CN107638433B - 一种雷公藤提取物及其制备方法和在制备滴眼液中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雷公藤提取物及其制备方法和在制备滴眼液中的应用。本发明雷公藤提取物通过以下方法制备得到：取雷公藤药材饮片，用70～95％乙醇提取，滤过、合并滤液、减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.15～1.35的浸膏，再用中性氧化铝吸附、减压干燥、粉碎，得到雷公藤乙醇提取物中性氧化铝拌样；在雷公藤乙醇提取物中性氧化铝拌样中加入三氯甲烷进行提取，滤过取滤液，回收三氯甲烷，干燥，即得。本发明克服了现有雷公藤提取物口服毒性大的自身缺陷，将雷公藤提取物用于制备滴眼液，具有安全、有效、稳定等优点，且本发明雷公藤提取物制备的滴眼液对干眼症具有优异的疗效，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

一种雷公藤提取物及其制备方法和在制备滴眼液中的应用

技术领域

本发明属于眼科用药及药物制备技术领域，更具体地说，本发明涉及一种雷公藤提取物及其制备方法和在制备滴眼液中的应用。

背景技术

随着人类生活水平和科技水平的提高，特别是电子数码产品的快速发展，使得人们平均用眼频率急剧增加，再加上环境和个体因素，使得干眼症的患病率越来越高，已严重影响了部分人群的生活质量。由于患病人群的增加，干眼症治疗用药已经逐渐成为眼科用药的研发热点。

在正常人体中，由于眼睛表面布满足够量的泪液，泪膜成份正常，再加上合理的眨眼频率，从而维持眼部处于一个正常的功能状态。当泪液量、泪膜成份和眨眼频率发生改变时就容易出现干眼症。导致泪液量、泪膜成份改变的因素很多，如眼部的炎症、泪腺功能异常、眨眼频率降低(如视频终端综合征)、手术、免疫因素、激素代谢异常、其他药物干预等因素均可导致泪液、泪膜成份和眼睛闭合频率的改变，从而引起干眼症。国际干眼工作组于2007年对干眼症的定义为：多种因素所致的一种泪液和眼表疾病，包括眼表不适症状，视力变化和泪膜不稳定并且有潜在眼表损害，伴随泪液渗透压升高和眼表炎症反应。常见的临床症状为：干涩感、异物感、烧灼感、痒感、畏光、眼红、视物模糊、视力波动等。严重干眼者可引起视力明显下降从而影响其正常的工作和生活，甚至导致失明。

目前，干眼症的治疗主要以对症治疗为主，其中最主要的药品还是以人工泪液替代疗法为主，其他药物主要有抗炎类药物(如非甾体类药物如普拉洛芬滴眼液)、免疫调节类药物(环孢素A滴眼液、皮质激素滴眼液等)。干眼症治疗的其他方法还有手术治疗、针灸和中医药疗法。由干眼症治疗进展可知，可用于干眼症治疗的药物种类比较贫乏，治疗手段也比较单一，药物作用机制也比较单一，是一个急需发展和充实的领域。

雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.f.)多年生藤本植物，性味苦，辛凉，有大毒，传统以去皮的根部木质部入药，现也有用带皮的根及叶入药。现代化学研究结果表明其主要化学成份有二萜类、三萜类、倍半萜类和生物碱类，现代药理学研究表明其具有免疫抑制、抗肿瘤、抗排异、抗炎、杀虫等多种药理作用，目前，临床上主要应用于风湿性和类风湿性关节炎和***红斑狼疮等免疫增强型疾病患者。虽然雷公藤具有多种药理作用，在临床上也做出较大的贡献，但其口服制剂产生的毒副反应较大，毒性反应较多，如肝肾功能损伤、生殖***损伤、血液***不良反应等，极大的限制了雷公藤的应用。目前，尚无将雷公藤及其有效成份制备为滴眼液并对干眼症进行治疗相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有干眼症治疗手段比较单一、雷公藤口服毒副反应较大的自身缺陷等问题，提供一种雷公藤提取物及其制备方法，并将其用于制备滴眼液，具有安全、有效、稳定等优点。

为了实现上述发明目的，考虑到雷公藤具有免疫抑制、抗排异、抗炎等多种药理作用，而临床上干眼症患者又多以炎症因素和免疫因素导致的干眼症居多，临床治疗方案以抗炎、免疫调节方法为主，因此，若能将雷公藤制备为滴眼液，根据其药理作用推测其对干眼症将会有较好的治疗作用。为了配合以上用途，本发明提供了一种雷公藤提取物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)取雷公藤药材饮片，用70～95％乙醇提取，滤过、合并滤液、减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.15～1.35的浸膏，再用中性氧化铝吸附、减压干燥、粉碎，得到雷公藤乙醇提取物中性氧化铝拌样；

