CN107630003B

CN107630003B - 一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基和诱导方法

Info

Publication number: CN107630003B
Application number: CN201711081393.3A
Authority: CN
Inventors: 魏伟; 嵐山芮; 王雅茹
Original assignee: Guangzhou Ruiplatinum Health Technology Co Ltd; Guangzhou Tianhe Nuoya Bioengineering Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruiplatinum Health Technology Co Ltd; Guangzhou Tianhe Nuoya Bioengineering Co ltd
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2037-11-03
Also published as: CN107630003A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基和诱导方法。本发明提供了一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基、诱导方法，所述诱导培养基包括白皮杉醇、基本培养基，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为62.5～250μmol/L；所述诱导方法为将脐带间充质干细胞用上述诱导培养基培养，定向分化得到神经样细胞。本发明提供的方法诱导时间短，且可诱导产生神经元和神经胶质混合的神经样细胞，为中枢神经***的损伤修复提供一种新的细胞来源。

Description

一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基和诱导方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基和诱导方法。

背景技术

神经***疾病严重的威胁着人类的身体健康，如众所周知的帕金森病和阿尔茨海默症，以及出血性脑中风、创伤疾病和脊髓损伤等均是由于分化成熟的神经细胞不能***增殖以弥补损伤和死亡的细胞造成的。目前，治疗神经***疾病的方法多为自体神经移植，但自体神经移植存在着来源有限，因此寻找其他来源的细胞是进行神经***疾病细胞移植和治疗的关键所在。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，在特定条件下能够向成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌肉细胞、软骨细胞等分化。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的成体干细胞，在细胞替代治疗和组织工程学方面具有很大的应用价值。间充质干细胞可在骨髓、脐带、皮肤、肌肉、外周血等组织中分离获得，其中人脐带来源的间充质干细胞与其他来源的间充质干细胞相比，脐带的成本较低免疫原性低且来源没有伦理学争议。

中药是我国的国粹，在治病强身方面有着神奇的治疗已被世界认可。有些中药在治疗神经***疾病方面有着很好的优势。目前还没有白皮杉醇使得间充质干细胞定向分化为神经样细胞的报道。中药提取物白皮杉醇是一种在葡萄、甘蔗等中发现的多酚物质，具有较强的抗氧化作用，并具有一定的神经***保护作用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基和诱导方法。

另外，本发明还提供了一种白皮杉醇或上述诱导培养基在诱导脐带间充质干细胞分化为神经样细胞中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基，所述诱导培养基包括白皮杉醇、基本培养基。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为62.5～250μmol/L。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为62.5μmol/L、125μmol/L或250μmol/L。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述基本培养基为L-DMEM培养基、MEM培养基或RPMI1640培养基中的一种。

一种脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法，包括以下步骤：将脐带间充质干细胞用上述所述诱导培养基培养，定向分化得到神经样细胞。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述培养的时间0.5～6小时。

所述的神经样细胞为神经元和神经胶质的混合神经样细胞

作为对上述技术方案的进一步改进，所述脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法，包括以下步骤：

(1)取用间充质干细胞培养基培养中的hUC-MSCs，弃去间充质干细胞培养基，加生理盐水冲洗，用胰酶消化液消化，加培养基终止消化，离心，弃去上清，加入间充质干细胞培养基重悬细胞；

(2)将细胞传至经多聚赖氨酸包被含有消毒盖玻片的六孔板内，待细胞达到60～70％融合度时，换成含白皮杉醇的培养基。

进一步地，步骤(1)所述间充质干细胞培养基为Fasgrow培养基或UltraCULTURE培养基。

进一步地，步骤(2)所述多聚赖氨酸包被含有消毒盖玻片的六孔板的包被方法为：在放有盖玻片的六孔板中，加入多聚赖氨酸，并放于培养箱中培养，从培养箱中取出六孔板，弃去多聚赖氨酸，用纯水清洗，晾干，备用；

进一步地，所述多赖氨酸浓度为100μg/ml，用量1ml，所述的培养为37℃、5％CO₂培养箱中培养3h。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法，在该诱导方法步骤之前还包括脐带间充质干细胞的分离、培养、扩增。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法，在该诱导方法之后还包括免疫组织化学染色。

本发明提供的技术方案的有益效果为：

(1)本发明使用含有白皮杉醇的诱导培养基培养脐带间充质干细胞，使其定向分化为神经样细胞；

(2)本发明提供的诱导方法诱导时间短，且诱导产生神经元和神经胶质混

合的神经样细胞，为中枢神经***的损伤修复提供一种新的细胞来源。

附图说明

图1是P4代脐带间充质干细胞MSC表面标志的流式细胞术检测图；

图2是脐带间充质干细胞经白皮杉醇诱导后NSE染色图(100倍和200倍)；

图3是脐带间充质干细胞经白皮杉醇诱导后GFAP染色图(100倍和200倍)。

具体实施方式

实施例1

本发明是脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基的一种实施例，本实施例所述脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基包括白皮杉醇和基本培养基，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为62.5μmol/L，所述基本培养基为L-DMEM培养基。

