CN107629042B - 一种快速分析铜离子的比色荧光探针、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速高选择性高灵敏铜离子比色荧光探针。具体地，本发明的探针为一类吡啶甲酸酯类化合物，其可作为铜离子比色荧光探针用于铜离子的检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：高选择性地识别铜离子；可以较快的对铜离子实现响应；可以实现对铜离子的高灵敏分析；性质稳定，可以长期保存使用；水溶性特别好；以及具有较强的抗干扰能力。

Description

一种快速分析铜离子的比色荧光探针、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及吡啶甲酸酯类化合物作为铜离子荧光探针，能够迅速对铜离子高选择性灵敏识别，或者其可测定样品中铜离子的浓度。

背景技术

铜作为一种重金属元素，也是动植物和人体所必需的微量元素，同时对生态环境也有重要的影响。重金属污染是危害最大的水土污染问题之一。重金属通过矿山开采，金属冶炼，金属加工及化工生产废水，化石燃料的燃烧，施用农药化肥和生活垃圾等人为污染源，以及地质侵蚀，风化等天然源形式进入水体，加之重金属具有毒性大，在环境中不易被代谢，易被生物富集并有生物放大效应等特点，不但污染水环境，也严重威胁人类和水生生物的生存。铜在人体细胞中铜的含量仅次于锌和铁，对于血管、中枢神经和免疫***、头发、骨骼及大脑、肝脏等的发育和功能有重要的影响。人体内如果缺少了铜元素则可能会导致贫血、冠心病、脑组织萎缩、精神发育受阻、毛发脱色、白化病等疾病。但是体内铜元素过多，对于人类身体也会产生很大的危害，会引起运动失调、神经细胞和脑组织发生病变，导致帕金森综合症、门克斯氏综合征、威尔逊氏症和阿尔兹海默症等病症。同样微量的铜能促进动植物的生长，但当在生物体内累积到一定程度后，就会出现生理受阻、发育迟缓，甚至死亡，对整个水生态环境的影响很大。

鉴于此，发展能够有效检测，特别是能够在水环境中检测铜离子的分析方法是极其重要和有意义的。已报导的检测铜离子的分析方法包括光学分析法，容量分析法，铜离子选择电极法，离子色谱法(IC)等方法。在这些众多的检测方法中比色荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。然而，目前报道的比色荧光探针仍存在一些问题，包括合成复杂、选择性不够好、响应速度不够快等。同时由于水环境中其他金属离子，如三价铁离子、钙离子、铝离子、锡离子、锌离子、铬离子、钾离子、镁离子、钠离子、二价铁离子、钴离子及镍离子等会对铜离子的检测构成潜在干扰，因此，发展快速高选择性比色荧光探针成为急需解决的课题。饮水中含铜离子的限制浓度最高为20μM，给铜离子的检测带来很大困难，因此发展能够高灵敏性检测水环境中铜离子的分析方法是必要的。总之，发展快速、高选择性、高灵敏度、合成简单的铜离子比色荧光探针是本领域技术人员急需解决的。

发明内容

本领域急需一种制备简单的快速高选择性铜离子比色荧光探针，从而能够有效检测铜离子。为此，本发明合成了一类新颖的铜离子比色荧光探针，其合成简单、选择性高、灵敏度高、水溶性好、能够快速识别铜离子。本发明还提供了上述比色荧光探针的制备方法，以及在制备用于检测样本中铜离子浓度的制剂中的应用。

本发明是通过以下措施来实现的。

具体而言，本发明提供了一种铜离子荧光探针，其为吡啶甲酸酯类化合物，其结构如式1所示：

式1

上式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈为氢原子、碳原子数1-3直链或支链烷基、碳原子数1-3的直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基、羧基。

优选的，本发明的荧光探针，其结构如式2所示：

式2

本发明还提供了铜离子荧光探针的制备方法，其特征在于采用以下步骤:

将式3所示的2-吡啶甲酸溶于二氯甲烷中，再加入式4所示的对羟基苯甲醛，二者摩尔比是2:1，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)的催化作用下，常温搅拌5h，然后进行抽滤，得到纯品式5。

式3 式4 式5

将式6所示的3-OH-3-CH3-2-丁酮溶于吡啶，加2-3滴乙酸，再加入式7所示的丙二腈，二者的摩尔比为1:2，在25℃油浴中反应24h，然后进行抽滤，得到纯品式8