(2)在雷公藤乙醇提取物中性氧化铝拌样中加入三氯甲烷进行提取，滤过取滤液，回收三氯甲烷，干燥，得到雷公藤提取物。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种雷公藤提取物，其是通过上述雷公藤提取物的制备方法制备得到。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了将上述雷公藤提取物在制备雷公藤提取物滴眼液中的应用。相应地，本发明也提供了一种雷公藤提取物滴眼液，其包括有效浓度的所述雷公藤提取物作为活性成分，以及药学上可接受的辅料。

作为本发明雷公藤提取物滴眼液的一种优选技术方案，所述滴眼液中，以提取物计，所述雷公藤提取物的用量为0.25～4mg/ml；或以质量浓度计，所述雷公藤提取物的用量为0.025～0.4wt％；或以生药量计，所述雷公藤提取物的用量为3.5～28mg生药/ml。需要说明的是，实际应用中应以适于滴眼为度，所述雷公藤提取物的用量可不局限于上述范围。

作为本发明雷公藤提取物滴眼液的一种优选技术方案，所述雷公藤提取物滴眼液在制备过程中可加入符合国家相关技术要求的辅料，如pH调节剂、渗透压调节剂、抗氧剂、助悬增稠剂、改善生物利用度的辅料、溶剂等。所述pH调节剂包括但不限于硼砂、硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、醋酸、醋酸钠等；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠、硼酸、葡萄糖、氯化钾、硼砂、甘油等。所述改善生物利用度的辅料包括但不限于磷脂、亚油酸、多不饱和脂肪酸、α-亚麻酸等。所述抗氧剂包括但不限于亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素C、硫脲等。所述助悬增稠剂包括但不限于甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠等。所述溶剂包括但不限于注射用水、乙醇、甘油、丙二醇等。所述抑菌剂包括但不限于尼泊金、三氯叔丁醇、硫柳汞、苯乙醇、硝酸苯汞等。

作为本发明雷公藤提取物滴眼液的一种优选技术方案，其制备方法可以是本领域常规方法，也可以是如下方法：将雷公藤提取物与辅料混合，加注射用水至规定量，G2垂熔漏斗滤过取滤液，然后100℃流通蒸汽灭菌30min，最后分装即得。

本发明雷公藤提取物滴眼液可用于治疗多种原因引起的干眼症，经实验证实，本发明雷公藤提取物滴眼液对于由角膜炎、结膜炎等眼前部炎症和免疫失调引起的干眼症具有更优的疗效，并且对炎症因素引起的干眼症的疗效优于雷公藤甲素。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明克服了雷公藤提取物口服毒性大的自身缺陷，提供了一种雷公藤提取物及其制备方法，并将雷公藤提取物用于制备滴眼液，特别是制备用于治疗干眼症的滴眼液。本发明雷公藤提取物滴眼液与现有滴眼液相比，具有适应症广、疗效好、不良反应小等特点，对眼前部炎症和疼痛具有明显的改善作用，该作用于非甾体类抗炎镇痛药滴眼液的作用相似，但具有非甾体抗炎镇痛药滴眼液不具备的对免疫失调型干眼症的作用。与具有免疫抑制作用的他克莫司滴眼液相比，本发明雷公藤提取物滴眼液对免疫性干眼症具有明显的改善作用，与他克莫司滴眼液的作用相近，但具有他克莫司滴眼液所不具备的抗炎和镇痛作用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1

1.取雷公藤药材饮片，用95％的乙醇8倍量提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.25(60℃)的稠膏，浸膏用中性氧化铝吸附，减压干燥，粉碎，得雷公藤乙醇提物中性氧化铝拌样。

2.取雷公藤乙醇提物中性氧化铝拌样，加10倍量三氯甲烷提取1小时，滤过，取滤液，回收三氯甲烷，干燥，得雷公藤提取物。

3.取雷公藤提取物2.0g，按本领域常规工艺加入滴眼液药用辅料硼砂0.6g，硼酸12g，羟苯乙酯0.3g，甲基纤维素10.0g，海藻酸钠10.0g，加注射用水至1000ml，G2垂溶漏斗滤过，取滤液，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，分装，即得。

实施例2

1.取雷公藤药材饮片，用95％的乙醇12倍量提取1次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.30(60℃)的稠膏，浸膏用中性氧化铝吸附，减压干燥，粉碎，得雷公藤乙醇提物中性氧化铝拌样。