本实施例脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法具体如下：

①脐带间充质干细胞的分离、培养、扩增

无菌条件下，取健康胎儿的脐带10cm，放入盛有酒精的培养皿中浸泡一分钟，再放入盛有生理盐水的培养皿中清洗除去血块以及残留酒精；接着放入下一个盛有生理盐水的培养皿中，将整条脐带剪成3cm长短的小段，并用剪刀和镊子将血管中残留的血液挤出，然后沿脐动脉将脐带剪开清洗内部。

将剪成小段的脐带组织放入最后一个空的培养皿中，用组织镊将脐带撕开，剥离两条血管，撕下分布在血管周围的华尔通氏胶，将分离出来的华尔通氏胶放入50ml离心管中，加入3ml FasGrow培养基，用剪刀将华尔通氏胶剪成1mm大小的碎块，再加入15mlFasGrow培养基，混匀后平均放入6个T25的培养瓶中。

制备后每隔3天取出培养瓶在显微镜下观察细胞生长状态，制备后的第3天向每个培养瓶中添加约1ml培养基，重新放入培养箱中37℃、5％CO₂培养；制备后第7天在显微镜下观察细胞状态，然后将培养瓶中的培养基以及组织块倒出，更换新鲜培养基，每个培养瓶3ml，重新放入培养箱中37℃、5％CO₂培养。所得细胞即为脐带原代间充质干细胞。

将培养箱中的培养瓶取出观察细胞生长状况，当超过半数培养瓶中的细胞都已经达到80％密度时，表示这一批细胞可以传代。一般来说原代细胞生长到80％密度时需要7～14天。以后每代之间培养天数为3天。

待细胞密度长至80％左右时，弃去培养基，用生理盐水冲洗两次，加胰酶0.5ml消化，将培养瓶横置，来回晃动以使胰酶均匀覆盖整个瓶底；消化一分钟，肉眼可见细胞已经成片的脱离瓶底，即可加入离心管中的培养基2ml终止消化。将细胞悬液移入离心管，500g离心5min。弃去上清，加入培养基重悬细胞，倒入T75培养瓶于37℃、5％CO₂培养箱中培养，记为P1代细胞。

待细胞增殖达80％以上融合时，重复以上传代过程，记为P2代，以此类推，继续传代至P4代，并进行流式检测。

结果详见图1，P4代脐带间充质干细胞中CD90阳性细胞数为99.76％，CD105阳性细胞数为98.54％，CD73阳性细胞数为97.34％，CD45阳性细胞数为0.04％，CD34阳性细胞数为0.03％，是间充质干细胞。

②白皮杉醇诱导间充质干细胞分化为神经样细胞

多聚赖氨酸包被六孔板：取浓度100μg/ml多聚赖氨酸1ml，加入放有盖玻片的六孔板中，并放于37℃、5％CO2培养箱中3h左右，从培养箱中取出六孔板，弃去多聚赖氨酸，用纯水2ml清洗3次，晾干，备用。

取对数生长期及生长状态良好的P4代hUC-MSCs，弃去培养基，加生理盐水冲洗3次，用1ml胰酶消化液消化，加培养基5ml终止消化，将细胞悬液移入离心管，500g离心5min。弃去上清，加入培养基重悬细胞至浓度1×10⁵/ml，将细胞传至经多聚赖氨酸包被的含有消毒盖玻片的六孔板内，每孔3ml，待细胞达到60-70％融合度时，换成含62.5μmol/L白皮杉醇的L-DMEM培养液诱导，每隔半小时用倒置显微镜观察细胞形态变化1次，诱导六小时后终止诱导。

③免疫组织化学染色

弃去上述诱导6h时六孔板中的培养基，用0.01M PBS轻轻洗涤2次，然后用4％多聚甲醛室温下固定20min；用PBS在室温洗涤3次，每次5min，；用含0.5％Triton-X-100的PBS室温避光破膜15min；用PBS在室温洗涤3次，每次5min；加入3％H2O2去离子水室温孵育5min，阻断内源性过氧化物酶活性；PBS洗涤3次，每次5min；滴加封闭用正常山羊的血清工作液，室温孵育15min，倾去，勿洗；滴加按比例NSE(1:200)、GFAP(1:200)、NF-H(1:200)稀释的一抗，4℃过夜；PBS洗涤3次，每次5min；滴加生物素化的二抗工作液，室温孵育15min；PBS洗涤3次，每次5min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温下孵育15min；PBS洗涤3次，每次5min；新鲜配制的DAB显色液显色1min，苏木素进行复染；自来水反复冲洗。用显微镜观察，拍照。白皮杉醇诱导间充质干细胞为神经样细胞的免疫组织化学染色见图2、图3，NSE和GFAP免疫化学组化染色表现为棕黄色，显色阳性。