式6 式7 式8

将式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于无水乙醇，再加入式8所示的腈，二者的摩尔比是1:1，在哌嗪的催化作用下，常温搅拌10h，然后进行抽滤，得到粗产品式2。如果要得到较纯的产品，可以利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系，进行提纯得到纯品。

式5 式8 式2

优选的，本发明的探针是相应的吡啶甲酸酯类化合物。

本发明还提供了检测样本中铜离子浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本中铜离子浓度的制剂中的用途。

如上所述的应用，首先配制探针储备液：称量5 mg的式2加入到比色管中，加入1mL的二氯甲烷，摇匀，使探针溶解，再用无水乙醇定容到10 mL，配制成1 mM的探针储备液。

然后，移取50 µL的探针储备液(1 mM)放进10 mL比色管中，加入4-6mL蒸馏水，然后加入0.5 mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH 7.4），移取50 µL铜离子溶液(1 mM)加入比色管内，再用蒸馏水定容到10mL。摇匀，20 min后，用荧光分光光度计（HoribaFluoroMax-4）测定荧光光谱。

如上所述的应用，首先配制探针储备液：称量5 mg的式2加入到比色管中，加入1mL的二氯甲烷，摇匀，使探针溶解，再用无水乙醇定容到10 mL，配制成1 mM的探针储备液。

然后，移取50 µL的探针储备液(1 mM)放进10 mL比色管中，加入4-6mL蒸馏水，然后加入0.5 mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH 7.4），移取50 µL铜离子溶液(1 mM)加入比色管内，再用蒸馏水定容到10mL。摇匀，20 min后，用紫外-可见分光光度计（UV-3101PC）测定吸收光谱。

本发明的铜离子比色荧光探针可与铜离子进行作用，产生荧光光谱和紫外吸收光谱的变化，从而实现对铜离子的定量检测。

具体而言，本发明的铜离子比色荧光探针分别与三价铁离子、钙离子、铝离子、锡离子、锌离子、铬离子、钾离子、镁离子、钠离子、二价铁离子、钴离子及镍离子等其他离子进行作用均不能导致荧光光谱和紫外吸收光谱的明显改变，从而实现对铜离子的选择性识别，进而可任选地用于排除这些三价铁离子、钙离子、铝离子、锡离子、锌离子、铬离子、钾离子、镁离子、钠离子、二价铁离子、钴离子及镍离子的存在对铜离子的定量测定的干扰。

本发明的铜离子比色荧光探针与铜离子反应非常灵敏，从而有利于对铜离子的迅速检测。

可选择地，本发明的铜离子荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

进一步的，本发明的铜离子比色荧光探针是快速高选择性铜离子比色荧光探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。

本发明涉及一种快速高选择性高灵敏铜离子比色荧光探针。具体地，本发明的探针为一类吡啶甲酸酯类化合物，其可作为铜离子比色荧光探针用于铜离子的检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：高选择性地识别铜离子；可以较快的对铜离子实现响应；可以实现对铜离子的高灵敏分析；性质稳定，可以长期保存使用；水溶性特别好；以及具有较强的抗干扰能力。

附图说明

图1a是探针(5 µM)加入Cu²⁺(5 µM)前后的荧光光谱，图1b是探针(5 µM)加入Cu²⁺(5 µM)前后的吸收光谱。

图2不同浓度Cu²⁺ (0-20 µM)对探针(5 µM)荧光光谱的影响。

图3不同离子分析物(5 µM)对探针(5 µM)的荧光强度的影响。

具体实施方式：

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1：制备式5和式8化合物

取式3所示的2-吡啶甲酸1000 mg，溶于15 mL二氯甲烷中，再加入式4所示的对羟基苯甲醛500 mg，二者摩尔比是2:1，在4-二甲氨基吡啶(DMAP) 400 mg和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC) 800 mg的作用下，常温搅拌5h，然后进行抽滤，得到纯品式5。

式3 式4 式5

取式6所示的3-OH-3-CH3-2-丁酮 306 mg溶于吡啶，加2-3滴乙酸，再加入式7所示的丙二腈396 mg，二者的摩尔比为1:2，在25℃油浴中反应24h，然后进行抽滤，得到纯品式8