2.取雷公藤乙醇提物中性氧化铝拌样，加8倍量三氯甲烷提取1小时，滤过，取滤液，回收三氯甲烷，干燥，得雷公藤提取物。

3.取雷公藤提取物10.0g和羟苯乙酯0.3g加入到丙二醇80ml中溶解，得溶液1；取磷酸氢二钠5.8g、磷酸二氢钠8.7g、亚硫酸钠5.0g，加注射用水溶解，再加入聚乙烯吡咯烷酮10.0g，溶胀，得溶液2；将溶液1加入溶液2中，搅匀，加注射用水至1000ml，G2垂溶漏斗滤过，取滤液，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，分装，即得。

实验例1雷公藤提取物滴眼液有效浓度范围的确定

1.实验材料

1.1考马斯亮蓝：南京建成生物工程研究所；批号：20121106；规格：100T/96样。

1.2完全弗氏佐剂：规格：10mL/瓶，批号：SLBC5083，2～8℃保存，SIGMA化学试剂有限公司。

1.3荧光素钠注射液，批号：120901，规格为3mL：0.6g/支，性状：棕色澄明液体，保存条件：密闭保存，生产厂家：广州市白云山明兴制药有限公司。

1.4他克莫司滴眼液，千寿制药株式会社福崎工厂产品；批号：G011；规格：0.1％(5ml:5mg(以他克莫司计))。

1.5磷酸氢二钠：批号：20120715，规格：500g/瓶，生产厂家：江苏强盛功能化学股份有限公司。磷酸二氢钠：批号：20111201，规格：500g/瓶，生产厂家：台山市粤桥试剂塑料有限公司。

1.5硫酸庆大霉素注射液：批号：1212022，规格：2ml:8万单位/瓶，密闭，在凉暗处(避光并不超过20℃)保存，生产厂家：河南润弘制药股份有限公司。

1.6阳性对照品贝复舒(重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液)：规格：21000IU/5ml/瓶；批号：20121206；有效期：2013年12月4日；生产厂家：珠海亿胜生物制药有限公司，

1.8虎红：批号：Lot#ky201204，规格：1g/支，保存条件：常温、避光，广州市齐云生物技术有限公司产品。

1.9戊巴比妥钠：中国医药(集团)上海化学试剂公司(进口分装)，批号：090205，规格：25g/瓶。

1.10BALB/c小鼠：7-8周龄，144只，18-22g，SPF级，从北京维通利华实验动物技术有限公司购入。

1.11新西兰兔，6-10周龄，30只，1.5-2.2kg，普通级，从广东省医学实验动物中心购入。

2.主要仪器

2.1移液器：2-20μl和10-100μl，BRAND公司产品。

2.2分光光度计：722N型，上海菁华科技仪器有限公司产品。

2.3全自动组织脱水机：ASP300S型，德国LEICA公司产品。

2.4石蜡包埋机+冷台：EG1150H型石蜡包埋机，EG1150C型冷台，德国LEICA公司产品。

2.5轮转式切片机：RM2016型，德国LEICA公司产品。

2.6多功能染色机：ST5020型，德国LEICA公司。

2.7生物显微镜：DM3000(ebp100-04-L荧光)型，德国LEICA公司。

2.8病理图像分析***：DFC450+图像采集软件Leica Application Suite V4，德国LEICA公司。

2.9医用净化工作台：型号为SW-CJ-2F(D)，生产厂家为苏州市苏杭科技器材有限公司。

2.10裂隙灯显微镜及配套拍摄***：LYL-II型，东西仪科技有限公司产品。

3.实验方法

选用适应性观察合格的BALB/c小鼠若干只，雌雄各半，先随机选取10只动物为阴性对照组，再随机挑选16只动物用于抗原制备，其余动物均用于模型制备。适应性观察结束后按上述标准进行动物挑选，动物挑选完之后进行造模。动物造模后小鼠在正常饲养条件下饲养5周，期间每周称量体重一次，造模5周后取上述4只未造模动物和4只造模后动物，用颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠双眼结膜作病理切片观察腺体破坏程度和淋巴细胞浸润程度，其他动物检测泪液分泌量(双眼)、泪膜破裂时间(双眼)。其余动物按泪液分泌量(双眼)将动物均衡分为9组(淘汰造模过轻或过重的动物，具体以泪液分泌量为准)，分别为模型对照组、他克莫司组、雷公藤提取物滴眼液0.00625％、0.0125％、0.025％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％(以提取物计分别为0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml，以生药量计分别为0.875mg/ml、1.75mg/ml、3.5mg/ml、7.0mg/ml、14mg/ml、28mg/ml)，每组不少于10只动物，雌雄兼有。分组后按设定要求进行给药，每天4次(约2h一次)，连续给药7天，给药时均用微量加样器吸取药液后给药，他克莫司和雷公藤提取物各剂量组给药容积均为5μl/眼/次，4次/天，给药间隔约为2h；阴性对照组、模型对照组给予等容积的0.9％氯化钠注射液5μl/眼/次，4次/天，给药间隔为2h。试验期间，观察给药期D4和D7小鼠泪液分泌量(双眼)、泪膜破裂时间(双眼)。末次给药后次日用颈椎脱臼法对小鼠进行安乐死，取各组小鼠的睑结膜和穹隆部结膜，作病理切片观察杯状细胞破坏后的恢复程度和淋巴细胞浸润程度。

