CN107628592A - 一种peg修饰的黑磷量子点及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种PEG修饰的黑磷量子点及其制备方法和应用，制备步骤包括大块黑磷的研磨，加入氢氧化钠用溶剂热法获得黑磷量子点，梯度离心收集黑磷量子点，在黑磷量子点上修饰PEG。本发明的优点在于：制备方法简单可重复，生物相容性好，所制得的黑磷量子点可快速从人体内肾清除代谢出去，另外具有良好的光动力治疗效果，因此，BPQDs可作为生物相容性很强的且无毒副作用的光敏剂，具有良好的生物医学和癌症治疗应用前景。

Description

一种PEG修饰的黑磷量子点及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料制备领域，具体涉及一种PEG修饰的黑磷量子点及其制备方法和应用。

背景技术

光动力疗法（PDT）是治疗各种癌症的新兴临床模式。

PDT是将光敏剂和光组合来选择性地对靶组织造成损伤的治疗方法。光敏剂吸收光，然后将分子氧转化为活性氧（ROS），如羟基（·OH）和单线态氧（¹O₂），起到催化剂的作用。所产生的ROS可以与关键的细胞组分反应，导致细胞死亡，破坏肿瘤。自从基于卟啉衍生物光敏剂的PDT研究被提出之后，人们一直致力研究类似的光敏剂。纳米技术作为PDT中的新兴技术，可以克服常规使用的有机光敏剂的大部分局限性，如循环时间短，水的相容性差和难以官能化的低比表面积。理想化的光敏剂应优先积聚在肿瘤部位，并从正常组织中清除以使治疗的选择性最大化。而纳米颗粒可以通过增强的渗透性和保留作用（EPR）被动富集在肿瘤中，这几乎不能由小的有机物质实现。然而，纳米颗粒也遭受单核吞噬细胞***器官（例如肝脏和/脾脏），通过肝脏***导致其缓慢且无效的清除。肾清除被认为是优异的清除途径，因为与肝胆***相比，其能最小程度地参与细胞内分解代谢，故可以尽量减少纳米颗粒的保留和毒性。然而，由于肾小球毛细血管壁的独特结构，纳米颗粒是否能通过肾脏对颗粒的尺寸有强烈的依赖性。通常，流体动力学直径（HD）小于6 nm的球形纳米粒子容易穿过肾小球毛细管壁。因此，为了最大限度地提高效率和生物安全性，非常希望开发具有快速肾清除率的小尺寸纳米结构光敏剂的治疗方法。

黑色（BP）纳米片是二维（2D）材料系列的新成员，由于其独特的结构和显著的性能，近来引起了人们极大的兴趣。BP纳米片具有非常优秀的电子和光电子性能，如优异的电子迁移率，层数相关的带隙值和高的光响应性，在场效应晶体管光电器件和光催化应用中表现出巨大的潜力。最近，超薄BP纳米片被证明是一种新的可产生单线态氧的无金属半导体，可以进一步应用于PDT。然而，BP纳米片的尺寸通常高达几百纳米，这可能妨碍其作为完整纳米粒子从身体的有效清除。在这里，我们首次证明具有可从肾清除性能的BP量子点（BPQDs）可以作为生物相容性好和高效的PDT光敏剂。BPQDs显示超小的静脉流体动力学直径，静脉注射后可以通过肾清除***。此外，由于其独特的电子结构，BPQDs被发现是一种高效的光敏剂，可以产生单线态氧，在PDT中显示出巨大的应用潜力。

本发明的目的在于针对BP纳米片在光动力治疗中表现的不足，提供了一种PEG修饰的黑磷量子点及其制备方法和应用。因为所制得的PEG修饰的黑磷量子点具有超小的流体动力学直径，静脉注射后可以通过肾清除***，减少了在体内的滞留导致的毒性，并且本身便具有良好的生物相相容性。此外，由于其独特的电子结构，BPQDs被发现是一种高效的光敏剂，产生的单线态氧，在PDT中显示出巨大的应用潜力。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种PEG修饰的黑磷量子点的制备方法：使用研钵将大块的黑磷研磨成BP粉末，肉眼看不到大的黑磷片即可；然后将40 mg BP粉末、20 mg NaOH与30 mL N-甲基吡咯烷酮搅拌混合，将该混合物搅拌加热至150℃，反应8小时；将所得溶液以3000 rpm离心10分钟除去大的未反应完全的黑磷；再以30000 rpm离心20分钟收集BPQDs产物；产物经去离子水洗涤数次后，将产物分散在去离子水中；最后，将获得的BPQDs和10 mg NH₂-PEG1000超声处理6小时以获得水溶性PEG修饰的BPQD。

一种如上所述的制备方法制得的PEG修饰的黑磷量子点：BPQDs的动力学流体直径为3.3 ± 0.6 nm，PEG修饰的BPQDs的动力学流体直径为5.4 ±0.6 nm，颜色皆为棕色。