结果：加入含62.5μmol/L白皮杉醇的L-DMEM培养基诱导，细胞有向神经样细胞形态的转变，但最多只有20％的间充质干细胞有神经样细胞形态的转变。

62.5μmol/L的白皮杉醇诱导1h时，约10％的细胞胞体收缩呈圆形或椭圆形，遮光性变强，细胞边缘模糊，小部分细胞突起有分支，但分支较短，且有少量细胞脱离瓶壁，但未完全脱离漂浮；诱导2h时，胞体收缩的细胞数量明显增多，比例可达55％左右，且细胞分支仍较短，并伴随较多细胞脱落；诱导4h后，细胞折光性增强，细胞边缘变清晰，细胞分支仍较短；诱导5h时，62.5μmol/L的白皮杉醇诱导的细胞形态与诱导4h时的细胞形态无太大差异；诱导6h后，细胞分支变长，但是多数细胞脱落，只剩约20％的贴壁神经样细胞。

实施例2

本发明是脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基的一种实施例，本实施例所述脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基包括白皮杉醇和基本培养基，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为125μmol/L，所述基本培养基为L-DMEM培养基。

本实施例脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法具体操作与实施例1相同，不同点在于所用诱导培养基中白皮杉醇的浓度为125μmol/L。

结果：加入含125μmol/L白皮杉醇的L-DMEM培养基诱导，仅需诱导间充质干细胞2h时便可获得90％的神经样细胞。

125μmol/L的白皮杉醇诱导0.5h时，约45％细胞胞体收缩成圆形或椭圆形，折光性变强，小部分细胞出现突起，但分支很短；诱导1h时，神经样细胞的比例可达65％左右，细胞突起变多且分支变长，细胞进一步收缩，相邻的细胞分支相互连接交织成网状，有少量细胞脱离瓶壁，但未完全脱离漂浮。诱导2h时，细胞突起分支延长，且突起分叉比较明显，视野中可见大片神经样细胞，各细胞突起之间相互连接呈网状，神经样细胞比例可达90％左右，且漂浮细胞数量较之前稍显增多；诱导4h时，可见约5％神经样样细胞脱落；诱导6h时，约20％的神经样细胞脱落瓶壁。

实施例3

本发明是脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基的一种实施例，本实施例所述脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导培养基包括白皮杉醇和基本培养基，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为250μmol/L，所述基本培养基为L-DMEM培养基。

本实施例脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导方法具体操作与实施例1相同，不同点在于所用诱导培养基中白皮杉醇的浓度为250μmol/L。

结果：加入含250μmol/L白皮杉醇的L-DMEM培养基诱导，仅需诱导间充质干细胞2h时便可获得90％的神经样细胞。

250μmol/L的白皮杉醇诱导0.5h后，约60％细胞的胞体收缩成圆形或椭圆形，并伸出较短的突起，折光性变强；诱导1h后，细胞突起变多且长度增长，神经样细胞的比例可达75％左右，细胞进一步收缩，相邻细胞突起相互连接交织成网状；2h时，细胞突起更多，分支更长，且突起分叉比较明显，视野中可见大片状神经样细胞，各细胞突起之间相互连接呈网状，神经样细胞比例可达90％左右；4h时可见约5％神经样细胞漂浮；6h时，脱落细胞比例约为10％，神经样细胞比例可达85％。

Claims

1.白皮杉醇在诱导脐带间充质干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞中的应用。

2.一种脐带间充质干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：将脐带间充质干细胞用含有白皮杉醇的诱导培养基培养，定向分化得到神经元细胞和神经胶质细胞，所述白皮杉醇在诱导培养基中的浓度为 62.5~250μmol/L。

3.根据权利要求2 所述的脐带间充质干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基培养的时间为 0.5~6 小时。

4.根据权利要求2 所述的脐带间充质干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞的诱导方法，其特征在于，所述诱导方法包括以下步骤：

（1）取用间充质干细胞培养基培养中的 hUC-MSCs，弃去间充质干细胞培养基，加生理盐水冲洗，用胰酶消化液消化，加培养基终止消化，离心，弃去上清，加入间充质干细胞培养基重悬细胞；

（2）将步骤（1）重悬后的间充质干细胞转至经多聚赖氨酸包被含有消毒盖玻片的六孔板内，待细胞达到 60~70%融合度时，采用含有白皮杉醇的诱导培养基培养。

5.根据权利要求4 所述的脐带间充质干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞的诱导方法，其特征在于，所述步骤（2）中，多聚赖氨酸包被含有消毒盖玻片的六孔板的包被方法为：在放有盖玻片的六孔板中，加入多聚赖氨酸，并放于培养箱中培养，从培养箱中取出六孔板，弃去多聚赖氨酸，用纯水清洗，晾干，备用。

6.根据权利要求4所述的脐带间充质干细胞分化为神经元细胞和神经胶质细胞的诱导方法，其特征在于，所述步骤（1）之前还包括步骤（1a）：脐带间充质干细胞的分离、培养、扩增。