抗原制备方法：取同种小鼠，用颈椎脱臼法安乐死，常规方法眼周消毒，在超净工作台上完整取出结膜，用生理盐水洗净，放于含8万/500mL庆大霉素的生理盐水中，将结膜剪成碎片，在匀浆器中碾成匀浆。保持4℃，在超声破碎机上破碎1h再放于离心机离心(3000r/min，×15min)。取出上清液，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。然后再用0.14M PBS将蛋白浓度稀释至100μg/mL。在完全弗氏佐剂(FCA)中加入等体积的结膜抗原溶液，充分混匀成油包水溶液。

造模方法：将上述油包水溶液多点注射于鼠背部皮下、四肢腋下***和足垫，总量为0.5mL/只。

注：(1)BALB/c小鼠的泪液分泌实验:采用Schirmer I实验(Schirmer I test)测量BALB/c小鼠泪液的分泌量。即用眼科镊夹住酚红棉线，置于BALB/c小鼠外眦部，60秒后取出测量酚红棉线湿润的长度。(2)泪膜破裂时间(BUT)：使用微量加液器在BALB/c小鼠下方结膜囊内滴入1μl用裂隙灯显微镜的钴蓝光观察角膜，当角膜绿色薄膜出现黑区时，表示泪膜破裂。连续测3次，取其平均值。正常BUT为10～15秒，少于10秒为异常，重复测量3次，取平均值。

4.实验结果

试验结果表明(表1-表3)：

(1)给药第一天，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠酚红棉线长度、泪膜破裂时间明显变短，有统计学差异(P<0.01)；与模型对照组相比，他克莫司(0.1％)滴眼液组酚红棉线长度明显增长、泪膜破裂时间明显延长，有统计学差异(P<0.01)，雷公藤提取物滴眼液0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL组酚红棉线长度也明显增长，有统计学差异(P<0.01)，雷公藤提取物滴眼液0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL小鼠泪膜破裂时间明显延长，有统计学差异(P<0.01)。

(2)给药第四天，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠酚红棉线长度、泪膜破裂时间明显变短，有统计学差异(P<0.01)；与模型对照组相比，他克莫司(0.1％)滴眼液组酚红棉线长度明显增长、泪膜破裂时间明显延长，有统计学差异(P<0.05或0.01)，雷公藤提取物滴眼液0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL组酚红棉线长度也明显增长，有统计学差异(P<0.01)，雷公藤提取物滴眼液0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL小鼠泪膜破裂时间明显延长，有统计学差异(P<0.01)。

(3)给药第七天，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠酚红棉线长度、泪膜破裂时间明显变短，有统计学差异(P<0.01)；与模型对照组相比，他克莫司(0.1％)滴眼液组酚红棉线长度明显增长、泪膜破裂时间明显延长，有统计学差异(P<0.01)，雷公藤提取物滴眼液0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL组酚红棉线长度也明显增长，有统计学差异(P<0.05或0.01)，雷公藤提取物滴眼液0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL组小鼠泪膜破裂时间明显延长，有统计学差异(P<0.01)。

组织病理学研究结果表明，与阴性对照组比较，造模后动物均可见结膜不同程度的病理变化，主要表现为结膜穹窿部上皮细胞不同程度增生、细胞层数增多、排列紊乱，上皮层杯状细胞数量不同程度增多，少量动物部分杯状细胞呈空泡状。结膜其他部位组织结构未见明显异常。