一种如上所述的黑磷量子点在光动力治疗中的应用，是一种高效的光敏剂。

本发明的有益效果在于：

1）溶剂热法制备黑磷量子点比起机械剥离法，方法更加便捷简单，产物形貌粒径可控，并且机械剥离法很难剥离出量子点；比起超声辅助液相剥离法，效率更高，产率也更高；所用的溶剂N-甲基吡咯烷酮，可以隔水隔氧，起到防止黑磷量子点被氧化的作用；

2）合成后的BPQDs@PEG具有超小尺寸，在生物培养基中表现出良好的稳定性，PEG修饰后无明显毒性。在光照射下，BPQDs@PEG可以有效地产生活性氧。体外和体内研究都证实，BPQD@PEGs通过光动力学效应显示出优异的抗肿瘤效率。此外，BPQDs@PEG由于其流体动力学直径小于6nm，可以通过肾清除从体内快速排出体外；这种生物相容性极好的BPQDs@PEG在生物医学应用，特别是癌症治疗具有巨大的应用前景。

附图说明

图1a为实施例1制得的黑磷量子点的透射电镜显微镜图（TEM），其中，图1a右上角的插图为制备的黑磷量子点样品图（分散在N-甲基吡咯烷酮中）；

图1b实施例1制得的黑磷量子点的高分辨透射电子显微镜图(HRTEM)，显示的0.16nm和0.22nm的晶格间距分别对应于BP的褶皱结构的x和z方向；

图2为大块黑磷和黑磷量子点的拉曼光谱，该图表明与大块黑磷相比，黑磷量子点的A_1g，B_2g和A_2g声子模式的三个BPQDs峰都略微偏移到高波数，证明BPQDs的成功合成；

图3为黑磷量子点BPQDs和BPQDs@PEG的电势图；BPQDs为负电荷，电位为-26.8±4.5mV；表面修饰PEG后，该值增加至-3.8±1.1mV，证明了PEG的成功修饰；

图4为BPQDs@PEG的动态光散射（DLS）分析，显示PEG修饰BPQD的流体动力学直径（HD）约为5.4 ± 0.6 nm；

图5为实施例1制得的黑磷量子点的紫外可见吸收光谱；

图6为在2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）作为¹O₂捕获剂存在下，BPQDs的ESR光谱；该图清楚地显示TEMPO的典型1:1:1三线态信号，信号强度随着照射时间的增加而增加，证实在光照射下BPQD会产生¹O₂；

图7为实施例3操作，用BPQDs培养24h后，Hela细胞的活力图；

图8为用不同浓度的BPQDs孵育4h后，在相同的照射时间（160 mW cm^-2，10 min）下用CCK8法测得的Hela细胞活力图；

图9为Hela细胞与1.6μg/mL的BPQDs共孵育4h后，在不同功率密度的16分钟照射下用CCK8法测得的Hela细胞活力图；

图10为Hela细胞与1.6mg/mL的BPQDs共孵育4h后，在不同照射时间（功率密度为160 mWcm^-2）下，用CCK8法测得的Hela细胞活力图；

图11为实施例8操作后，通过在给药后不同时间点（n=5）测量得到尿液中的P含量来确定BPQDs@PEG的累积清除率曲线图；

图12为经过实施例6所示处理后负荷肿瘤的裸鼠的代表性照片； 照片分别在第0天和第16天收集；

图13为图12中对应的肿瘤生长曲线；

图14为这期间小鼠体重的变化曲线；

图15为实施例7操作后得到的H＆E染色肿瘤切片的组织学图像。

具体实施方式

本发明结合具体实施例参见附图进一步说明如下，然而，这些实施例不应视为是对本发明范围的限制。

实施例1

制备粒径为3.3 ± 0.6 nm的黑磷量子点和动力学流体直径约为5.4 ± 0.6 nm的BP@PEG，包括以下步骤：

1）研磨原料：使用研钵将大块BP研磨成BP粉末；

2）溶剂热法制备黑鳞纳米材料：将40 mg BP粉末，20 mg NaOH与30 mL N-甲基吡咯烷酮搅拌混合，将该混合物加热至150℃，搅拌8小时；

3）离心获得量子点：通过离心（3000 rpm，10分钟）除去大块未反应的BP后，再离心（30000 rpm，20分钟）进一步收集BPQDs产物，然后用去离子水洗涤数次后，将产物分散在去离子水中；

4）制备BP@PEG：将步骤3）制备获得的BPQDs和10 mg NH₂-PEG1000超声处理6小时以获得水溶性PEG修饰的BPQDs。

实施例2

本实施例用于说明黑鳞量子点在670 nm的激光照射下单线态氧的产生情况。

用1,3-二苯基苯并呋喃进行BPQDs在近红外光光照下产生ROS的检测。首先，往2mL 1,3-二苯基苯并呋喃（11μg/mL）中，加入20μL BPQDs（含P元素16μg/mL，数值通过ICP-MS测定）。将混合物保持在黑暗中30分钟后，使用LED灯（670nm）作为光源，在不同时间用UV-vis紫外可见光光谱仪测量样品的吸收光谱。用浓度为40μg/mL的NaN₃作为ROS的清除剂，同样测试一遍作为对照。