式6 式7 式8

实施例2

式5 式8 式2

（方案1）将228 mg（1 mmol）式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于15mL无水乙醇中，加入一片哌嗪（86g/mol），再加入199 mg（1 mmol）式8所示的腈，常温搅拌10h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤饼，滤饼为粗产品。如果要得到较纯的产品，可以利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系（例如v/v，90:1）进行提纯得到纯品。得到纯净产品334.6mg，产率为82%。

（方案2）将228 mg（1 mmol）式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于15mL无水乙醇中，加入一片哌嗪（86g/mol），再加入258.7 mg（1.3 mmol）式8所示的腈，常温搅拌10h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤饼，滤饼为粗产品。如果要得到较纯的产品，可以利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系（例如v/v，90:1）进行提纯得到纯品。得到纯净产品379.4mg，产率为93%。

（方案3）将228 mg（1 mmol）式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于15mL无水乙醇中，加入一片哌嗪（86g/mol），再加入298.5 mg（1.5 mmol）式8所示的腈，常温搅拌10h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤饼，滤饼为粗产品。如果要得到较纯的产品，可以利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系（例如v/v，90:1）进行提纯得到纯品。得到纯净产品350.9mg，产率为86%。

（方案4）将228 mg（1 mmol）式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于20mL无水乙醇中，加入一片哌嗪（86g/mol），再加入398 mg（2 mmol）式8所示的腈，常温搅拌10h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤饼，滤饼为粗产品。如果要得到较纯的产品，可以利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系（例如v/v，90:1）进行提纯得到纯品。得到纯净产品363.1mg，产率为89%。

（方案5）将228 mg（1 mmol）式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于15mL无水乙醇中，加入一片哌嗪（86g/mol），再加入258.7 mg（1.3 mmol）式8所示的腈，常温搅拌15h，然后利用高压泵进行抽滤，得到滤饼，滤饼为粗产品。如果要得到较纯的产品，可以利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系（例如v/v，90:1）进行提纯得到纯品。得到纯净产品387.6mg，产率为95%。

本发明的铜离子比色探针的核磁表征（即氢谱、碳谱）数据如下：

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 1.83(s, 6H), 7.21(d, J = 16.0 Hz,1H), 7.50(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.76(t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.98(d, J = 16.0 Hz,1H), 8.06-8.13(m, 3H), 8.27(d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.83(d, J = 4.0 Hz, 1H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 14.68, 23.70, 25.53, 55.23, 99.99, 101.81,116.59, 122.17, 123.39, 123.47, 127.57, 130.41, 131.54, 131.84, 133.65,146.24, 153.61, 155.80, 175.41, 192.49, 194.12。

实施例3

采用方案5的化合物，制备探针。称量5 mg的式2加入到比色管中，加入1mL的二氯甲烷，摇匀，使探针溶解，再用无水乙醇定容到10 mL，配制成1 mM的探针储备液。

将制成的探针用于检测，荧光检测方法为：移取50 µL的探针储备液(1 mM)放进10mL比色管中，加入4-6mL蒸馏水，然后加入0.5 mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH 7.4），移取50 µL铜离子溶液(1 mM)加入比色管内，再用蒸馏水定容到10mL。摇匀，20 min后，用荧光分光光度计（Horiba FluoroMax-4）测定荧光光谱。

吸收光谱检测方法为：移取50 µL的探针储备液(1 mM)放进10 mL比色管中，加入4-6mL蒸馏水，然后加入0.5 mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH 7.4），移取50 µL铜离子溶液(1 mM)加入比色管内，再用蒸馏水定容到10mL。摇匀，20 min后，用紫外-可见分光光度计（UV-3101PC）测定吸收光谱。

检测结果如图1所示。

图1(a) 是探针（5µM）加入Cu²⁺（5 µM）前后的荧光光谱，通过插图我们可以看到荧光变化非常明显。

图1(b) 是探针（5 µM）加入Cu²⁺（5 µM）前后的吸收光谱，通过插图我们可以清楚地吸收光谱的变化，而且通过颜色的变化，可以实现裸眼观察。图中颜色变化为：加入前为黄色，加入后颜色变为粉色。

实施例4

采用方案2的化合物制备的探针。称量5 mg的式2加入到比色管中，加入1mL的二氯甲烷，摇匀，使探针溶解，再用无水乙醇定容到10 mL，配制成1 mM的探针储备液。