各给药组与模型组比较，综合结膜病变程度及出现的例数，缓解程度按照“他克莫司滴眼液1mg/mL组(C)≈雷公藤提取物滴眼液1mg/mL组(I)≈雷公藤提取物滴眼液0.5mg/mL组(H)＞雷公藤提取物滴眼液2mg/mL组(J)≈雷公藤提取物滴眼液0.25mg/mL组(G)≈雷公藤提取物滴眼液4mg/mL组(K)＞雷公藤提取物滴眼液0.125mg/mL组(F)＞雷公藤提取物滴眼液0.0625mg/mL组(E)＞模型对照组(B)＞”递减。

5.实验结论

雷公藤甲素为雷公藤提取物已知的重要成分之一，也是雷公藤提取物质量控制的主要成分，其分子量为360.4道尔顿。雷公藤甲素具有很强的免疫抑制等药理作用，雷公藤以及雷公藤甲素临床上主要用于免疫亢进型疾病，如风湿性和类风湿性关节炎、***红斑狼疮等。他克莫司滴眼液主要成分为他克莫司，又名FK506，分子量822.05，为临床肝肾移植的一线用药，滴眼液主要应用于抗过敏治疗效果不明显的春季结膜炎患者。本发明主要通过小鼠干燥综合征模型考察不同浓度雷公藤提取物滴眼液对干眼症的改善作用，筛选出合适的药物浓度。研究结果表明，给药第一天、第四天、第七天，雷公藤提取物滴眼液0.5、1、2、4mg/mL组(0.05％、0.1％、0.2％、0.4％)、他克莫司组(1mg/mL，0.1％)能明显增加酚红棉线的长度，同时，相应剂量组也能延长小鼠泪膜破裂时间，但雷公藤提取物滴眼液在剂量为0.0625、0.125、0.25mg/mL时给药第一天、第四天、第七天仅能延长小鼠泪膜破裂时间，但对酚红棉线的长度未见明显影响。组织病理学研究结果表明雷公藤提取物滴眼液在药物浓度为0.5、1mg/mL(0.05％、0.1％)时对组织学的改善作用更明显，在其他浓度时改善作用相对较弱。

综合泪液分泌试验结果、泪膜破裂时间结果和组织病理学结果，可认为雷公藤提取物滴眼液在浓度为0.5％～1.0％时均已经达到药效的平台期，在该浓度下即可达到较好的药效，继续增加药物浓度获得更大的药效结果的可能性较小。根据上述研究结果可认为雷公藤提取物滴眼液在剂量为0.25～4mg/ml。(0.025％、0.4％)时对干眼症具有较好的改善作用，药效作用达峰浓度为0.5～1mg/ml(0.05％、0.1％)。

表1雷公藤提取物滴眼液对小鼠结膜干燥综合征模型酚红棉线长度和泪膜破裂时间的影响(

Day1)

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表2雷公藤提取物滴眼液对小鼠结膜干燥综合征模型酚红棉线长度和泪膜破裂时间的影响(

Day4)

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表3雷公藤提取物滴眼液对小鼠结膜干燥综合征模型酚红棉线长度和泪膜破裂时间的影响(

Day7)

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

实验例2雷公藤提取物滴眼液对兔碱烧伤型干眼症的治疗作用

1.实验方法

选用适应性观察合格的新西兰兔，先进行眼科检查(荧光素钠法)，淘汰有眼睛刺激症状和结膜损伤的动物。剩下动物进行造模(每只动物右眼造模)，造模方法：每只新西兰兔采用3％的戊巴比妥静脉麻醉和2％利多卡因滴眼表面麻醉。然后用1张约10mm×5mm大小的滤纸条蘸1mol/L的NaOH溶液置于距兔角膜缘上方约2mm的睑结膜上，90s后立即用50mL生理盐水反复冲洗结膜囊。术后第一天行结膜荧光素染色、结膜虎红染色、酚红棉线试验、泪膜破裂时间和泪液蕨样变试验，并根据荧光素染色和虎红染色的评分进采用分组方法一进行均衡随机分组，共分为5组，分别为：模型组、雷公藤提取物滴眼液低剂量组、雷公藤提取物滴眼液高剂量组、阳性对照组贝复舒组、雷公藤甲素滴眼液组，每组6只动物，雌雄兼有，每只动物左眼作为自身对照的阴性对照，分组后立即给予相应的药物，4次/天，每次给药间隔约为2h，每次滴眼后被动闭合眼睑至少10s，连续给药10天，阴性对照眼和模型组给予同体积的生理盐水，造模后第1、5、10天在裂隙灯下观察眼结膜充血情况、角膜透明度、新生血管状况，同时行结膜荧光素染色、结膜虎红染色、酚红棉线试验、泪膜破裂时间检查方法与酚红棉线和泪膜破裂时间测定方法与前述方法一致)。具体检查方法如下：(1)结膜荧光素染色：在结膜囊内滴1％荧光素钠2μl于结膜囊，5s后用0.9％的生理盐水冲洗多余的荧光素，在裂隙灯显微镜下，钴蓝色弥散光观察结膜染色情况。结膜荧光染色评分标准：将结膜分成四个象限,每个象限根据染色程度和面积分为四个等级：0分为无染色；1分为散在点状染色；2分为密集点状染色；3分为片状染色，共12分。(2)结膜虎红染色：在结膜囊内滴1％虎红2μl于结膜囊，5s后用0.9％的生理盐水冲洗多余的虎红，在裂隙灯显微镜下，绿光观察结膜染色情况。结膜虎红染色评分标准与结膜荧光染色标准一致。取病变区(造模区)结膜行组织病理学检查。