实施例3

本实施例用于说明黑鳞量子点的生物相容性。

使用标准MTT测定法测量细胞毒性。将HeLa细胞在具有5%CO2的37℃的细胞专用孵箱中用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。通常，将HeLa细胞接种在96孔板中，然后在37℃的5%CO₂气氛的细胞专用孵箱中，用不同P浓度（用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释）的100μL BPQDs孵育24小时。然后除去旧培养基，每孔充满100μL含有0.5mg mL^-1 MTT的新培养基，并将板在37℃下孵育4小时。弃去培养基，每孔加入200μL DMSO。接着用SH-1000实验室酶标仪测定各孔的OD490值(Abs)。通过减去空白组的实验组的OD490值计算细胞活力。

实施例4

本实施例用于说明Hela细胞中的黑鳞量子点在670 nm的激光照射下单线态氧的产生情况。

用DCFH-DA作为细胞内ROS产生检测的探针。首先，将HeLa细胞与1.6μg/mL的BPQDs在37℃下于96孔板中孵育12小时。然后，将10 mM DCFH-DA加入到细胞培养基中孵育30分钟后，使用LED灯（670nm，120 mW cm^-2）作为光源照射96孔板20分钟。最后，通过尼康A1共焦激光扫描显微镜对孔板进行成像。

实施例5

本实施例用于说明BP@PEG在体外细胞中的光动力治疗效果。

首先将HeLa细胞与将实施例1中制备的BPQDs@PEG在37℃下孵育4小时。 在不同浓度处理之后，使用如上所述的标准MTT测定来评估细胞活力。为了进一步说明治疗效果对细胞活力成像，具体步骤如下：将细胞与钙黄绿AM和碘化丙啶（PI）共染色，然后通过NikonEclipse Ti-S倒置显微镜成像。通过从三个独立实验的荧光图像中计数1000个点（红色或绿色），其中细胞活力=绿点数/红点数来计算细胞活力。

实施例6

本实施例用于说明BPQDs@PEG在活体小鼠的光动力治疗效果。

动物实验按照福州大学机构动物保护使用委员会批准的方案执行。

1）BALB/c裸鼠（体重≈25 g）得自上海实验动物实验动物有限公司。通过皮下注射100μL内含2×10⁶个S180细胞的PBS悬液至背部的后腿。

2）体内肿瘤治疗：静脉注射BPQDs（5 mg/kg剂量）给小鼠，然后用670 nm光（160mW/cm²）照射肿瘤部位20分钟（BPQD +光照组，5只小鼠）。将其他三组（每组5只小鼠）作为对照：无任何治疗的小鼠（空白组），仅注射BPQDs小鼠（仅限BPQDs组），小鼠用光照射（仅光照组）。肿瘤大小和体重变化是每两天一次的治疗后进行监测。根据肿瘤体积=（肿瘤长度）×（肿瘤宽度）²/ 2计算肿瘤体积。相对肿瘤体积计算为V/V₀，其中V是治疗后计算的肿瘤体积，而V₀是治疗前的初始肿瘤体积。

实施例7

本实施例用于说明用BPQDs@PEG治疗前后小鼠的组织学和免疫化学组织情况。经过实施例6的各种处理后，处死接了瘤的小鼠，收集肿瘤进行分析。经过实施例6的给药处理2天后，处死各组小鼠，收集肿瘤进行分析。处理16天后，处死BPQD +光照组小鼠，收集主要器官。制备组织切片，然后按照标准方案用苏木精和伊红（H＆E）染色。

实施例8

检测实施例6中小鼠尾静脉注射BPQDs@PEG后体内BPQDs@PEG的***。以30 mg/kg (n =5)的剂量静脉内注射BPQDs。在不同的时间点，通过温和的腹压从小鼠收集尿液，并通过ICP-MS测量尿中的P含量。5只未注射BPQDs的小鼠用于测定尿中P的背景浓度。

以上结合具体实施例解释为对本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种PEG修饰的黑磷量子点的制备方法，其特征在于：使用研钵将大块的黑磷研磨成BP粉末；然后将40 mg BP粉末、20 mg NaOH与30 mL N-甲基吡咯烷酮搅拌混合，将该混合物搅拌加热至150℃，反应8小时；将所得溶液以3000 rpm离心10分钟以除去粒径大的未反应完全的BP；然后以30000 rpm再离心20分钟收集黑磷量子点产物；产物经去离子水洗涤数次后，将产物分散在去离子水中；最后，将获得的BPQDs和10 mg NH₂-PEG1000超声处理6小时以获得水溶性PEG修饰的BPQDs。

2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的PEG修饰的黑磷量子点，其特征在于：动力学流体直径为5.4 ±0.6 nm，颜色为棕色。

3.一种如权利要求2所述的PEG修饰的黑磷量子点在制备光敏剂中的应用。