪刀将华通胶完全剪碎；
(4)将步骤(3)中剪碎的华通胶转移至含DMEM/F12培养基中振荡后离心，离心机速度为1500～2000转/分钟，离心5～10分钟弃去上清，此操作重复3遍；
(5)将离心沉淀部分转移至细胞培养瓶中，添加含有体积分数为15％FBS的DMEM/F12培养基，并置于温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养；
(6)每天观察细胞的生长情况，培养第5-6天可见部分细胞从组织小块周围爬出，将培养瓶中上清全部吸出，补加与吸出上清体积相同的体积分数为13％FBS的DMEM/F12培养基，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养；
(7)在第14天左右可见细胞融合度达80％以上，呈漩涡式生长；用胰蛋白酶或者EDTA消化，按1:3传代，补加含有体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基；之后每3天传一代，可得到充足的间充质干细胞。
作为本发明的优化方案，所述的无菌的组织保存液为含150U/ml青霉素和120U/ml链霉素的PBS液。
作为本发明的优化方案，在步骤(4)中的DMEM/F12培养基中添加1‰的双抗。
作为本发明的优化方案，在步骤(6)中从组织小块周围爬出部分细胞呈梭形或纺锤形或多边形。
本发明具有积极的效果：本发明通过组织保存液的处理使得间充质干细胞的分离比传统的组织块法更加容易，干细胞纯度和得率更高，有利于后续细胞的增殖及研究。
具体实施方式
实施例1
一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，由下述步骤组成：
(1)取足月剖宫产胎儿离体脐带，放入无菌的组织保存液中在4℃条件下保存12小时；
(2)在无菌条件下从无菌的组织保存液中取出脐带，用生理盐水冲洗数次，去除残留血迹；
(3)用无菌剪刀将步骤(2)中洗净的脐带剪成2cm的小块，将小块纵向剪开，用带齿镊子剔除组织块的两条脐静脉和两条脐动脉，剥离华通胶放入生理盐水中，用无菌剪刀将华通胶完全剪碎；
(4)将步骤(3)中剪碎的华通胶转移至含DMEM/F12培养基中振荡后离心，离心机速度为1500转/分钟，离心5分钟弃去上清，此操作重复3遍；
(5)将离心沉淀部分转移至细胞培养瓶中，添加含有体积分数为15％FBS的DMEM/F12培养基，并置于温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养；
(6)每天观察细胞的生长情况，培养第5天可见部分细胞从组织小块周围爬出，将培养瓶中上清全部吸出，补加与吸出上清体积相同的体积分数为13％FBS的DMEM/F12培养基，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养；
(7)在第14天左右可见细胞融合度达80％以上，呈漩涡式生长；用胰蛋白酶或者EDTA消化，按1:3传代，补加含有体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基；之后每3天传一代，可得到充足的间充质干细胞。
实施例2
一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，由下述步骤组成：
(1)取足月剖宫产胎儿离体脐带，放入无菌的组织保存液中在4℃条件下保存24小时；
(2)在无菌条件下从无菌的组织保存液中取出脐带，用生理盐水冲洗数次，去除残留血迹；
(3)用无菌剪刀将步骤(2)中洗净的脐带剪成3cm的小块，将小块纵向剪开，用带齿镊子剔除组织块的两条脐静脉和两条脐动脉，剥离华通胶放入生理盐水中，用无菌剪刀将华通胶完全剪碎；
(4)将步骤(3)中剪碎的华通胶转移至含DMEM/F12培养基中振荡后离心，离心机速度为2000转/分钟，离心10分钟弃去上清，此操作重复3遍；
(5)将离心沉淀部分转移至细胞培养瓶中，添加含有体积分数为15％FBS的DMEM/F12培养基，并置于温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养；
(6)每天观察细胞的生长情况，培养第6天可见部分细胞从组织小块周围爬出，将培养瓶中上清全部吸出，补加与吸出上清体积相同的体积分数为13％FBS的DMEM/F12培养基，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养；
(7)在第14天左右可见细胞融合度达80％以上，呈漩涡式生长；用胰蛋白酶或者EDTA消化，按1:3传代，补加含有体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基；之后每3天传一代，可得到充足的间充质干细胞。
将实施例1和实施例2得到的间充质干细胞利用流式细胞技术检测荧光标记抗体进行细胞检测，经鉴定为间充质干细胞。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之。

Claims (4)

1.一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取足月剖宫产胎儿离体脐带，放入无菌的组织保存液中在4℃条件下保存12-24小时；
(2)在无菌条件下从无菌的组织保存液中取出脐带，用生理盐水冲洗数次，去除残留血迹；
(3)用无菌剪刀将步骤(2)中洗净的脐带剪成2-3cm的小块，将小块纵向剪开，用带齿镊子剔除组织块的两条脐静脉和两条脐动脉，剥离华通胶放入生理盐水中，用无菌剪刀将华通胶完全剪碎；
(4)将步骤(3)中剪碎的华通胶转移至含DMEM/F12培养基中振荡后离心，离心机速度为1500～2000转/分钟，离心5～10分钟弃去上清，此操作重复3遍；
(5)将离心沉淀部分转移至细胞培养瓶中，添加含有体积分数为15％FBS的DMEM/F12培养基，并置于温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养；
(6)每天观察细胞的生长情况，培养第5-6天可见部分细胞从组织小块周围爬出，将培养瓶中上清全部吸出，补加与吸出上清体积相同的体积分数为13％FBS的DMEM/F12培养基，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养；
(7)在第14天左右可见细胞融合度达80％以上，呈漩涡式生长；用胰蛋白酶或者EDTA消化，按1:3传代，补加含有体积分数为10％FBS的DMEM/F12培养基；之后每3天传一代，可得到充足的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于：所述的无菌的组织保存液为含150U/ml青霉素和120U/ml链霉素的PBS液。
3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于：在步骤(4)中的DMEM/F12培养基中添加1‰的双抗。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于：在步骤(6)中从组织小块周围爬出部分细胞呈梭形或纺锤形或多边形。
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