2.实验结果

眼科检查试验结果表明(表4-6)：造模后D1天，与阴性对照组比较，模型组与各药物组酚红棉线湿润长度未见明显差别，无统计学意义(P>0.05)，模型组与各药物组泪膜破裂时间明显缩短，与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05或0.01)，荧光和虎红染色评分明显增高，与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各药物组酚红棉线长度、泪膜破裂时间、荧光染色和虎红染色评分均未见明显差别，无统计学意义(P>0.05)。造模后5天，与阴性对照组比较，模型组与各药物组酚红棉线湿润长度明显缩短，与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.01)，模型组与各药物组泪膜破裂时间明显缩短，与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.01)，荧光素钠和虎红染色评分明显增高，与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各药物组酚红棉线长度、泪膜破裂时间、荧光染色和虎红染色评分均未见明显差别，无统计学意义(P>0.05)。造模后D10天，与阴性对照组相比，模型组酚红棉线湿润长度减少、泪膜破裂时间缩短、荧光素和虎红染色评分升高与阴性对照组相比具有明显差别，有统计学意义(P<0.05或0.01)。与模型组相比，雷公藤提取物低剂量组酚红棉线湿润长度、泪膜破裂时间、荧光素和虎红染色评分未见明显差别，未见统计学差异(P>0.05)。雷公藤提取物高剂量组和雷公藤甲素组荧光素和虎红染色评分明显降低，酚红棉线长度明显增加，泪膜破裂时间明显延长，与模型组相比有统计学意义(P<0.05)。贝复舒组酚红棉线长度明显增加、荧光素和虎红染色评分明显减少，与模型组相比有统计学意义(P<0.05或0.01)。

病理组织学检查结果表明：各例动物左眼眼睑结膜及眼球结膜组织结构基本正常，上皮层杯状细胞丰富，排列整齐，其他上皮细胞未见明显损伤；上皮下组织未见组织排列疏松、纤维组织增生及炎细胞浸润等变化；血管未见明显扩张；各例造模侧动物眼睑结膜均可见不同程度的损伤，主要表现为造模部位眼睑结膜上皮层杯状细胞明显减少或消失；其他上皮细胞增生，细胞层数增多；上皮下少量或一些纤维组织增生，伴少量炎细胞浸润；部分动物穹窿部血管扩张充血等变化；与模型组比较，雷公藤提取物高剂量组、雷公藤甲素组、阳性对照贝复舒组实验动物眼睑结膜上皮层杯状细胞明显减少症状，稍有减轻趋势，组间差异性不明显，减轻程度不显著；阳性对照贝复舒组炎症反应及血管充血性未见明显改善；眼睑结膜上皮细胞增生及少量纤维组织增生性变化及病变程度，阳性对照贝复舒组较明显，其他给药组程度稍轻。

3.实验结论

结果表明，与阴性对照眼相比，碱烧伤后模型组动物day1-day10右眼泪膜破裂时间、酚红棉线湿润长度均明显缩短，荧光素和虎红染色评分均明显增高，造模损伤局部组织病理学表明各例造模侧动物眼睑结膜均可见不同程度的损伤，主要表现为造模部位眼睑结膜上皮层杯状细胞明显减少或消失。该结果提示虽然随着造模后时间的延长，荧光素和虎红染色评分值逐渐降低，但在末次处理前其评分仍然明显高于阴性对照组，且其泪膜破裂时间和酚红棉线湿润长度也明显短于阴性对照组，表明虽然停止造模10天，动物球结膜损伤局部得到一定程度的自我恢复，但干眼症模型依旧存在，模型复制成功。