进行荧光光谱的检测，具体方法：移取50 µL的探针储备液(1 mM)放进10 mL比色管中，加入4-6mL蒸馏水，然后加入0.5 mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH 7.4），移取5-200 µL铜离子溶液(1 mM)加入比色管内，再用蒸馏水定容到10mL。摇匀，20 min后，用荧光分光光度计（Horiba FluoroMax-4）测定荧光光谱。

结果如图2所示。

图2不同浓度Cu²⁺ (0-20 µM)对探针(5 µM)荧光光谱的影响。探针(5 µM)对不同浓度Cu²⁺ (0-4 µM)的响应满足良好的线性关系。

可以看出，随着探针溶液中Cu²⁺浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且在(0-4 µM)Cu²⁺浓度范围内，探针对Cu²⁺的浓度的响应成线性关系。因此,本发明的探针能较精确地确定待测样本中铜离子的含量。

实施例5

采用方案1的化合物制备探针。称量5 mg的式2加入到比色管中，加入1mL的二氯甲烷，摇匀，使探针溶解，再用无水乙醇定容到10 mL，配制成1 mM的探针储备液。

将制成的探针用来检测，荧光强度检测方法为：移取50 µL的探针储备液(1 mM)放进10 mL比色管中，加入4-6mL蒸馏水，然后加入0.5 mL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH7.4），移取50 µL不同离子分析物储备液(1 mM)加入比色管内，再用蒸馏水定容到10mL。摇匀，20 min后，用荧光分光光度计（Horiba FluoroMax-4）测定荧光光谱。

结果如图3所示。

图3不同离子分析物(5 µM)对探针(5 µM)的荧光强度。所有测定都是20 min后测定，响应时间比较快。

分析物包括：铁离子(Fe³⁺)，钙离子(Ca²⁺)，铝离子(Al³⁺)，锡离子(Sn²⁺)，锌离子(Zn²⁺)，铬离子(Cr³⁺)，钾离子(K⁺)，镁离子(Mg²⁺)，钠离子(Na⁺)，二价铁离子(Fe²⁺)，钴离子(Co²⁺)和镍离子 (Ni²⁺)。它们的浓度均为5 µM。所有测试条件是蒸馏水和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH 7.4）中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25 ℃下分析物加入后20min后测得的。

图3中所示，其中的分析储备液中含有以下的离子。(1) Cu²⁺; (2) Fe³⁺; (3)Ca²⁺,(4) Al³⁺; (5) Sn²⁺; (6) Zn²⁺; (7) Cr³⁺; (8) K⁺; (9) Mg²⁺; (10) Na⁺; (11) Fe²⁺;(12) Co²⁺; (13) Ni²⁺，从图3可以看出，该探针只对铜离子有响应，因此探针具有良好的选择性。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种分析铜离子比色荧光探针，其为吡啶甲酸酯类化合物，其结构如式1所示：

式1

上式中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8为氢原子、碳原子数1-3直链或支链烷基、碳原子数1-3的直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基、羧基。

2.根据权利要求1所述的比色荧光探针，其特征在于，结构如式2所示：

式2。

3.一种权利要求2所述的比色荧光探针的制备方法，其特征在于采用以下步骤：

将式3所示的2-吡啶甲酸溶于二氯甲烷中，再加入式4所示的对羟基苯甲醛，二者摩尔比是2:1，在4-二甲氨基吡啶和N,N'-二环己基碳酰亚胺的催化作用下，常温搅拌5h，然后进行抽滤，得到纯品式5；

式3 式4 式5

将式6所示的3-OH-3-CH3-2-丁酮溶于吡啶，加2-3滴乙酸，再加入式7所示的丙二腈，二者的摩尔比为1:2，在25℃油浴中反应24h，然后进行抽滤，得到纯品式8；

式6 式7 式8

将式5所示的2-吡啶甲酸酯溶于无水乙醇，再加入式8所示的腈，二者的摩尔比是1:1~1:2，在哌嗪的催化作用下，常温搅拌10~15h，然后进行抽滤，得到粗产品式2；

式5 式8 式2。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的粗产品式2利用硅胶柱层析法，将滤饼用二氯甲烷和甲醇的混合体系进行提纯得到纯品。

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