雷公藤提取物高剂量组给药第10天能明显降低模型动物眼部的荧光素和虎红染色评分值，酚红棉线湿润长度和泪膜破裂时间也有明显的改善作用，组织病理学研究结果也表明雷公藤提取物对杯状细胞的减少具有一定的改善作用，对结膜损伤部位和结膜穹窿部位的充血和水肿也具有明显的改善作用。分析雷公藤提取物降低模型动物眼部荧光素和虎红染色评分值以及改善结膜损伤部位和结膜穹窿部充血水肿情况与雷公藤提取物的抗炎作用有关。

阳性对照品贝复舒本品主要成份为重组牛碱性成纤维细胞生长因子(DFGF)并含有聚乙烯醇(PVA液膜成份)。牛碱性成纤维胞生长因子对来源于中胚层和外胚层的细胞具有促进修复和再生作用。本发明结果表明，贝复舒给药10天后能延长酚红棉线湿润长度，降低荧光素和虎红染色评分值，对损伤局部杯状细胞的减少也具有一定的改善作用，但对损伤局部和结膜穹窿部的充血水肿未见明显改善作用，分析其酚红棉线湿润长度增长与其修复损伤局部有关，而贝复舒不具有抗炎作用，因此对损伤部位和结膜穹窿部的充血水肿无改善作用，这与贝复舒的作用机制非常一致。

雷公藤甲素是雷公藤提取物的主要活性成份之一，属于二萜类化合物，其活性主要和免疫抑制有关，也是雷公藤的主要毒性成分之一，其抗炎作用相对较弱。本发明中碱烧伤模型造模后可引起眼局部明显的充血、水肿等表现，后续引起泪液分泌减少、泪膜稳定降低而产生干眼症，从理论上分析凡是可降低眼局部炎症水肿、增加泪液分泌、增强泪膜稳定性的药物均能改善模型动物的临床症状，结果表明，雷公藤甲素滴眼液对碱烧伤干眼症模型的改善作用稍弱于等剂量的雷公藤提取物滴眼液，分析可能与雷公藤提取物中不仅含有等量的雷公藤甲素，还与本发明雷公藤提取物中还含有二萜类、三萜类和生物碱类的其他化合物有关。

综上所述，可判断雷公藤提取物滴眼液在剂量为400μg/眼/天(1mg/ml，100μl/眼/次，4次/天)对碱烧伤新西兰兔干眼症模型具有明显的改善作用，其改善作用主要表现为增加模型动物泪液分泌量、延长泪膜破裂时间、降低干眼症模型结膜充血、水肿程度和改善碱烧伤局部杯状细胞的减少情况，且其对碱烧伤模型的改善作用强于雷公藤甲素滴眼液。

表4造模第一天酚红棉线、泪膜破裂时间、染色评分结果表

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表5造模第五天酚红棉线、泪膜破裂时间、染色评分结果表

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表6造模第10天酚红棉线、泪膜破裂时间、染色评分结果表

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

实验例3雷公藤提取物滴眼液对真菌性角膜炎的治疗作用

选用适应性观察合格的新西兰兔，先进行眼科检查(荧光素钠法)，淘汰有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物。随机抽取4只动物为阴性对照组。然后将剩余动物进行第三眼睑切除，切除后涂氧氟沙星眼膏，观察3天后，氧氟沙星滴眼液预防性滴眼3d，每日4次，每次1-2滴。预防性滴眼结束后造模。造模时，除阴性对照组外其他新西兰兔均采用3％的戊巴比妥静脉麻醉和2％利多卡因滴眼表面麻醉，7.0mm环钻于实验眼角膜中央压痕，15℃角膜穿刺刀刮除切割范围内的全层角膜上皮，然后用微量进样器角膜内注射浓度为1.5×10⁸CFU/mL镰刀腐皮菌10μl，然后用角膜接触镜覆盖，并将角膜与角膜接触镜之间空隙处的气泡挤出。结膜囊涂氧氟沙星眼膏，3-0丝线间断缝合眼睑2针使眼睑闭合，术后48h拆除眼睑缝线，去除角膜接触镜，进行角膜评分，根据评分将动物分为4组，即：模型组、雷公藤提取物滴眼液低、高剂量组，那他霉素滴眼液剂量组，雌雄各半。分组后立即给予相应的药物，4次/天，每次给药间隔约为2h，每次滴眼后被动闭合眼睑至少10s，阴性对照组和模型组给予0.9％的氯化钠溶液。连续给药7天。术后每日观察各组兔角膜感染情况，分别在菌株接种后的第3、5、7天行裂隙灯显微镜检查并照相，同时分组前行刮片检查。其中，兔眼感染程度评分标准参考表1进行评分，并在造模3、5、7天行角膜评分。分组前行刮片检查操作步骤如下：用尖刀片刮取角膜溃疡区域边缘角膜组织，吉姆萨染色观察病菌形态，已明确模型建立情况。试验结束时采取气体栓塞法处死动物，取下眼球后,用眼科剪延角膜缘剪下整个角膜，标本行病理学检查。

表7新西兰兔眼感染程度评分标准

实验结果：

眼科观察试验结果表明(表8-10)：给药Day1、Day3天，与阴性对照组比较，模型组与各药物组角膜混浊面积评分、角膜透明度评分、角膜表面评分、总分评分(角膜混浊面积评分+角膜透明度评分+角膜表面评分)明显增高，有统计学意义(P<0.05或0.01)；与模型组比较，各药物组以上各指标未见明显改变，无统计学意义(P>0.05)。给药Day5天，与阴性对照组比较，模型组和各药物组角膜混浊面积评分、角膜透明度评分、分泌物评分、总分评分(角膜混浊面积评分+角膜透明度评分+角膜表面评分)均明显升高，与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05或0.01)。与模型组比较，雷公藤提取物高剂量组及阳性对照那他霉素组角膜表面评分均明显降低，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)，其他各项指标评分未见明显下降与模型组比较无统计学意义(P>0.05)。

组织病理学研究结果表明，阴性对照组各例动物角膜结构未见异常：上皮层结构完整，上皮细胞排列整齐、形态正常，未见增生或脱落；基质层纤维组织平行排列，未见水肿或炎细胞浸润，角膜缘基质内未见小血管。模型组与阴性对照组比较，造模后动物双侧眼球角膜均可见不同程度的病理变化，主要表现为角膜上皮细胞增生、角膜基质水肿、基质层纤维组织排列紊乱、基质层炎细胞浸润及角膜缘新生血管。各给药组与模型组比较，上述病理变化均有所缓解。其中，雷公藤提取物高剂量组对基质内纤维组织坏死的缓解作用明显高于那他霉素组。

实验结论：

雷公藤提取物含有生物碱类、二萜类、三萜类和倍半萜类化合物，其中二萜类的雷公藤甲素具有很强的免疫抑制作用，被认为是雷公藤及其制剂的主要活性成分之一，此外雷公藤提取物滴眼液还含有三萜类、生物碱类、倍半萜类化合物与抗炎作用相关。本发明结果表明，与模型组相比，雷公藤提取物高剂量组给药第5天角膜表面评分明显降低，组织病理学也表明给药5天后，各给药组与模型组比角膜上皮细胞增生、角膜基质水肿、基质层纤维组织排列紊乱、基质层炎细胞浸润及角膜缘新生血管病理变化均有所缓解。那他霉素作为治疗真菌性角膜炎的有效药物，可有效预防新生血管、虹膜炎、斑翳等并发症的发生，试验结果表明那他霉素能降低角膜表面评分，但对角膜上皮细胞增生、角膜基质水肿、基质层纤维组织排列紊乱、基质层炎细胞浸润等真菌性角膜炎急性期改变作用不明显。考虑本模型为真菌注射到角膜内复制的模型，其早期主要以急性炎症反应为主，而那他霉素不具有明显的抗炎作用，因此，对模型作用不明显。

综上所述，判断雷公藤提取物滴眼液在剂量为200、400μg/眼/天(1mg/ml，50μl、100μl/眼/次，4次/天)时对真菌性角膜炎模型具有明显的改善作用，其改善作用主要表现为降低兔角膜表面评分、抑制角膜基质内纤维组织的坏死和新血管的增生。

表8雷公藤提取物滴眼液对新西兰兔真菌性角膜炎眼感染评分结果表(D1,

)

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表9雷公藤提取物滴眼液对新西兰兔真菌性角膜炎眼刺激评分结果表(D3,

)

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表10雷公藤提取物滴眼液对新西兰兔真菌性角膜炎眼刺激评分结果表(D5,

)

与阴性对照组比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (1)

1.雷公藤提取物在制备用于治疗干眼症的滴眼液中的应用；所述的雷公藤提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)取雷公藤药材饮片，用70～95％乙醇提取，滤过、合并滤液、减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.15～1.35的浸膏，再用中性氧化铝吸附、减压干燥、粉碎，得到雷公藤乙醇提取物中性氧化铝拌样；

(2)在雷公藤乙醇提取物中性氧化铝拌样中加入三氯甲烷进行提取，滤过取滤液，回收三氯甲烷，干燥，得到雷公藤提取物。